專利名稱：人間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療m3型白血病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療M3型白血病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
急性白血病是由于病理的白細(xì)胞失去進(jìn)一步分化成熟的能力而停滯在幼稚期的不同階段。急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL) M3的白細(xì)胞分化阻滯于異常的早幼粒細(xì)胞階段，是目前臨床上唯一進(jìn)行誘導(dǎo)分化治療的白血病。使用全反式維甲酸(ATRA)單獨(dú)或者與化學(xué)藥物聯(lián)合治療可以獲得高達(dá)909^95%的完全緩解率，但是存在可能有致死風(fēng)險(xiǎn)的毒副反應(yīng)如維甲酸綜合癥，它可能引起患者出現(xiàn)高白細(xì)胞，不明原因發(fā)熱，呼吸窘迫，間質(zhì)性肺炎，胸腔或心包積液，間歇性低血壓和急性腎功能衰竭。而 且，持續(xù)性的ATRA單藥治療M3型白血病將導(dǎo)致進(jìn)行性獲得性耐藥，通常在3 6月內(nèi)幾乎所有的病人均出現(xiàn)復(fù)發(fā)。獲得性耐藥的一個(gè)可能的原因便是由于反復(fù)給藥導(dǎo)致藥物清除加快從而使ATRA的血漿濃度低于有效治療濃度。要解決上述問題，可能的策略是尋找其他具有誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化能力的藥物或藥用組合物，單用或與ATRA聯(lián)合誘導(dǎo)，在不降低療效的基礎(chǔ)上減弱ATRA單獨(dú)應(yīng)用所帶來的問題。有不少研究報(bào)道了間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSC)在體內(nèi)外均可促進(jìn)正常造血干細(xì)胞向髓系和淋系分化。起初，有研究發(fā)現(xiàn)小鼠間充質(zhì)細(xì)胞系MS-5和S17均可促進(jìn)人臍血來源的造血干祖細(xì)胞向B淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞分化。隨后，人骨髓MSC被證實(shí)可以在體內(nèi)外促進(jìn)造血干祖細(xì)胞巨核細(xì)胞形成。最近研究顯示人MSC可以促進(jìn)骨髓和臍帶血來源的造血干祖細(xì)胞向髓系和淋系細(xì)胞分化。不過尚未有研究顯示MSC能夠促進(jìn)白血病細(xì)胞分化。非人類來源的MSC由于生物學(xué)和倫理學(xué)上存在的種種問題，不宜用于人類疾病的治療。人骨髓來源的MSC可以分離和較大規(guī)模制備獲取，在產(chǎn)業(yè)上具備使用的可能。臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, UC-MSC)是正常妊娠分娩過程的副產(chǎn)品，可用酶消化法等多種成熟手段非常容易地從新生兒臍帶組織中獲取，生物學(xué)特性與其他來源的間充質(zhì)干細(xì)胞基本一致，由于其來源的廣泛性、取材的無創(chuàng)性和簡易性、感染的低發(fā)生率和良好的體外擴(kuò)增能力，在產(chǎn)業(yè)上具有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的誘導(dǎo)分化藥物在治療M3型白血病中所存在的復(fù)發(fā)率高、毒副反應(yīng)嚴(yán)重、聯(lián)合用藥成本高等缺陷，本發(fā)明通過研究證明MSC可以促進(jìn)急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞向粒系成熟分化，和ATRA同時(shí)應(yīng)用時(shí)其促分化作用有聯(lián)合增強(qiáng)，并在此基礎(chǔ)上提供了一種將人間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于制備治療M3型白血病的藥物的技術(shù)方案。本發(fā)明所述的人間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療M3型白血病藥物中的應(yīng)用，其中人間充質(zhì)干細(xì)胞可以單獨(dú)應(yīng)用，也可以與全反式維甲酸(ATRA)聯(lián)合應(yīng)用。
本發(fā)明所述的人間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療M3型白血病藥物中的應(yīng)用，其中人間充質(zhì)干細(xì)胞可以用組織塊酶消化法從新生兒臍帶胎盤當(dāng)中獲得。本發(fā)明所述的人間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療M3型白血病藥物中的應(yīng)用，解決了單獨(dú)使用全反式維甲酸(ATRA)所可能造成的獲得性耐藥問題、提高了 M3白血病誘導(dǎo)分化的效率，減少了可能存在的不良反應(yīng)。本發(fā)明所述的人間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療M3型白血病藥物中的應(yīng)用，其中所述人間充質(zhì)干細(xì)胞的來源不僅僅限于廢棄的新生兒臍帶胎盤組織，目前隨著相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)的發(fā)展，成年人的骨髓、脂肪、子宮內(nèi)膜等組織中均可獲得充足的人間充質(zhì)干細(xì)胞，并且已有大量獲取此類來源的間充質(zhì)干細(xì)胞并儲(chǔ)存用于建立成體間充質(zhì)干細(xì)胞庫的實(shí)例。以此為基礎(chǔ)，可知上述來源的人間充質(zhì)干細(xì)胞均可應(yīng)用于本發(fā)明的技術(shù)方案中。本發(fā)明所述的人間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療M3型白血病藥物中的應(yīng)用，其中人間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)際應(yīng)用方式，應(yīng)當(dāng)是以靜脈注射的手段，單獨(dú)或與其他促分化藥物聯(lián)合應(yīng) 用。雖然本發(fā)明中的實(shí)施方式不包括對(duì)M3白血病患者使用人間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行治療的實(shí)際用量，但通過現(xiàn)有技術(shù)所公開的大量間充質(zhì)干細(xì)胞臨床治療損傷及免疫性疾病的實(shí)例來看，本發(fā)明中所使用的間充質(zhì)干細(xì)胞用量可以參考已公開的其他疾病治療中的用量，為(0. 5 5) X106/kg。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明所公開的人間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療M3型白血病藥物中的應(yīng)用，為該類白血病的治療藥物開發(fā)提供了低成本、低不良反應(yīng)且效果更佳的技術(shù)手段。


圖I是形態(tài)學(xué)和NBT還原試驗(yàn)顯示UC-MSC誘導(dǎo)NB4細(xì)胞向粒系分化并和ATRA同時(shí)使用有誘導(dǎo)作用聯(lián)合增強(qiáng)。圖2是細(xì)胞表面分化抗原的調(diào)控顯示UC-MSC誘導(dǎo)NB4細(xì)胞向粒系分化而非向單核細(xì)胞分化，并和小劑量ATRA同時(shí)使用有誘導(dǎo)作用聯(lián)合增強(qiáng)。圖3是UC-MSC促進(jìn)NB4細(xì)胞分化的同時(shí)伴隨著細(xì)胞G0/G1期周期阻滯。圖4是UC-MSC誘導(dǎo)APL患者來源的白血病細(xì)胞向粒系分化。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明I.利用酶消化法消化足月妊娠剖宮產(chǎn)健康新生兒的臍帶，通過貼壁法取得原代培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清，10_8M地塞米松，10ng/ml EGF (peprotech公司，美國)，2ng/ml bFGF (peprotech公司,美國),100 V- g/ml鏈霉素和100U/ml青霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)，置37°C，5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱中，細(xì)胞長至80-90%融合后消化傳代，取P4 P6代的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用。人APL細(xì)胞系NB4細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室液氮凍存，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、IOOii g/ml鏈霉素和100U/ml青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)，置37°C、5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)，每2 3天傳代I次。在6孔板內(nèi)建立NB4細(xì)胞與UC-MSC共培養(yǎng)體系，設(shè)立4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，即NB4對(duì)照組，UC-MSC處理組，ATRA處理組和UC-MSC/ATRA聯(lián)合處理組。UC-MSC提前接種于6孔板內(nèi)，5 X IO5/孔，置于37°C，5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，達(dá)到80 90%融合后，銫源30Gy照射終止細(xì)胞增殖。NB4細(xì)胞起始濃度105/ml接種，4ml/孔。培養(yǎng)一定時(shí)間后，收集白血病細(xì)胞時(shí)輕輕反復(fù)吹打，避免破壞下層的UC-MSC細(xì)胞層。通過細(xì)胞形態(tài),硝基四唑氮藍(lán)還原試驗(yàn)(nitroblue tetrozoliumreduction test，NBT試驗(yàn))，細(xì)胞表面髓系分化標(biāo)志⑶IIb和⑶14的檢測(cè)評(píng)價(jià)白血病細(xì)胞的分化狀態(tài)。我們發(fā)現(xiàn)UC-MSC可以促進(jìn)NB4細(xì)胞向粒系終末分化成熟同時(shí)可以導(dǎo)致NB4細(xì)胞周期G0/G1期阻滯，而且和小劑量的ATRA (10 nM)聯(lián)合使用時(shí)，促分化作用有累加效應(yīng)。具體為(I) NB4細(xì)胞在UC-MSC或/和10 nM ATRA處理培養(yǎng)72小時(shí)后收集細(xì)胞，經(jīng)甩片機(jī)(Cytospin4，山東)將細(xì)胞甩至載玻片上，瑞氏吉姆薩染色30分鐘后顯微鏡下觀察各組NB4細(xì)胞形態(tài)。如圖I中的A所示，NB4對(duì)照組細(xì)胞呈典型原始細(xì)胞形態(tài)，胞體較大，胞漿深藍(lán)染，細(xì)胞核核大且圓，核漿比較大，染色質(zhì)疏松，可見較大的核仁；UC-MSC共培養(yǎng)以后 的細(xì)胞形態(tài)上有分化的跡象，細(xì)胞體積較前變小，細(xì)胞核變小，核漿比變大，核染色質(zhì)較前濃聚，胞核開始出現(xiàn)凹陷，出現(xiàn)形態(tài)上類似于中幼粒和晚幼粒的細(xì)胞；ATRA處理組細(xì)胞較UC-MSC處理組形態(tài)上出現(xiàn)更多的晚幼粒；UC-MSC/ATRA聯(lián)合處理組細(xì)胞形態(tài)上較ATRA處理組分化更為明顯，出現(xiàn)更多愈加成熟的桿狀核，偶可見分葉核粒細(xì)胞。(2)中性粒細(xì)胞成熟過程中伴隨細(xì)胞內(nèi)的活性氧(reactive oxygenspecies, R0S)生成增多。在ROS形成過程中脫下的氫可以被硝基四唑氮藍(lán)接受而使其還原為藍(lán)紫色物質(zhì)沉淀于胞漿內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)中，在共培養(yǎng)24小時(shí)，48小時(shí)和72小時(shí)后，分別收集各組NB4細(xì)胞，進(jìn)行NBT試驗(yàn)衡量胞內(nèi)活性氧形成，即細(xì)胞經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后重懸于0. 1%的NBT (Sigma公司，美國)，加入400ng/ml佛波酯(Sigma公司，美國)，37°C水浴I小時(shí)。經(jīng)甩片機(jī)將細(xì)胞甩至載玻片上，番紅0 (Sigma公司，美國)染色后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并計(jì)數(shù)400個(gè)細(xì)胞得到NBT反應(yīng)陽性細(xì)胞的比率，從而判斷粒細(xì)胞的分化狀態(tài)，如圖I中的B所示，UC-MSC和ATRA分別作用后的NB4細(xì)胞NBT試驗(yàn)陽性的細(xì)胞比例明顯上調(diào)，呈時(shí)間依賴性，且UC-MSC/ATRA聯(lián)合作用后進(jìn)一步上調(diào)，作用有累加效應(yīng)。(3)關(guān)于細(xì)胞表面分化抗原表達(dá)的檢測(cè)，CDllb為髓系分化標(biāo)志，當(dāng)細(xì)胞向粒細(xì)胞分化和向單核細(xì)胞分化時(shí)，均出現(xiàn)陽性率增強(qiáng)，在原始粒細(xì)胞和早幼粒細(xì)胞表面幾乎不表達(dá)，從中幼粒細(xì)胞開始，陽性率逐漸增強(qiáng)；CD14為單核細(xì)胞分化標(biāo)志。既往有研究顯示，在不同的誘導(dǎo)分化劑作用下，NB4細(xì)胞可以向粒系和單核系兩個(gè)方向分化，因此我們用流式細(xì)胞術(shù)同時(shí)檢測(cè)CDllb和CD14的表達(dá)來判斷細(xì)胞分化的方向。于培養(yǎng)的24小時(shí)，48小時(shí)，72小時(shí)收集細(xì)胞，PBS洗漆后分別加入藻紅蛋白(phycoerythrin, PE)標(biāo)記的小鼠抗人⑶Ilb單克隆抗體(BD公司，美國)或⑶14單克隆抗體(BD公司，美國)以及相應(yīng)的PE-小鼠I gGI同型對(duì)照抗體(BD公司，美國)5 u 1,4° C避光孵育40min后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)⑶Ilb和⑶14的陽性率。如圖2-左側(cè)所示，UC-MSC和ATRA分別上調(diào)細(xì)胞表面⑶Ilb的表達(dá)，且同時(shí)應(yīng)用時(shí)作用聯(lián)合增強(qiáng)，該上調(diào)作用呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。對(duì)照組NB4細(xì)胞陽性率基礎(chǔ)值為
4.35±2. 29%，UC-MSC、ATRA 和 UC-MSC/ATRA 聯(lián)合作用 24 小時(shí)陽性率分別為 18. 37±2. 53%,26. 6 ±5. 37% 和 46. 6 ±6. 09% ；48 小時(shí)分別為 30. 7±1. 97%, 38. 0±8. 67% 和 65. 5 ±9. 02% ；72小時(shí)分別為39. 83±2. 53%,63. 33±14. 59%和88. 7±7. 27%。而對(duì)于CD14的檢測(cè)如圖2-右側(cè)所示，其呈持續(xù)低水平表達(dá)，且各組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。據(jù)此我們認(rèn)為，UC-MSC誘導(dǎo)NB4細(xì)胞向粒系分化成熟，而非向單核細(xì)胞分化。
(4)于培養(yǎng)的48小時(shí)收集各組細(xì)胞碘化丙唳(propidium iodide, PI) (sigma公司，美國)摻入法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布。具體為各組NB4細(xì)胞用70%冷乙醇固定24小時(shí)，PBS洗滌后，加入5ul終濃度50ug/ml RNAase (Sigma公司，美國)，37°C孵育30分鐘后，PBS洗去RNAase。再加入50ug/ml PI 500ul，室溫避光孵育5分鐘后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。如圖3所示，UC-MSC和ATRA分別對(duì)NB4細(xì)胞產(chǎn)生G0/G1期周期阻滯，兩者聯(lián)用，效果更為明顯。G0/G1期阻滯的同時(shí)，伴有S期細(xì)胞比例的相應(yīng)下調(diào)，而G2/M期比例沒有明顯變化趨勢(shì)。2.經(jīng)知情同意后，采集APL患者骨髓液5ml。患者符合FAB診斷標(biāo)準(zhǔn)，且形態(tài)學(xué)證實(shí)白血病細(xì)胞比例在95%以上。采用淋巴細(xì)胞分離液分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞。在6孔板內(nèi)建立白血病細(xì)胞與UC-MSC共培養(yǎng)體系，設(shè)立4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，即白血病細(xì)胞對(duì)照組，UC-MSC處理組，ATRA處理組和UC-MSC/ATRA聯(lián)合處理組。UC-MSC提前接種于6孔板內(nèi)，5 X IO5/孔，置于37°C，5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，達(dá)到80% 90%融合后，銫源30Gy照射終止細(xì)胞增殖。白血病細(xì)胞起始濃度105/ml，4ml/孔接種于6孔板，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 u g/ml鏈霉素和100U/ml青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)48小時(shí)后，收集白血病細(xì)胞時(shí)輕 輕反復(fù)吹打，避免破壞下層的UC-MSC細(xì)胞層。通過檢測(cè)白細(xì)胞表面分化抗原CDllb，我們證明UC-MSC同樣可以促進(jìn)急性早幼粒細(xì)胞白血病患者的白血病細(xì)胞向粒系終末分化，且和小劑量的ATRA (IOnM)聯(lián)合使用時(shí)，促分化作用有累加效應(yīng)。如圖4所示，白血病細(xì)胞CDllb基礎(chǔ)表達(dá)率為13. 1%，UC-MSC和ATRA分別可以引起CDllb陽性率上調(diào)至61. 4%和88. 8%, UC-MSC/ATRA聯(lián)合使用，陽性率進(jìn)一步上調(diào)至95. 1%。⑶14表達(dá)的檢測(cè)顯示⑶14陽性率始終低于3%。據(jù)此，我們可以斷定UC-MSC可以誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞向粒系分化。綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實(shí)施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識(shí)之士可以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實(shí)施例，但這種實(shí)施例都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種人間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療M3型白血病藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療M3型白血病藥物中的應(yīng)用，其特征在于，人間充質(zhì)干細(xì)胞與誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化的藥物聯(lián)合應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療M3型白血病藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化的藥物是全反式維甲酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的人間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療M3型白血病藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述人間充質(zhì)干細(xì)胞是用組織酶消化法從廢棄的新生兒臍帶胎盤組織當(dāng)中獲得。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的人間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療M3型白血病藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述人間充質(zhì)干細(xì)胞從人骨髓細(xì)胞中分離獲得。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的人間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療M3型白血病藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述人間充質(zhì)干細(xì)胞從人脂肪或子宮內(nèi)膜組織中分離獲得。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的人間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療M3型白血病藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述人間充質(zhì)干細(xì)胞藥物采用靜脈注射方式。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的人間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療M3型白血病藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述靜脈注射的用量為(O. 5^5) XlO6Ag0
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療M3型白血病藥物中的應(yīng)用。其中能夠促使M3型白血病細(xì)胞向成熟粒細(xì)胞分化的人間充質(zhì)干細(xì)胞可以單獨(dú)應(yīng)用，也可以與全反式維甲酸ATRA聯(lián)合應(yīng)用。本發(fā)明所公開的人間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療M3型白血病藥物中的應(yīng)用，為該類白血病的治療藥物開發(fā)提供了低成本、低不良反應(yīng)且效果更佳的技術(shù)手段。
文檔編號(hào)A61K35/28GK102793722SQ201210310410
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月28日
發(fā)明者韓忠朝, 陳芳 申請(qǐng)人:天津昂賽細(xì)胞基因工程有限公司