專利名稱：奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎滅活疫苗及其制備方法，特別是一種 含奶牛5、8、336型金黃色葡萄球菌乳房炎滅活全菌、滅活全菌+莢膜多糖、莢膜多糖結(jié)合蛋 白疫苗及其制備方法，用于金黃色葡萄球菌感染性奶牛乳房炎的免疫預(yù)防。屬于生物制藥 領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
奶牛乳房炎(Bovine Mastitis)是危害畜牧業(yè)、食品安全、人類健康的重大傳染 病，特別是近年環(huán)境改變、抗生素濫用耐藥，超級細菌出現(xiàn)，細菌感染性奶牛乳房炎發(fā)病率 和死亡率逐年攀升，它嚴(yán)重危害畜牧業(yè)發(fā)展、食品安全和人類健康，由此再次敲響警鐘，奶 牛乳房炎已成為國計民生的頭等大事，疫苗防控勢在必行。據(jù)國際奶牛聯(lián)合會報告，全球有2. 2億頭奶牛，因理化所致奶牛乳房炎發(fā)病率明 顯下降，而微生物感染奶牛乳房炎呈顯著上升，其發(fā)病率高達60%以上。引發(fā)奶牛乳房炎的 病原達140余種，主要是細菌類占主流，其中金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌)、鏈球菌和大腸 桿菌感染占90%以上，且可多種病原菌共同或單獨引起。據(jù)臨床流行病學(xué)資料顯示，我國 奶牛乳房炎以金葡菌、鏈球菌和大腸桿菌病原菌為主，占91. 6%，其中金黃色葡萄球菌高達 46%，且以5、8、336型金葡菌為主，與當(dāng)前國際報道感染菌種、血清型及流行趨勢一致。奶 牛乳房炎不但影響奶牛生活質(zhì)量和產(chǎn)量，而且經(jīng)濟損失也明顯突出，如發(fā)達美國每年達30 億美元、英國4億美元，我國35億元以上，尤其是奶制品及肉食品抗菌素及細菌產(chǎn)物嚴(yán)重超 標(biāo)，已嚴(yán)重危害畜牧業(yè)發(fā)展、人類生活和健康的社會現(xiàn)實問題。目前奶牛乳房炎治療是抗生素為首選，但大量抗生素造成耐藥，而得不到有效控 制。人們最大愿望就是通過接種疫苗有效控制奶牛乳房炎，其目的就是增強機體免疫應(yīng)答 反應(yīng)，特別是乳腺組織的免疫應(yīng)答反應(yīng)來阻止、中和、殺滅外界進入的病原微生物，但由于 乳房本身的生理特點給有效免疫力的產(chǎn)生帶來了了一系列特殊的挑戰(zhàn)。第一，乳房炎是乳 腺組織的炎癥，然而免疫應(yīng)答增強在奶?；既榉垦椎那闆r下并不總是有益的。免疫反應(yīng)的 一個重要組成部分是大量的嗜中性粒白細胞從血液遷移到感染的乳腺來發(fā)揮作用。在實際 生產(chǎn)中，牛奶中出現(xiàn)大量體細胞并不認(rèn)為是好事，因為體細胞數(shù)量增加說明奶牛已患乳房 炎，并且此時牛奶品質(zhì)、產(chǎn)量會明顯下降。第二，乳腺中的牛奶會稀釋抗感染的嗜中性粒細 胞的濃度，而且牛奶中的一些成分，像脂肪和酪蛋白能降低抗感染嗜中性粒細胞的殺菌能 力。第三，奶牛飼養(yǎng)有大量可引起乳房炎的微生物的環(huán)境中，而且奶汁本身給病原菌生長提 供了溫床。因此，使奶牛乳腺產(chǎn)生有效的免疫力，降低乳房炎的發(fā)生率，需要攻克的難題較 多，給奶牛乳房炎疫苗研發(fā)提出比其它傳染病疫苗更高的要求。細菌性奶牛乳房炎菌多而復(fù)雜，且與宿主交互作用免疫應(yīng)答及免疫保護復(fù)雜性， 以及疫苗佐劑在疫苗中發(fā)揮的重要作用更佳凸現(xiàn)，它決定免疫走向及免疫應(yīng)答特征，已成 為奶牛乳房炎疫苗研發(fā)的重要領(lǐng)域。目前動物疫苗使用的為白花油佐劑，能產(chǎn)生高滴度血 清抗體，但沒有黏膜和細胞免疫應(yīng)答，尤其是動物反應(yīng)和副作用大，而影響奶牛的奶產(chǎn)量及生活質(zhì)量。近些年，以色列Gabriel Leitner等研制的奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌苗 "MASTIVACS I”，曾與FIA(freund' s incomplete adjuvant)和 ISA206(vaccine adjuvant for w/o/w emusion basedonmineral oil)佐劑效果比較，發(fā)現(xiàn)FIA對小鼠的刺激性較大， 認(rèn)為ISA206佐劑比較適合。我國羅金印等曾研制的氫氧化鋁佐劑滅活苗、靳亞平等研制的 葡聚糖、油佐劑和弗氏不完全佐劑(FIA)奶牛乳房炎疫苗結(jié)果表明，3種以FIA佐劑效果最 好，但存在副作用大。本發(fā)明者采用SPOl佐劑(角鯊烯、聚氧乙烯蓖麻油和聚醚水包油佐 劑)、SP02佐劑(角鯊烯、聚氧乙烯蓖麻油和聚醚水包油佐劑并加入重組細菌鞭毛)作為奶 牛乳房炎滅活疫苗佐劑。結(jié)果顯示SP01、SP02佐劑具有全面免疫應(yīng)答效果，且副作用明顯 低于白花油、FIA和鋁鹽佐劑，成為新一代有發(fā)展前途的疫苗新佐劑。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是最常見奶牛乳房炎的病原菌之一， 其致病復(fù)雜與其莢膜多糖(Capsular polysaccharides, CPs)、外毒素和黏附素等緊密相 關(guān)，對奶牛危害最大，是最頑固的一種乳腺炎病原菌。大部分金葡菌的感染會造成隱性乳 腺炎，持續(xù)時間長，繼而轉(zhuǎn)變成慢性感染，主要的經(jīng)濟損失來自牛奶產(chǎn)量下降及牛奶品質(zhì)降 低。疫苗是通過增強機體免疫系統(tǒng)的功能從而使機體獲得抗病能力，因此研制安全、有效的 奶牛金葡菌乳腺炎疫苗成為防控乳腺炎的必由選擇。奶牛金黃色葡萄球菌主要有5、8、336、 化膿金葡菌、肺炎金葡菌等，其中5、8和336型占金葡菌感染的95%以上。針對奶牛5、8和 336型金葡菌乳房炎三價滅活全菌疫苗，已在美國及一些歐洲國家上市，從臨床觀察商品化 滅活全菌疫苗保護效果不全面，普遍認(rèn)為疫苗防止繼發(fā)感染的能力有限，但能提高乳腺炎 的自愈率。商品化金葡菌滅活全菌疫苗對一些金葡菌污染嚴(yán)重的牛場非常有效，但對于大 多數(shù)能成功控制金葡菌性乳腺炎的牛場來說，效果不明顯。國內(nèi)至今沒有批準(zhǔn)奶牛金葡菌 乳房炎疫苗上市或成功的報道。從已有的奶牛金葡菌乳房炎疫苗使用結(jié)果看，滅活全菌體 疫苗保護效果不全面，這與沒有足夠莢膜多糖保護性抗原有關(guān)，且使用白花油佐劑副作用 大而影響疫苗整體效果，因此迫切需要改變思路發(fā)展新型疫苗。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明目的在于公開一種奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎滅活疫苗及其制備方法，， 包括單價、二價、三價或多價滅活(5、8、336等血清型不同菌株的全菌、全菌+莢膜多糖、莢 膜多糖結(jié)合蛋白)疫苗；本發(fā)明目的還在于公開該疫苗的制備方法；本發(fā)明的目的還在于 公開該疫苗可安全、穩(wěn)定、全面有效預(yù)防金黃色葡萄球菌感染奶牛乳房炎的發(fā)生。本發(fā)明目的是通過如下方案及制備方法實現(xiàn)的1、通過對我國內(nèi)蒙古、重慶、廣州、黑龍江、蘭州、河北、山東等東西南北中30個省 市90個中大型奶牛場、近3萬頭奶牛乳腺炎奶汁樣品，分離、鑒定、確定我國奶牛金黃色葡 萄球菌流行優(yōu)勢株為5、8、336血清型；制備了 5、8、336血清型優(yōu)勢流行菌株兔血清，與已有 國內(nèi)外臨床分離奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎菌代表株免疫交叉中和達96%以上，由此選用 的奶牛乳房炎5、8、336型金黃色葡萄球菌優(yōu)勢疫苗株具有代表中國流行株。在本發(fā)明的方法中，包括但不限于5、8、336血清型金葡菌作為奶牛乳腺炎疫苗候 選優(yōu)勢菌株；包括任何適宜于制備奶牛乳房炎金葡菌疫苗生產(chǎn)的當(dāng)前和今后廣泛流行的金 葡菌野生株。2、選用奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎5、8、336血清型優(yōu)勢疫苗株，通過BHI培養(yǎng)傳代、建立了奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎滅活疫苗原始種子批、主種子批和工作種子批庫，進 一步通過理化性質(zhì)、基因特征、毒理和免疫原性等全面分析，表明建立的奶牛5、8、336血清 型金黃色葡萄球菌疫苗菌株三級種子批庫符合疫苗生產(chǎn)用要求。在本發(fā)明專利中，包括但不限于5、8、336血清型金黃色葡萄球菌建立種子批庫； 包括適用于當(dāng)前和今后廣泛流行的金葡菌野生株或突變菌株所建立疫苗種子批庫疫苗的生產(chǎn)。3、通過奶牛乳房炎5、8、336血清型金黃色葡萄球菌苗工作種子批株，從IOL到 1000L發(fā)酵在BHI培養(yǎng)基中放大培養(yǎng)，制備了奶牛5、8、336血清型金黃色葡萄球菌乳房炎菌 苗原液，經(jīng)甲醛滅活、離心分離、生化提取制備了純化5、8、336等血清型滅活全菌、莢膜多 糖抗原，抗原純度達95%;通過對溫度、時間、接種量等培養(yǎng)條件的優(yōu)化，獲得了規(guī)模化生產(chǎn) 滅活全菌、莢膜多糖疫苗抗原原液；進一步進行血清型別、理化性質(zhì)、基因特征、外源因子、 免疫原性等全面鑒定。在本發(fā)明專利中，包括但不限于5、8、336血清型金黃色葡萄球菌苗工作種子批 株、BHI培養(yǎng)基用于疫苗原液規(guī)模化生產(chǎn)；包括用于當(dāng)前和今后廣泛流行的候選金葡菌優(yōu) 勢疫苗株及LB等培養(yǎng)基介質(zhì)。4、純化的奶牛5、8、336血清型金黃色葡萄球菌乳房炎滅活莢膜多糖疫苗原液，用 偶聯(lián)劑與破傷風(fēng)毒素蛋白(TT)、白喉毒素蛋白(DT)、無毒力白喉毒素蛋白(CRM197)或其他 合適的載體蛋白分子。依Pr-L-Ps結(jié)構(gòu)式偶聯(lián)，其中，Pr是載體蛋白，Ps是奶牛金葡菌莢膜 多糖，L是共價鍵、或連接基團，且Ps Pr的質(zhì)量比為0.5-3. 5 1。先采用溴化氫活化多 糖，然后再采用碳二亞胺將活化的多糖與蛋白共價偶聯(lián)。制備出奶牛金葡菌乳房炎莢膜多 糖結(jié)合蛋白抗原原液，交聯(lián)率達85%以上，由此TT或DT或CRM197均可作為該疫苗載體結(jié) 合蛋白ο在本發(fā)明專利中，包括但不限于5、8、336血清型金黃色葡萄球菌滅活莢膜多糖和 TT、DT、CRM197交聯(lián)載體蛋白；包括適用于當(dāng)前和今后廣泛流行金葡菌株莢膜多糖及其它 載體蛋白分子。5、制備的有效劑量純化奶牛5、8、336型金黃色葡萄球菌乳房炎滅活全菌(比如 1 IOX IOltlCFU)、全菌(比如1 10X IOltlCFU)+莢膜多糖(比如10 60Ug)抗原、莢膜 多糖結(jié)合蛋白抗原(比如40 60Ug/CPs-10 20Ug/TT或DT或CRM197)分別與常規(guī)用量 的白花油、FIA、鋁鹽、MF59、SPOl和SP02等疫苗佐劑按比例混均勻，制備奶牛金葡菌乳房 炎滅活全菌、全菌+莢膜多糖、莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗，分別免疫BALB/c鼠、家兔和奶牛動 物，間隔28天，皮下免疫2次，間斷采集奶汁、血清、血細胞及脾細胞，觀察奶牛產(chǎn)奶量與質(zhì) 量、體溫、體重、體細胞計數(shù)、排細菌計數(shù)及ELISA、ELISP0T測定抗體效價、細胞免疫水平及 死亡情況。試驗結(jié)果可見，這幾種佐劑均能提高奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗抗體滴度、依次 是FIA、白花油、SP01、MF59和鋁鹽佐劑，且在不同動物呈現(xiàn)一致性趨勢。由此SPOl、SP02、 MF59、白花油、FIA和鋁鹽均可有效的作為奶牛乳房炎滅活疫苗的佐劑。在本發(fā)明專利中，包括但不限于SPO1、SP02、MF59、白花油、FIA和鋁鹽佐劑中的一 種或幾種用于奶牛金葡菌滅活疫苗的制備；包括免疫刺激復(fù)合物、細胞因子、脂質(zhì)體等佐劑 用于制備奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗。6、本發(fā)明的奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗可不含有佐劑，也可以含有SP01、SP02、MF59、白花油、FIA和鋁鹽佐劑中的一種或幾種，按有效劑量制備有或無佐劑的奶牛金葡菌 滅活單價、多價(5、8、336等血清型)滅活菌體(1 10X101(ICFU)疫苗注射劑型；制備有或 無佐劑的奶牛金葡菌單價、二價、三價、多價(5、8、336等血清型不同菌株)滅活全菌(1 10 X IOltlCFU)+莢膜多糖(10 60Ug)疫苗注射劑型；制備有或無佐劑的奶牛金葡菌單價、 多價滅活莢膜多糖結(jié)合蛋白(40 60Ug/CPs-10 20Ug/TT或DT或CRM197)疫苗注射劑 型。在本發(fā)明專利中，包括但不限于制備5、8、336血清型金黃色葡萄球菌乳房炎滅活 疫苗；包括適用于當(dāng)前和今后廣泛流行奶牛乳房炎新的金葡菌野生株或突變株滅活疫苗注 射劑型的制備。7、本發(fā)明的奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗注射劑型可皮下注射，也可肌肉、乳頭管 注射、透皮免疫，還可以一種或幾種聯(lián)合免疫，制備有或無佐劑的奶牛金葡菌不同劑量單 價、二價、三價、多價滅活全菌疫苗、全菌+莢膜多糖疫苗、莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗，分別免 疫BALB/c、豚鼠、家兔和奶牛動物，觀察過敏性反應(yīng)、異常毒性、熱源質(zhì)反應(yīng)、一般毒性。結(jié)果 表明奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗制品接種動物是安全的。8、本發(fā)明的奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗有或無佐劑的滅活單價、二價、三價、多價 不同劑量滅活全菌疫苗、全菌+莢膜多糖疫苗、莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗，分別免疫BALB/c、 家兔和奶牛動物，間斷采集奶汁、血清、血細胞及脾細胞，觀察奶牛奶產(chǎn)量、奶汁質(zhì)量、體溫、 體細胞計數(shù)、排細菌數(shù)、抗體效價、脾細胞計數(shù)及細胞因子變化，通過量效、時效、次效測定 抗體和細胞免疫水平以評價免疫原性；進一步在2-3歲即將進入泌乳期(即產(chǎn)前25d，懷 孕8個月20d)健康奶牛，免疫劑量是有效劑量滅活全菌疫苗(比如5 X IOltlCFU)、滅活全菌 +莢膜多糖(比如5X101QCFU+50UgCPS)、莢膜多糖結(jié)合蛋白(比如50UgCPs+20UgTT或DT 或CRM197)疫苗，0，28，56天各免疫1次(即產(chǎn)前25天，產(chǎn)后3天、31天)，末次免疫后14 天用1000CFU 5、8、336金葡菌野生菌株乳頭管內(nèi)注射攻毒，間斷采集奶汁、血清、血細胞及 脾細胞，觀察牛奶產(chǎn)量、質(zhì)量、體溫、體細胞計數(shù)、排細菌數(shù)、抗體效價、脾細胞計數(shù)及細胞因 子等指標(biāo)評價免疫保護率。結(jié)果顯示，制備的不管是皮下或是肌肉或是乳頭管注射、不管 是單價或是多價、不管是有佐劑或是無佐劑奶都有產(chǎn)生高效價抗體滴度，與劑量呈相關(guān)，且 5X 101QCFU、50UgCPs、20Ug TT或DT或CRM197達到平臺期，加佐劑好于無佐劑組，多價、三 價、二價好于單價，有莢膜多糖好于滅活全菌疫苗，在不同動物有一致免疫應(yīng)答趨勢，加莢 膜多糖可提高免疫保護率，奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗在奶牛體內(nèi)免疫保護率80%以上。9、本發(fā)明的奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗有或無佐劑的滅活單價、二價、三價、多 價滅活全菌疫苗、全菌+莢膜多糖疫苗、莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗制品，分別置于4°C、室溫 (20-25) °C和37°C，從外觀、pH、蛋白含量、動物免疫原性等指標(biāo)觀察疫苗穩(wěn)定性。結(jié)果表明， 奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗制品放置2 8°C穩(wěn)定性良好，有效期2年以上。10、在本發(fā)明的方法中，可以采用任何適宜于制備滅活全菌體、全菌+莢膜多糖、 莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗的奶牛乳房炎金葡菌株進行疫苗生產(chǎn)，但疫苗株的選擇應(yīng)具有代表 性，依據(jù)流行病學(xué)調(diào)查資料選擇的、當(dāng)前和今后廣泛流行的野生株。另外，菌株產(chǎn)量高、誘導(dǎo) 免疫保護的能力強、交叉保護譜廣、穩(wěn)定。11、本發(fā)明的奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗用于不同品種、不同年齡奶牛免疫接種 乳房炎的發(fā)生。
綜上所述，該疫苗主要含有奶牛乳房炎5、8、336型金黃萄菌具有代表當(dāng)前、今后 流行的鏈球菌感染所致奶牛乳房炎優(yōu)勢菌株。制備的5、8、336型金葡菌兔抗血清，與現(xiàn)有 國內(nèi)外臨床分離奶牛乳房炎金葡菌代表株免疫交叉中和達96%以上，由此選擇5、8、336型 金葡菌具有代表國內(nèi)外奶牛乳房炎流行株和疫苗株特征。建立符合疫苗生產(chǎn)要求的5、8、 336型金葡菌株及變異株奶牛乳房炎滅活疫苗原始種子批、主種子批和工作種子批庫。通 過BHI或LB培養(yǎng)基放大培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)，制備奶牛5、8、336血清型金黃色葡萄球菌乳房炎 菌苗原液，經(jīng)甲醛滅活、離心分離、生化提取制備了純化5、8、336型金葡菌滅活全菌。通過 BHI或LB等培養(yǎng)基放大培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)，制備奶牛5、8、336血清型金黃色葡萄球菌乳房炎 菌苗原液，經(jīng)甲醛滅活、離心分離、生化提取制備了純化5、8、336型金葡菌莢膜多糖抗原。 制備的5、8、336型金葡菌莢膜多糖抗原用溴化氫、碳二亞胺偶聯(lián)劑與TT、DT、CRM197或其他 合適的載體蛋白共價偶聯(lián)出奶牛金葡菌乳房炎莢膜多糖結(jié)合蛋白。制備出奶牛5、8、336型 金葡菌乳房炎滅活全菌疫苗、滅活全菌+莢膜多糖疫苗、滅活莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗。該疫 苗中可以不含有佐劑，制備無佐劑的單價或多價的奶牛金葡菌乳房炎滅活全菌疫苗、全菌+ 莢膜多糖疫苗、莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗；該疫苗中可以含有佐劑，佐劑為如下的一種①白 花油，為商品化佐劑；②FIA，為商品化佐劑；③鋁鹽，為氫氧化鋁或磷酸鋁；④MF59，為商品 化佐劑；⑤SP01，為2%角鯊烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚混勻水包油樣；⑥SP02， 為2%角鯊烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚、IOug細菌鞭毛混勻水包油樣。佐劑也可 如上的兩種或多種組合或其它佐劑，制備有佐劑的單價或多價的奶牛金葡菌乳房炎滅活全 菌疫苗、全菌+莢膜多糖疫苗、莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗。該疫苗制備成臨床適用的注射劑 型皮下注射劑型、肌肉注射劑型、乳頭管注射劑型、微針透皮劑型。該疫苗有或無佐劑的單 價、二價、三價、多價滅活全菌疫苗、全菌+莢膜多糖疫苗、莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗通過皮下 或肌肉或乳頭管注射。表明該疫苗都能產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答，皮下注射高于肌肉、乳頭管途 徑；免疫加佐劑好于無佐劑組；多價、三價、二價好于單價；有莢膜多糖好于滅活全菌疫苗； 在不同動物有一致免疫應(yīng)答趨勢，奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗在奶牛體內(nèi)免疫保護率80% 以上。該疫苗制品在動物體內(nèi)使用安全，無不良反應(yīng)。該疫苗制品放置2 8°C穩(wěn)定性良 好，有效期暫定2年。該疫苗制品通過皮下注射、肌肉注射、乳頭管注射、微針透皮劑型用于 不同品種、不同年齡奶牛的免疫接種，可安全、有效預(yù)防金葡菌感染性奶牛乳房炎的發(fā)生。本發(fā)明的優(yōu)點是選擇我國奶牛乳房炎優(yōu)勢金黃色葡萄球菌流行菌株作為疫苗 株、通過滅活全菌、滅活全菌+莢膜多糖及莢膜多糖結(jié)合蛋白為疫苗靶抗原、與加入或不加 入疫苗佐劑制備系統(tǒng)奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎滅活疫苗注射劑型、微針透皮劑型，為安 全、高效、全面有效預(yù)防金黃色葡萄球菌感染性奶牛乳房炎提供了有力保證，將是奶牛金黃 色葡萄球菌乳房炎疫苗發(fā)展的新里程碑。
具體實施例方式下面參考實施例對本發(fā)明作進一步說明。給出這些實施例只是為了舉例說明，它 們不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實施例1 篩選并確定金葡菌感染奶牛乳房炎流行優(yōu)勢菌株從覆蓋我國東西南北中的內(nèi)蒙古、重慶、廣州、黑龍江、蘭州、河北、山東等30個省市地90個中大型奶牛場采集近3萬份臨床奶牛乳房炎奶汁樣品，分離檢定，篩選并確定奶 牛金葡菌感染乳房炎優(yōu)勢流行菌株；1.奶牛乳樣的采集選取出現(xiàn)臨床癥狀(或者懷疑為亞臨床型乳房炎)乳房炎奶 牛，先用溫水，再用0.2%新潔爾滅擦洗乳房，最后用70%的酒精擦拭乳頭。采樣者同時進 行手指擦拭消毒。每個乳室先擠去頭2 3把奶，以排除污染的雜菌，每頭奶牛取乳樣至少 5mL于無菌乳樣杯中，待檢。2.將乳樣搖勻，分別取適量接種于營養(yǎng)肉湯(10%血清)、普通瓊脂平板、TSA平 板、BHI培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基、TSA平板、新鮮脫纖維綿羊血平板、麥康凱瓊脂平板后，置于 37°C溫箱培養(yǎng)24 48h。觀察每個平板中細菌生長的情況，記錄菌落生長表現(xiàn)。普通瓊脂平板上，37°C，24 72h培養(yǎng)后，可見到濕潤、光滑、隆起的圓形金黃色菌 落。挑取典型菌落涂片、染色、鏡檢呈葡萄狀排列，革蘭氏染色陽性，并挑取單個可疑菌落移 植于肉湯和斜面培養(yǎng)基，經(jīng)37°C培養(yǎng)24 48h。營養(yǎng)肉湯中呈渾濁生長，管底有少量灰白 色沉淀；新鮮脫纖維綿羊血平板中菌落較大，呈金黃色、圓形，周圍出現(xiàn)明顯的溶血。麥 康凱瓊脂平板上不生長。金葡菌生化鑒定，觸酶試驗陽性，血漿凝固酶反應(yīng)為陽性。糖發(fā)酵 試驗?zāi)芊纸馄咸烟?、乳糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖發(fā)酵，不能利用阿拉伯糖、丙二酸鹽。氧化 酶陰性，V-P試驗陽性，DNA酶試驗陽性，硝酸鹽還原反應(yīng)為陽性，吲哚試驗為陽性，明膠液 化反應(yīng)為陰性。3.血清型鑒定，將鑒定好的金葡菌用標(biāo)準(zhǔn)奶牛乳房炎5、8、336金葡菌血清型 (ATCC購買)進行玻片凝集試驗，結(jié)果顯示，分離、篩選的5、8、336型金葡菌與同型標(biāo)準(zhǔn)血清 出現(xiàn)特異性凝集反應(yīng)陽性，且各血清型交叉凝集反應(yīng)陰性。由此，從現(xiàn)場分離具有代表中國 流行株的5、8、336型金黃色葡萄球菌作為疫苗候選株。4.酶切質(zhì)粒圖譜分析將分離5、8和336血清型奶牛金葡菌乳房炎菌株按常規(guī)方 法提取細菌質(zhì)粒DNA，酶切質(zhì)粒DNA片段符合奶牛乳房炎金葡菌各血清型基因片段特征。5. SDS分析菌體蛋白組分將其分離5、8和336主要血清型奶牛金葡菌乳房炎菌 株進行SDS-PAGE，可見呈26-30余條大小不等蛋白條帶，進一步免疫印跡符合奶牛乳房炎 金葡菌各血清型蛋白條帶特征。6.致病性分析將其分離5、8和336血清型奶牛金葡菌乳房炎菌株在LB培養(yǎng)基 培養(yǎng)傳代，純化各血清型金葡菌菌株，分別注入6-18周BALB/c鼠腹腔3X IO8個活菌、1. 5-2 歲家兔腹腔1 X IO9個活菌數(shù)、3-4歲奶牛乳管800個混合活菌，可使小鼠、家兔動物發(fā)病，甚 至在1周內(nèi)死亡，對奶牛觀察產(chǎn)奶量與質(zhì)量、體溫、體重、體細胞數(shù)、細菌數(shù)等。對接種后發(fā) 病、死亡動物肝臟、奶牛乳房進行病原菌重分離。進行菌落涂片、革蘭氏染色、顯微鏡檢查， 觀察所分離菌株為5、8和336血清型奶牛金葡菌乳房炎主要的致病菌。以上通過選擇性培養(yǎng)基上分離與篩選、生化鑒定、基因分析、BALB/c、家兔、奶牛動 物的致病性等評價，確定了 5、8和336三個血清型金葡菌為我國流行優(yōu)勢株，占分離奶牛乳 房炎金葡菌的92%，為候選奶牛金葡菌乳房炎優(yōu)勢疫苗株提供了依據(jù)。實施例2 制備奶牛 金葡菌乳房炎優(yōu)勢疫苗菌株免疫血清及確定候選疫苗株從確定具有代表性5、8和336血清型金葡菌奶牛乳房炎流行優(yōu)勢株，制備5、8和 336血清型菌株抗原，分別用5 X 107CFU/lml劑量皮下免疫家兔(金葡菌抗原及抗體陰性)， 免后21天心臟放血，血清抗體效價達到1 1600以上，再分別與臨床分離奶牛金葡菌乳房炎毒株、購買美國ATCC和中國菌種庫主要奶牛乳房炎標(biāo)準(zhǔn)株進行免疫試驗，結(jié)果顯示免疫 中和交叉率達96%，由此確定所選用的5、8和336型奶牛金葡菌優(yōu)勢疫苗株具有廣泛的代 表性。實施例3 建立奶牛金葡菌乳房炎疫苗株三級種子批庫及檢定從確定具有代表奶牛乳房炎5、8和336血清型金葡菌流行優(yōu)勢株，分別接種于LB 培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)24小時，收取菌液，建立三級種子批庫及全面檢定。1.原始種子批的建立選取奶牛乳房炎5、8和336血清型金葡菌流行優(yōu)勢株菌落 劃線接種5%綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，置37°C培養(yǎng)20-24小時培養(yǎng)，用脫脂牛奶沖下，第 二代作為原始種子批庫，加入5%脫脂奶粉分裝于凍存管，凍干后-70°C以下長期保存。2.主種子批的建立取第二代5、8和336血清型奶牛金葡菌乳房炎原始種子批菌 株接種于BHI培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)20-24小時，第三代作為主種子批庫，加入5%脫脂奶粉分裝 于凍存管，凍干后-70°C以下長期保存。3.工作種子批的建立取第三代5、8和336血清型奶牛金葡菌乳房炎原始種子批 菌株接種于BHI培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24小時，第四代作為主種子批庫，加入20%的甘油分裝于 培養(yǎng)瓶內(nèi)，-70°C保存。4.三級種子批的檢定通過對奶牛乳房炎5、8和336血清型金葡菌菌疫苗菌株原 始種子批、主種子批、工作種子批菌株以及傳代30代菌株的外觀、血清型別、PH值、溶解時 間、水分含量、菌落變異率、形態(tài)與染色、菌株質(zhì)粒圖譜、莢膜多糖、菌株毒性和免疫原性進 行了全面檢定。結(jié)果顯示，建立的奶牛5、8和336血清型金葡菌乳房炎疫苗三級種子批庫 安全、穩(wěn)定，符合疫苗生產(chǎn)的要求。實施例4 規(guī)?；l(fā)酵培養(yǎng)奶牛乳房炎金葡菌原液及滅活取奶牛5、8和336型金葡菌乳房炎疫苗工作種子批庫菌株，接種于IOL細菌培養(yǎng) 罐的BHI培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h ；然后轉(zhuǎn)接于1000L發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)約20h，收 獲菌液，取樣作純檢并計算菌數(shù)；隨后加入終濃度為0. 4%的甲醛溶液，37°C，轉(zhuǎn)速150rpm， 滅活36-48h。隨機取樣連傳三代無細菌生長，用無熱源的PBS洗菌三次，每次4°C，6500rpm 離心15min，沉淀用于制備滅活全菌疫苗抗原，上清液用于制備莢膜多糖疫苗抗原。實施例5 純化奶牛乳房炎金葡菌滅活全菌、莢膜多糖及檢定1.制備滅活全菌抗原取規(guī)?；l(fā)酵培養(yǎng)的奶牛5、8和336型金葡菌乳房炎疫苗 滅活全菌，用PBS洗滌2次，6500rpm/min, 4°C離心15min，要沉淀，用PBS溶解，測定含量，凍 干或液體為純化的滅活全菌疫苗抗原。2.粗提莢膜多糖抗原取規(guī)?；l(fā)酵培養(yǎng)的奶牛5、8和336型金葡菌乳房炎疫 苗發(fā)酵上清液，加入終濃度為的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，連續(xù)攪拌后4°C靜置過 夜，10000rpm/min離心收沉淀為復(fù)合多糖。將復(fù)合多糖溶入2M氯化鈣溶液，使十六烷基三 甲基溴化銨與多糖解離，加入終濃度為25%的乙醇，4°C靜置3h或過夜，5000rpm，4°C離心 30min去核酸沉淀。收集澄清的上清液，中加入冷卻的終濃度為80%的乙醇，4°C靜置3h或 過夜沉淀多糖，10000rpm，4°C離心15min，收集沉淀為粗糖，用無水乙醇及丙酮各洗2次，干 燥，即為多糖粗制品，保存于-20°C以下備用。3.純化莢膜多糖抗原將奶牛5、8和336型金葡菌莢膜多糖粗制品溶解于10%飽 和中性乙酸鈉中，按1 2容量用冷酚提取2-4次，10000rpm，4°C離心20min，收集上清液， 用0. IM氯化鈣溶液透析過夜，再加無水乙醇至終濃度為75%，充分振搖，4°C靜置3h或過夜沉淀多糖，10000rpm，4°C離心20min，收集沉淀，用無水乙醇及丙酮各洗2次，測含量，凍干 或液體即得純化莢膜多糖抗原。4.莢膜多糖抗原的鑒定純化的奶牛5、8和336型金葡菌乳房炎疫苗莢膜多糖抗 原通過核酸、蛋白、總氮、總磷、分子大小、純度、糖醛酸、氨基己糖和甲基戊糖等指標(biāo)檢測。 結(jié)果顯示，制備的奶牛5、8和336型金葡菌乳房炎疫苗莢膜多糖抗原純度達到95 %以上，且 呈單一各血清型莢膜多糖抗原成分、無外源因子。實施例6 制備奶牛乳房炎金葡菌莢膜多糖結(jié)合蛋白抗原及檢定將純化奶牛乳房炎5、8和336型金葡菌莢膜多糖加入溴化氫(多糖與溴化氫的重 量比例為1 0.5)活化，再加入己二酰井處理，衍化率為1-3%。再加入TT或DT蛋白或 CRM197和碳二亞胺(19. 17mg/ml)，反應(yīng)得到金葡菌莢膜多糖與TT或DT蛋白或CRM197的 化學(xué)共價偶聯(lián)物。采用DEAE離子交換柱進行色譜分離，即將莢膜多糖結(jié)合蛋白抗原，懸浮 于lOOmMTris，pH8. 6緩沖液中，再經(jīng)過分子篩柱層析進行分離，去除未結(jié)合的蛋白，分離后 的溶液除菌過濾后，即為莢膜多糖結(jié)合TT或DT或CRM197蛋白抗原。通過高壓液相純度、外 源因子測定，結(jié)果顯示莢膜多糖結(jié)合蛋白純度達95%、偶聯(lián)率達88%，呈單一結(jié)合物成分， 無外源因子。實施例7 制備奶牛金葡菌乳房炎三價滅活疫苗及檢定1.奶牛金葡菌乳房炎三價滅活全菌疫苗①將純化奶牛金葡菌乳房炎三價(5、8 和336型的不同菌株)滅活全菌抗原不加佐劑，配制1Χ101(^υ/1πι1、5Χ101(^υ/5πι1無佐 劑注射劑型；②將純化奶牛金葡菌乳房炎三價(5、8和336型)滅活全菌抗原加入氫氧化鋁 或磷酸鋁，配制1 X 1010CFU/0. 5mg (鋁鹽)/lml、5 X 1010CFU/2. 5mg (鋁鹽)/5ml有鋁鹽佐劑 注射劑型；③將純化奶牛金葡菌乳房炎三價(5、8和336型)滅活全菌抗原加入等量SPOl 佐劑(2%角鯊烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚)或SP02佐劑(2%角鯊烯、0. 聚氧 乙烯蓖麻油、0. 聚醚、IOug細菌鞭毛)混勻水包油樣，配制1 X 101(lCFU+0. 5ml SPOl (或 SP02)/lml、5X 1010+2. 5ml SPOl (或 SP02CFU)/5ml 有 SPOl 或 SP02 佐劑注射劑型；④將純 化奶牛金葡菌乳房炎三價(5、8和336型)滅活全菌抗原加入等量白花油佐劑混勻油包水 樣，配制 1X101qCFU+0. 5ml 白花油(IFA)/lml、5X 1010CFU/+2. 5ml 白花油(IFA)/5ml 有白花 油佐劑注射劑型，以上注射疫苗劑型可為皮下注射、肌肉注射、奶頭乳管注射劑型，放2-8°C 2.奶牛金葡菌乳房炎三價滅活(全菌+莢膜多糖)疫苗①將純化奶 牛金葡菌乳房炎三價(5、8和336型)滅活全菌+莢膜多糖抗原不加佐劑，配制 1 X 1010CFU+20ugCPs/Iml、5 X 1010CPU+50ugCPs/5ml無佐劑注射劑型；②將純化奶牛金葡 菌乳房炎三價(5、8和336型)滅活全菌+莢膜多糖抗原加入氫氧化鋁或磷酸鋁，分別 配制 1 X 10lclCFU+20ugCPs/0. 5mg(鋁鹽)/lml、5X 10lclCFU+60ugCPs/2. 5mg(鋁鹽)/5ml 有鋁鹽佐劑注射劑型；③將純化奶牛金葡菌乳房炎三價(5、8和336型)滅活全菌+莢 膜多糖抗原加入等量SPOl佐劑(2%角鯊烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚)或 SP02佐劑(2%角鯊烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚、IOug細菌鞭毛)混勻水包油 樣，配制 1 X 10lclCFU+20ugCPs+0. 5ml SPOl (或 SP02)/lml、5X 10lclCFU+60ugCPs+2. 5ml SPOl (或SP02)/5ml有SP01、SP02佐劑注射劑型；④將純化奶牛金葡菌乳房炎三價(5、 8和336型)滅活全菌+莢膜多糖抗原加入等量白花油佐劑混勻油包水樣，分別配制1 X 10lclCFU+20ugCPs+0. 5ml 白花油(IFA)/lml、5X 10lcl+50ugCPs+2. 5ml 白花油(IFA)/5ml 有白花油佐劑注射劑型，以上注射疫苗可作為皮下注射、肌肉注射、奶頭乳管注射免疫接 種，放2-8°C備用。3.奶牛金葡菌乳房炎三價莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗①將純化奶牛金葡菌乳房炎 三價(5、8和336型)莢膜多糖結(jié)合蛋白(載體蛋白TT或DT或CRM197)抗原不加佐劑， 配制 20ugCPs+10ugTT(或 DT 或 CRM197)/lml、50ugCPs+20ugTT (或 DT 或 CRM197)/5ml 無佐劑注射劑型；②將純化奶牛金葡菌乳房炎三價(5、8和336型)莢膜多糖結(jié)合蛋白 抗原加入氫氧化鋁或磷酸鋁，分別配制20ugCPs+10ugTT (或DT或CRM197) /0. 5mg(鋁 鹽)/lml、50ugCPs+20ugTT (或 DT 或 CRM197) /2. 5mg (鋁鹽)/5ml 有鋁鹽佐劑注射劑型； ③將純化奶牛金葡菌乳房炎三價(5、8和336型)莢膜多糖結(jié)合蛋白抗原加入等量SPOl 佐劑(2%角鯊烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚)、SP02佐劑(2%角鯊烯、0. 聚氧 乙烯蓖麻油、0. 1 %聚醚、IOug細菌鞭毛)混勻水包油樣，配制20ugCPs+10ugTT(或DT或 CRM197)+0. 5ml SPOl (或 SP02 或 CRM197)/lml、50ugCPs+20ugTT (或 DT 或 CRM197)+2. 5ml SPOl (或SP02)/5ml有SP01、SP02佐劑注射劑型；④將純化奶牛金葡菌乳房炎三價(5、8 和336型)滅活莢膜多糖結(jié)合蛋白抗原加入等量白花油或IFA佐劑混勻油包水樣，分別配 制 20ugCPs+10ugTT (或 DT 或 CRM197) +0. 5ml 白花油或 IFA/lml、50ugCPs+20ugTT (或 DT 或 CRM197)+2. 5ml白花油或IFA/5ml有白花油佐劑注射劑型，以上注射疫苗可作為皮下注射、 肌肉注射、奶頭乳管注射免疫接種，放2-8 V備用。4.將本發(fā)明實施例7制備的奶牛金葡菌乳房炎三價(5、8和336型)滅活全菌疫 苗、全菌+莢膜多糖疫苗、莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗有佐劑或無佐劑劑型進行安全性評價。結(jié) 果可見，奶牛金葡菌乳房炎三價滅活疫苗外觀見均一，無異味和染菌；PH7. 0 7. 2，通過豚 鼠、家兔試驗無熱原、異常毒性和急性毒性反應(yīng)；通過染色和鏡檢無雜菌污染、熱源質(zhì)檢測 在范圍內(nèi)；通過SDS-PAGE和WB檢測抗原蛋白成分存在；通過免疫Balb/C小鼠1次血清中 和抗體效價在1600以上。實施例8 本發(fā)明的奶牛金葡菌乳房炎三價滅活疫苗在動物體內(nèi)的免疫效果評 價1.將本發(fā)明實施例7制備的奶牛金葡菌乳房炎三價滅活全菌疫苗、全菌+莢膜 多糖疫苗、莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗加入或不加入相應(yīng)佐劑，制備的皮下、肌肉、乳管注射 疫苗劑型，并用PBS、鋁鹽、SPOU SP02、白花油、IFA、細菌鞭毛為對照組，分別免疫6-8周 Balb/C小鼠、18月家兔，每組10只，其免疫劑量按實施例7疫苗劑量組(抗原1X101(ICFU、 1 X 10lclCFU+20ugCPs/lml、20ugCPs+10ugTT (或 DT 或 CRM197)/lml，免疫兩次(0，28 天)；末 次免疫后14天將各組小鼠、家兔取血、分離血清和免疫細胞，及通過ELISA法測定血清、乳 汁抗體效價都在1 6400以上，采用MTT法測定中和抗體效價都在1 3200以上，采用流 式細胞儀、ELISP0T儀測定免疫細胞與血清中重要細胞因子、炎性分子、趨化因子及嗜酸性 粒細胞、中性粒細胞等動態(tài)變化使得TH2/Thl應(yīng)答平衡，采用ELISA法測定乳汁slgA抗體 效價都在1 80以上。說明制備的奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗不管是加入佐劑或沒加入 佐劑均都能產(chǎn)生滿意的雙重免疫應(yīng)答，且呈現(xiàn)出試驗組有佐劑優(yōu)于無佐劑組、高劑量組高 于低劑量組免疫應(yīng)答效果，而對陰性照組沒有產(chǎn)生雙重免疫應(yīng)答；制備的奶牛金葡菌乳房 炎滅活疫苗不管是皮下注射還是肌肉、乳管注射劑型均都能產(chǎn)生滿意的雙重免疫應(yīng)答，且注射劑血清抗體效價高于乳管內(nèi)注射劑型，乳管內(nèi)注射的黏膜和細胞免疫效應(yīng)好于肌肉和 皮下免疫途徑；制備的奶牛金葡菌乳房炎滅活三價莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗免疫應(yīng)答效力優(yōu) 于滅活全菌疫苗和全菌+莢膜多糖疫苗，且與后者無顯著差異；制備的奶牛金葡菌乳房炎 滅活三價滅活疫苗免疫應(yīng)答效力優(yōu)于單價滅活疫苗；由此制備的奶牛金葡菌乳房炎滅活疫 苗在小鼠、家兔體內(nèi)具有好的免疫應(yīng)答效果；加佐劑優(yōu)于無佐劑組，SPOl或SP02佐劑整體 優(yōu)于鋁鹽、白花油和IFA佐劑組，且在不同動物有一致免疫應(yīng)答趨勢。由此，研制的奶牛金 葡菌乳房炎滅活疫苗在小鼠體內(nèi)有很好的免疫原性。2.將本發(fā)明實施例7制備的奶牛金葡菌乳房炎三價(5、8和336型)滅活全菌 疫苗、全菌+莢膜多糖疫苗、莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗加入或不加入相應(yīng)佐劑制備的皮下、 肌肉、乳管注射疫苗劑型，并用PBS、鋁鹽、SPOU SP02、白花油、IFA、細菌鞭毛為對照組， 分別按皮下、肌肉、乳管注射途徑選擇2-3歲即將進入泌乳期(即產(chǎn)前25d，懷孕8個月 20d)健康(即疫苗抗體陰性，病原體陰性)奶牛，每組10頭；免疫劑量(抗原5X101(ICFU、 5 X 10lcl+50ugCPs/5ml、50ugCPs+20ugTT (或 DT 或 CRM197) /5ml，免疫程序是 0，28，56 天各免 疫1次(即產(chǎn)前25天，產(chǎn)后3天、31天)；末次免疫后14天取血、分離血清和免疫細胞，采 集、乳汁，觀察奶牛產(chǎn)奶量與質(zhì)量、體溫、體細胞計數(shù)、排細菌計數(shù)及通過ELISA法測定血清 抗體效價12800以上、乳汁抗體效價達到1 3200以上，采用MTT法測定中和抗體效價都 在1 12800以上，說明制備的奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗不管是加入佐劑與沒有佐劑均 都能產(chǎn)生滿意的雙重免疫應(yīng)答，且呈現(xiàn)出試驗組有佐劑優(yōu)于無佐劑組、高劑量組高于低劑 量組免疫應(yīng)答效果，而對陰性照組沒有產(chǎn)生雙重免疫應(yīng)答；制備的奶牛金葡菌乳房炎滅活 疫苗不管是皮下注射還是肌肉、乳管注射劑型均都能產(chǎn)生滿意的雙重免疫應(yīng)答，且注射劑 血清抗體效價高于乳管內(nèi)注射劑型，乳管內(nèi)注射的黏膜和細胞免疫效應(yīng)好于肌肉和皮下免 疫途徑；制備的奶牛金葡菌乳房炎滅活三價莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗免疫應(yīng)答效力優(yōu)于滅活 全菌疫苗和全菌+莢膜多糖疫苗，且與后者無顯著差異；制備的奶牛金葡菌乳房炎滅活三 價滅活疫苗免疫應(yīng)答效力優(yōu)于單價滅活疫苗；由此制備的奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗在奶 牛體內(nèi)具有好的免疫應(yīng)答效果；SP01、SP02佐劑整體優(yōu)于鋁鹽、白花油、FIA佐劑組，且與劑 量呈正相關(guān)免疫應(yīng)答趨勢。依上末次免疫14天后，用臨床分離5、8和336型金葡菌野毒株進行攻毒，通過導(dǎo) 管奶頭注射將500CFU金葡菌注入乳腺乳區(qū)。攻毒后觀測臨床癥狀(發(fā)燒、乳腺腫脹)，奶樣 質(zhì)量(血奶、異常塊、奶量減少)、進食情況(進食減少)及發(fā)病情況，通過奶樣排細菌學(xué)檢 測、體細胞計數(shù)SCC和血清抗體ELISA分析指標(biāo)評價保護率。試驗結(jié)果顯示，研制的奶牛金 葡菌乳房炎滅活疫苗在奶牛體內(nèi)有良好的保護率，有莢膜多糖高于無莢膜多糖疫苗組的保 護率，加佐劑組高于不加佐劑組保護率，保護率達到80%以上。實施例9 本發(fā)明奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗在奶牛體內(nèi)的長效免疫保護評價將本發(fā)明實施例7制備的奶牛金葡菌乳房炎三價(5、8和336型)滅活全菌疫苗、 全菌+莢膜多糖疫苗、莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗頸部皮下注射2-3歲即將進入泌乳期(即產(chǎn) 前25d，懷孕8個月20d)健康(即疫苗抗體陰性，病原體陰性)奶牛，每組20頭；免疫劑量 在(抗原 5 X IO1OCFUj X 10lcl+50ugCPs/5ml、50ugCPs+20ugTT (或 DT 或 CRM197) /5ml，免疫 程序是0，28，56天各免疫1次(即產(chǎn)前25天，產(chǎn)后3天、31天)，第二年后加強免疫1次， 觀察1083天，其間每隔3個月取血、奶汁，觀察奶牛產(chǎn)奶量與質(zhì)量、體細胞計數(shù)、排細菌計數(shù)及通過ELISA、ELISP0T測定抗體效價、細胞免疫的長效免疫應(yīng)答及保護效果。試驗結(jié)果顯 示，研制的奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗具有長效免疫應(yīng)答和免疫保護，第一年免疫3次后， 以后每年加強免疫一次，其保護率達到80%。實施例10 本發(fā)明的奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗安全性試驗1、無菌、支原體試驗將實施例7制備的奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗接種硫乙醇 酸鹽培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基培養(yǎng)14d，并以無菌生理鹽水做陰性對 照，培養(yǎng)溫度為25°C、35°C。結(jié)果顯示，奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗未見細菌生長。將奶牛 金葡菌乳房炎滅活疫苗分別用半流體和肉湯培養(yǎng)基，37°C初代培養(yǎng)21天，次代培養(yǎng)21天， 無菌生理鹽水做陰性對照，結(jié)果顯示奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗無支原體生長。結(jié)果顯示， 奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗無支原體生長。2、溶血性試驗選取體重為350g左右的豚鼠，采集新鮮豚鼠血1ml，用PBS洗滌3 次，再將血細胞體積恢復(fù)并稀釋10倍。PBS稀釋奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗(由實施例7 制備)，分別為2倍、4倍、8倍，將豚鼠血細胞加入到稀釋的待檢佐劑中，8小時后，評價血球 溶解以目測或者上清濃度檢測為準(zhǔn)，并在570nm處檢測吸光度。結(jié)果顯示，沒有發(fā)生血球破 裂，無溶血現(xiàn)象。說明奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗中的成分不能使紅細胞裂解。因此，奶牛 金葡菌乳房炎滅活疫苗無溶血反應(yīng)。3、急性毒性試驗取實施例7制備的奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗0. 5ml腹腔注射 體重為12 18g Balb/C小鼠，每組10只，同時設(shè)PBS陰性對照組，連續(xù)2周觀察小鼠的活 動狀態(tài)、體重變化和存活率。結(jié)果表明，實驗小鼠全部存活，沒有出現(xiàn)豎毛、精神萎靡、行動 遲緩等不良癥狀，而體重呈現(xiàn)增加，由此證明奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗在試驗的濃度下 對動物是安全的，且14天后處死進行大體解剖檢查，未見臟器有病理改變。在體重為8 IOkg的Beagle狗體內(nèi)的急性毒性結(jié)果取實施例7制備的奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗肌 肉注射15ML，每組10只，同時設(shè)PBS陰性對照組，連續(xù)2周觀察行為、體重和存活率變化。 結(jié)果可見，Beagle狗未見毒性反應(yīng)，行為正常，沒有死亡，與對照組狗比較無差異，各狗體重 有所增加，并處死大體解剖未見臟器有明顯的病理改變。因此，奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗 無急性毒性反應(yīng)，使用是安全的。4、過敏試驗研究取實施例7制備的奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗皮下接種體重為 250 350g Hartley豚鼠，每個樣品接種豚鼠5只，每只接種0.5ml，隔日一次，共3次。第 3次注射后21天，耳靜脈給予相同奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗0.5ml，并用人血白蛋白和生 理鹽水以同樣的方法分別接種3只豚鼠作為陽性、陰性對照。注射后30分鐘及3天觀察動 物，陽性、陰性對照均成立，奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗組豚鼠無死亡，且無鼻癢、噴嚏、煩 躁不安、呼吸困難、休克、痙攣等過敏癥狀。因此，奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗在動物體內(nèi)無 過敏反應(yīng)。5、兔熱源質(zhì)試驗取預(yù)檢合格的體重為2 3kg家兔3只固定，30分鐘后測 量體溫，共測2次，間隔30分鐘，要求2次溫差不大于0. 2°C，各家兔2次平均溫度在 38. 6-39. 5°C。將實施例7制備的奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗預(yù)熱至38°C，于第2次測溫后 15分鐘內(nèi)，自家兔耳邊靜脈緩緩注入0. 5ml/只。注射后每隔30分鐘測量體溫1次，連測6 次。結(jié)果顯示奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗給予家兔個體升溫未超過0. 2°C，3只家兔升溫 總和未超過0. 40C，沒有引起家兔的發(fā)熱反應(yīng)。因此，制備的奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗無熱源質(zhì)。6、免疫病理損傷試驗由實施例7制備的奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗通過小鼠、 家兔和奶牛外周血抗體亞型、趣化因子、炎性因子、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、嗜堿性細胞 及氣管、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟等檢測。試驗結(jié)果顯示，奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗免疫接 種不管在小動物，或是在奶牛體內(nèi)Th2/Thl免疫應(yīng)答趨于平衡，沒有免疫器官損傷的跡象， 因此具有安全性。實施例11 本發(fā)明奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗的穩(wěn)定性實驗由實施例7制備的奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗，分別置于2_8°C、室溫(20_25°C)、 37°C 1周、2周、1個月、3個月、6個月、12個月、18個月和24個月，取樣觀察外觀、PH值、 無菌、電鏡觀察粒徑、免疫動物觀察安全性。結(jié)果顯示奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗放置 2-80C 24個月內(nèi)均無變色分層等現(xiàn)象，PH值在7. 0-7. 2之間無變化，電鏡觀察粒徑大小保 持一致，且注射給Balb/c小鼠表現(xiàn)正常；奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗放置室溫25°C 3個月 內(nèi)均有好的穩(wěn)定性；奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗放置室溫37°C 1個月內(nèi)均有好的穩(wěn)定性效 果。由結(jié)果說明，奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗放置2-8°C理化性質(zhì)、生物學(xué)性能穩(wěn)定，有效期 至少24個月。
權(quán)利要求
一種奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎滅活疫苗及其制備方法，其特征是(1)通過對奶牛乳腺炎奶汁樣品進行分離、鑒定，確定奶牛金黃色葡萄球菌流行優(yōu)勢株為5、8、336血清型的不同菌株；制備5、8、336血清型優(yōu)勢流行菌株兔血清，與已有國內(nèi)外臨床分離奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎菌代表株免疫交叉中和達96％以上，由此選用的奶牛乳房炎5、8、336型金黃色葡萄球菌優(yōu)勢疫苗株具有代表性的流行株；在本方法中，包括但不限于5、8、336血清型金葡菌作為奶牛乳腺炎疫苗候選優(yōu)勢菌株；包括任何適宜于制備奶牛乳房炎金葡菌疫苗生產(chǎn)的當(dāng)前和今后廣泛流行的金葡菌野生株；(2)選用奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎5、8、336血清型優(yōu)勢疫苗株，通過BHI培養(yǎng)傳代、建立奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎滅活疫苗原始種子批、主種子批和工作種子批庫，進一步通過理化性質(zhì)、基因特征、毒理和免疫原性等全面分析，表明建立的奶牛5、8、336血清型金黃色葡萄球菌疫苗菌株三級種子批庫符合疫苗生產(chǎn)用要求；在本方法中，包括但不限于5、8、336血清型金黃色葡萄球菌建立種子批庫；包括適用于當(dāng)前和今后廣泛流行的金葡菌野生株或突變菌株所建立疫苗種子批庫疫苗的生產(chǎn)；(3)通過奶牛乳房炎5、8、336血清型金黃色葡萄球菌苗工作種子批株，從10L到1000L發(fā)酵在BHI培養(yǎng)基中放大培養(yǎng)，制備奶牛5、8、336血清型金黃色葡萄球菌乳房炎菌苗原液，經(jīng)甲醛滅活、離心分離、生化提取制備了純化5、8、336等血清型滅活全菌、莢膜多糖抗原，抗原純度達95％；通過對溫度、時間、接種量等培養(yǎng)條件的優(yōu)化，獲得規(guī)?；a(chǎn)滅活全菌、莢膜多糖疫苗抗原原液；進一步進行血清型別、理化性質(zhì)、基因特征、外源因子、免疫原性等全面鑒定，由此可規(guī)?；糜谝呙绲纳a(chǎn)；在本方法中，包括但不限于5、8、336血清型金黃色葡萄球菌苗工作種子批株及BHI培養(yǎng)基用于疫苗原液規(guī)?；a(chǎn)；包括用于當(dāng)前和今后廣泛流行的候選金葡菌優(yōu)勢疫苗株及LB等培養(yǎng)基介質(zhì)；(4)純化的奶牛5、8、336血清型金黃色葡萄球菌乳房炎滅活莢膜多糖疫苗原液，用偶聯(lián)劑與破傷風(fēng)毒素蛋白(TT)、白喉毒素蛋白(DT)、無毒力白喉毒素蛋白(CRM197)或其他合適的載體蛋白分子；依Pr L Ps結(jié)構(gòu)式偶聯(lián)，其中，Pr是載體蛋白，Ps是奶牛金葡菌莢膜多糖，L是共價鍵、或連接基團，且Ps∶Pr的質(zhì)量比為0.5 3.5∶1；先采用溴化氫活化多糖，然后再采用碳二亞胺將活化的多糖與蛋白共價偶聯(lián)；制備出奶牛金葡菌乳房炎莢膜多糖結(jié)合蛋白抗原原液，交聯(lián)率達85％以上，由此TT或DT或CRM197均可作為該疫苗載體結(jié)合蛋白；在本方法中，包括但不限于5、8、336血清型金黃色葡萄球菌滅活莢膜多糖和TT、DT、CRM197交聯(lián)載體蛋白；包括適用于當(dāng)前和今后廣泛流行金葡菌株莢膜多糖及其它載體蛋白 分子；(5)制備的有效劑量純化奶牛5、8、336型金黃色葡萄球菌乳房炎滅活全菌(比如1～10×1010CFU)、全菌(比如1～10×1010CFU)+莢膜多糖(比如10～60Ug)抗原、莢膜多糖結(jié)合蛋白抗原(比如40～60Ug/CPs 10～20Ug/TT或DT或CRM197)分別與常規(guī)用量的白花油、FIA、鋁鹽、MF59、SP01和SP02等疫苗佐劑按比例混均勻，制備奶牛金葡菌乳房炎滅活全菌、全菌+莢膜多糖、莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗，分別免疫BALB/c鼠、家兔和奶牛動物，間隔28天，皮下免疫2次，間斷采集奶汁、血清、血細胞及脾細胞，觀察奶牛產(chǎn)奶量與質(zhì)量、體溫、體重、體細胞計數(shù)、排細菌計數(shù)及ELISA、ELISPOT測定抗體效價、細胞免疫水平及死亡情況。試驗結(jié)果可見，這幾種佐劑均能提高奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗抗體滴度、依次是FIA、白花油、SP01、MF59和鋁鹽佐劑，且在不同動物呈現(xiàn)一致性趨勢；由此SP01、SP02、MF59、白花油、FIA和鋁鹽均可有效的作為奶牛乳房炎滅活疫苗的佐劑；在本方法中，包括但不限于SP01、SP02、MF59、白花油、FIA和鋁鹽佐劑中的一種或幾種用于奶牛金葡菌滅活疫苗的制備；包括免疫刺激復(fù)合物、細胞因子、脂質(zhì)體等佐劑用于制備奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗；(6)本發(fā)明的奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗可不含有佐劑，也可以含有SP01、SP02、MF59、白花油、FIA和鋁鹽佐劑中的一種或幾種，按有效劑量制備有或無佐劑的奶牛金葡菌滅活單價、二價、三價、多價(5、8、336等血清型的不同菌株)滅活菌體(1～10×1010CFU)疫苗注射劑型；制備有或無佐劑的奶牛金葡菌單價、多價(5、8、336等血清型)滅活全菌(1～10×1010CFU)+莢膜多糖(10～60Ug)疫苗注射劑型；制備有或無佐劑的奶牛金葡菌單價、二價、三價、多價(如五價)滅活莢膜多糖結(jié)合蛋白(40～60Ug/CPs 10～20Ug/TT或DT或CRM197)疫苗注射劑型；在本發(fā)明專利中，包括但不限于制備5、8、336血清型金黃色葡萄球菌乳房炎滅活疫苗；包括適用于當(dāng)前和今后廣泛流行奶牛乳房炎新的金葡菌野生株或突變株滅活疫苗注射劑型的制備。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎滅活疫苗的制備方法，其特 征是奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗注射劑型可皮下注射，也可肌肉、乳頭管注射、透皮免疫， 還可以一種或幾種聯(lián)合免疫，制備有或無佐劑的奶牛金葡菌不同劑量單價、二價、三價、多 價(如五價)滅活全菌疫苗、全菌+莢膜多糖疫苗、莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗，分別免疫BALB/ c、豚鼠、家兔和奶牛動物，觀察過敏性反應(yīng)、異常毒性、熱源質(zhì)反應(yīng)、一般毒性。奶牛金葡菌 乳房炎滅活疫苗制品接種動物是安全的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的本發(fā)明的一種奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎滅活疫苗的制 備方法，其特征是奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗有或無佐劑的滅活單價、二價、三價、多價 (如五價)不同劑量滅活全菌疫苗、全菌+莢膜多糖疫苗、莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗，分別免疫 BALB/c、家兔和奶牛動物，間斷采集奶汁、血清、血細胞及脾細胞，觀察奶牛奶產(chǎn)量、奶汁質(zhì) 量、體溫、體細胞計數(shù)、排細菌數(shù)、抗體效價、脾細胞計數(shù)及細胞因子變化，通過量效、時效、 次效測定抗體和細胞免疫水平以評價免疫原性；進一步在2-3歲即將進入泌乳期(即產(chǎn)前 25d，懷孕8個月20d)健康奶牛，免疫劑量是有效劑量滅活全菌疫苗(比如5 X IOltlCFU)、滅 活全菌+莢膜多糖(比如5X 101QCFU+50UgCPS)、莢膜多糖結(jié)合蛋白(比如50UgCPs+20UgTT 或DT或CRM197)疫苗，0，28，56天各免疫1次(即產(chǎn)前25天，產(chǎn)后3天、31天)，末次免疫 后14天用500CFU 5、8、336金葡菌野生菌株乳頭管內(nèi)注射攻毒，間斷采集奶汁、血清、血細 胞及脾細胞，觀察牛奶產(chǎn)量、質(zhì)量、體溫、體細胞計數(shù)、排細菌數(shù)、抗體效價、脾細胞計數(shù)及細 胞因子等指標(biāo)評價免疫保護率0結(jié)果顯示，制備的不管是皮下或是肌肉或是乳頭管注射、 不管是單價或是多價、不管是有佐劑或是無佐劑奶都有產(chǎn)生高效價抗體滴度，與劑量呈相 關(guān)，且5X 101QCFU、50UgCPs、20Ug TT或DT或CRM197達到平臺期，加佐劑好于無佐劑組，多 價(如五價)好于三價、三價好于二價、二價好于單價，有莢膜多糖好于滅活全菌疫苗，在不 同動物有一致免疫應(yīng)答趨勢，加莢膜多糖可提高免疫保護率，奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗在奶牛體內(nèi)免疫保護率80%以上，由此，研制的奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗能有效保護乳 房炎的發(fā)生。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的本發(fā)明的一種奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎滅活疫苗的制備 方法，其特征是奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗有或無佐劑的滅活單價、二價、三價、多價(如 五價)滅活全菌疫苗、全菌+莢膜多糖疫苗、莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗制品，分別置于4°C、室 溫(20-25) °C和37°C，從外觀、pH、蛋白含量、動物免疫原性等指標(biāo)觀察疫苗穩(wěn)定性；奶牛金 葡菌乳房炎滅活疫苗制品放置2 8°C穩(wěn)定性良好，有效期2年以上。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎滅活疫苗及其制備方法，主要包括5、8、336血清型不同菌株的金黃色葡萄球菌感染性奶牛乳房炎疫苗優(yōu)勢流行菌株，進一步通過發(fā)酵規(guī)?；a(chǎn)菌液、滅活、純化等工藝，經(jīng)此形成滅活全菌、全菌+莢膜多糖、莢膜多糖結(jié)合蛋白抗原，不加或加入白花油、FIA、鋁鹽、MF59、SP01、SP02佐劑、免疫刺激復(fù)合物、免疫細胞因子等佐劑，制備單價、二價、三價、多價(如五價)奶牛5、8、336血清型不同菌株的金黃色葡萄球菌乳房炎滅活全菌疫苗、滅活全菌+莢膜多糖疫苗、莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗注射劑型，通過皮下注射、肌肉注射、乳頭管注射、微針透皮免疫接種奶牛。
文檔編號C12R1/445GK101979089SQ201010543949
公開日2011年2月23日 申請日期2010年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月17日
發(fā)明者劉永祥, 孫藝萍, 李敏, 李竟敏, 楊定興, 楊秀蘭, 王鋮, 高嘯 申請人:赤峰博恩藥業(yè)有限公司