專(zhuān)利名稱(chēng)：一種微生物油脂的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物油脂的提取方法。
背景技術(shù)：
多不飽和脂肪酸(PUFA)對(duì)人體的生長(zhǎng)發(fā)育及身體健康起著至關(guān)重要的作用。人 體維持各種組織的正常功能，必須保證有充足的各種脂肪酸，如果缺乏，則會(huì)引發(fā)一系列癥 狀，包括生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、皮膚異常鱗屑、智力障礙等。例如二十二碳六烯酸(DHA)作為一種 重要的PUFA，在增強(qiáng)記憶、思維能力，提高智力等方面具有非常顯著的作用。當(dāng)膳食中長(zhǎng)期 缺乏DHA時(shí)，會(huì)對(duì)人的智力，記憶能力及思維能力產(chǎn)生不良影響。人群流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)， 體內(nèi)DHA含量高的人心理承受力較強(qiáng)，智力發(fā)育指數(shù)也高。目前使用微生物發(fā)酵生產(chǎn)多不飽和脂肪酸油脂的技術(shù)已經(jīng)非常成熟，但是在微生 物油脂的提取工藝上還存在一些問(wèn)題，需要進(jìn)行改進(jìn)。CN101133144A的專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)了使用植物種子和生物體混合干燥后通過(guò)壓榨得 到含有不飽和脂肪酸的油脂，該工藝的主要問(wèn)題在于植物種子本身的脂肪酸降低了目標(biāo) 脂肪酸的含量，同時(shí)由于微藻等生物體細(xì)胞外壁比較堅(jiān)硬的，實(shí)際提油效果不容樂(lè)觀。CN1217029A的專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)了使用從用巴氏法滅菌的生物量中制備含有多不飽 和脂肪酸油脂的方法，然后在后期提油的過(guò)程中通過(guò)造粒、烘干，使用有機(jī)溶劑提油，而該 過(guò)程耗時(shí)多，且使用高溫滅菌及干燥的工藝，不利于多不飽和脂肪酸的保存。CN101195813A的專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)了一種使用高壓均質(zhì)破碎細(xì)胞壁提取油脂的工藝， 該工藝需要使用到120MPa的高壓多次對(duì)微生物細(xì)胞進(jìn)行破碎，生產(chǎn)所需要的能耗巨大，不 利于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種微生物油脂的提取方法，該提取方法能有 效萃取出微生物細(xì)胞內(nèi)的油脂，即提油率高，且提油效率高，工藝簡(jiǎn)單，有利于實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，所采用的技術(shù)方案為一種微生物油脂的提取方法，包括以 下步驟
(1)將產(chǎn)油微生物菌種接種到液體培養(yǎng)基中發(fā)酵，控制發(fā)酵過(guò)程中液體培養(yǎng)基的PH值 為6 8，通過(guò)72 200h的發(fā)酵，得到發(fā)酵液；
(2)調(diào)節(jié)步驟(1)得到的發(fā)酵液溫度為4(T60°C，并將發(fā)酵液的pH值調(diào)節(jié)為3.5 4. 5， 進(jìn)行攪拌，使微生物在12h內(nèi)自溶；
(3)在步驟(2)得到的發(fā)酵液中加入萃取溶劑進(jìn)行萃取，收集上層混合油；
(4)在步驟(3)萃取分離得到的下層溶液中加入萃取溶劑，進(jìn)行二次萃取，收集上層混 合油；
(5)將步驟(3)和步驟(4)得到的上層混合油混合，蒸餾回收其中的萃取溶劑，即得微生物油脂產(chǎn)品。按上述方案，在進(jìn)行步驟(3)之前，在發(fā)酵液中加入破乳劑，破乳劑的重量和發(fā)酵 液的體積的比例為0. 01 0. 05:1 kg/L。按上述方案，所述的破乳劑為無(wú)機(jī)鹽或與水互溶的有機(jī)溶劑，所述的無(wú)機(jī)鹽優(yōu)選 為氯化鈉或氯化鈣，所述的有機(jī)溶劑優(yōu)選為乙醇或丙酮。按上述方案，所述產(chǎn)油微生物中干物質(zhì)的含油量大于或等于30%，即經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后 菌體油脂含量大于或等于細(xì)胞干重的30%，具體優(yōu)選為隱球酵母、高山被孢霉中的一種或海 洋微藻中的任一種。按上述方案，步驟(1)所述的發(fā)酵步驟具體為將產(chǎn)油微生物菌種接種到斜面后， 進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐中，將培養(yǎng)基的PH值控制在6 8，調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度為 2(T30°C，每分鐘的空氣流量為發(fā)酵液體積的0. 5^1. 5倍，培養(yǎng)72 200h，得到發(fā)酵液。按上述方案，步驟(2)所述的pH調(diào)節(jié)劑為鹽酸、硫酸、磷酸、檸檬酸中的一種。按上述方案，步驟(3)的具體步驟為在步驟(2)得到的發(fā)酵液中加入萃取溶劑， 所述萃取溶劑的體積為發(fā)酵液體積的50 200%，調(diào)節(jié)萃取溫度為40 60°C，攪拌30 60min,靜置分層，收集上層混合油。按上述方案，步驟(4)的具體步驟為在步驟(3)萃取分離得到的下層溶液中加 入萃取溶劑，所述萃取溶劑的體積為下層溶液體積的100 200%，調(diào)節(jié)萃取溫度在40 60°C，攪拌30 60min，靜置分層，收集上層混合油。按上述方案，步驟(3)或步驟(4)所述的萃取溶劑包括所有能萃取油脂的有機(jī)溶 劑，優(yōu)選為6號(hào)抽提溶劑、己烷、庚烷或石油醚。按上述方案，在進(jìn)行步驟(5)之前，將步驟(4)重復(fù)進(jìn)行至少一次。本發(fā)明提供的微生物油脂的提取方法，具有以下主要優(yōu)點(diǎn)
1.通過(guò)調(diào)節(jié)微生物發(fā)酵后得到的發(fā)酵液的PH值，使微生物細(xì)胞自溶，可有利于有效 萃取出微生物細(xì)胞內(nèi)的油脂，提高萃取率即提油率；
2.在進(jìn)行萃取之前加入的破乳劑可使自溶后的微生物細(xì)胞內(nèi)的油脂容易被溶劑萃 取，從而進(jìn)一步提高微生物油脂的提油效率；
3.工藝操作簡(jiǎn)單，利于實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例1-5中實(shí)驗(yàn)室提油的具體步驟為將產(chǎn)油微生物發(fā)酵后得到的發(fā)酵液 中的微生物細(xì)胞濾出，干燥稱(chēng)重，使用索式抽提設(shè)備將微生物干細(xì)胞中的油脂萃取完全，再 將抽提得到的油脂恒重稱(chēng)量，即可得到理論含油量。實(shí)施例1
(1)采用雙鞭甲藻菌種接種到斜面后，進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接到70L自動(dòng)發(fā)酵 罐中，其中所述培養(yǎng)基的組成為胰蛋白胨lg/L，酵母膏2g/L，葡萄糖30g/L，KH2PO4 3g/L， NaCl 30g/L，MgSO4. 7H20 lOg/L, KCl lg/L, CaCl2 0. 3g/L, NaHCO3 lg/L, FeSO4 0.01g/L，谷 氨酸40g/L，其余為水，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為6 8，維持發(fā)酵罐的溫度在25 28°C，每分鐘的 空氣流量為發(fā)酵液體積的0. 8倍，培養(yǎng)126h，發(fā)酵結(jié)束，得到發(fā)酵液；
(2)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的溫度至40°C，并用磷酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值到3.5，持續(xù)攪拌6小時(shí)，使發(fā)酵液中的微生物細(xì)胞自溶，獲得50L發(fā)酵液；
(3)取步驟(2)得到的50L發(fā)酵液，加入25L庚烷做萃取溶劑，在40°C的溫度條件下， 攪拌30min，攪拌速度為300r/min，靜置分層60min，收集上層混合油；
(4)在步驟(3)萃取分離得到的下層溶液中加入25L庚烷進(jìn)行二次萃取，萃取步驟如 上，收集上層混合油，如此重復(fù)萃取1次，共萃取2次；
(5)將前述步驟收集的上層混合油混合后，進(jìn)入脫油罐脫溶，得油脂1034g。生產(chǎn)提油率的計(jì)算
取IL步驟(1)得到的發(fā)酵液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室提油，得到微生物油脂23g，將IL生產(chǎn)提油提 取的油脂量與IL實(shí)驗(yàn)室提油提取的油脂量相比，由此計(jì)算可得本實(shí)施例的生產(chǎn)提油率為 90. 0%。實(shí)施例2
(1)采用雙鞭甲藻菌種接種到斜面后，進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接到70L自動(dòng)發(fā)酵 罐中，其中所述培養(yǎng)基的組成為胰蛋白胨lg/L，酵母膏2g/L，葡萄糖30g/L，KH2PO4 3g/L， NaCl 30g/L，MgSO4. 7H20 lOg/L, KCl lg/L, CaCl2 0. 3g/L, NaHCO3 lg/L, FeSO4 0.01g/L，谷 氨酸40g/L，其余為水，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為6 8，維持發(fā)酵罐的溫度在25 28°C，每分鐘的 空氣流量為發(fā)酵液體積的0. 8倍，培養(yǎng)126h，發(fā)酵結(jié)束，得到發(fā)酵液；
(2)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的溫度至50°C，并用硫酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值到3.5，持續(xù)攪拌6小時(shí)，使 發(fā)酵液中的微生物細(xì)胞自溶，獲得50L發(fā)酵液；
(3)取步驟(2)得到的50L發(fā)酵液，加入IL乙醇，攪拌均勻；
(4)在步驟(3)的溶液中繼續(xù)加入50L石油醚，在50°C的溫度條件下，攪拌30min，靜置 分層30min，收集上層混合油；
(5)在步驟(4)萃取分離得到的下層溶液中再加入50L石油醚進(jìn)行二次萃取，萃取步驟 如上，收集上層混合油，如此重復(fù)萃取1次，共萃取2次；
(6)將前述步驟收集的上層混合油混合后，進(jìn)入脫油罐脫溶，得油脂llOOg。生產(chǎn)提油率的計(jì)算
取IL步驟(1)得到的發(fā)酵液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室提油，提取油脂23g，將IL生產(chǎn)提油提取的油 脂量與IL實(shí)驗(yàn)室提油提取的油脂量進(jìn)行相比，由此計(jì)算此生產(chǎn)提油率為95. 6%。實(shí)施例3
(1)采用雙鞭甲藻安瓿罐接種到斜面后，進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接到一級(jí)種子罐培 養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)接入50m3發(fā)酵罐培養(yǎng)，其中所述培養(yǎng)基的組成為胰蛋白胨lg/L，酵母膏2g/ L，葡萄糖 30g/L, KH2PO4 3g/L, NaCl 30g/L, MgSO4. 7H20 lOg/L, KCl lg/L, CaCl2 0. 3g/L， NaHCO3 lg/L, FeSO4 0. 01g/L，谷氨酸40g/L，其余為水，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為6 8，維持發(fā)酵 罐的溫度在25 28°C，每分鐘的空氣流量為發(fā)酵液體積的1. 5倍，培養(yǎng)120h，發(fā)酵結(jié)束，得到 發(fā)酵液；
(2)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的溫度至55°C，并用鹽酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值到4.0左右，持續(xù)12小時(shí)， 使發(fā)酵液中的微生物細(xì)胞自溶，獲得40m3發(fā)酵液；
(3)取步驟(2)的發(fā)酵液40m3，加入50m3己烷，在60°C的溫度條件下，機(jī)械攪拌50min， 靜置分層，收集上層混合油；
(4)在步驟(3)萃取分離得到的下層溶液中再加入50m3己烷進(jìn)行二次萃取，萃取步驟
5如上，收集上層混合油，如此重復(fù)萃取1次，共萃取2次；
(5)將前述步驟收集得到的上層混合油混合，送入脫油罐脫溶，得油脂1090Kg。生產(chǎn)提油率的計(jì)算
取IL步驟(1)得到的發(fā)酵液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室提油，提取油脂28. 5g，將IL生產(chǎn)提油提取 的油脂量與IL實(shí)驗(yàn)室提油提取的油脂量進(jìn)行相比，由此計(jì)算本實(shí)施例的生產(chǎn)提油率為 95. 6%ο實(shí)施例4
(1)采用高山被孢霉安瓿罐接種到斜面后，進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接到一級(jí)種子罐 培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)接入50m3發(fā)酵罐培養(yǎng)，其中所述培養(yǎng)基的組成為葡萄糖20g/L，酵母粉IOg/ L ；谷氨酸5g/L，其余為水，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為6 8，維持發(fā)酵罐的溫度在25 28°C，每分 鐘的空氣流量為發(fā)酵液體積的1. 2倍，培養(yǎng)160h，發(fā)酵結(jié)束，得到發(fā)酵液；
(2)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的溫度至45°C，并用檸檬酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值到4.0左右，持續(xù)攪拌 12小時(shí)，使發(fā)酵液中的微生物細(xì)胞自溶后，獲得40m3發(fā)酵液；
(3)取步驟(2)得到的發(fā)酵液40m3，加入2噸的氯化鈉，在發(fā)酵液中攪拌溶解；
(4)在步驟(3)的溶液中繼續(xù)加入SOm36號(hào)抽提溶劑，在50°C的溫度條件下，機(jī)械攪拌 60min，靜置分層，收集上層混合油；
(5)在下層溶液中再加入SOm36號(hào)抽提溶劑進(jìn)行二次萃取，萃取步驟如上，收集上層混 合油，如此重復(fù)萃取1次，共萃取2次；
(6)將上述收集得到的上層混合油混合，送入脫油罐脫溶，得油脂530Kg。生產(chǎn)提油率的計(jì)算
取IL步驟(1)得到的發(fā)酵液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室提油，提取油脂13. 9g，將IL生產(chǎn)提油提取 的油脂量與IL實(shí)驗(yàn)室提油提取的油脂量進(jìn)行相比，由此計(jì)算本實(shí)施例的生產(chǎn)提油率為 95. 3%ο實(shí)施例5
(1)采用隱球酵母菌菌種接種到斜面后，進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接到一級(jí)種子罐培 養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)接入100L發(fā)酵罐培養(yǎng)，其中所述培養(yǎng)基的組成為葡萄糖40g/L，硫酸銨2g/L， 酵母膏1. 9g/L，磷酸氫二鈉2g/L，磷酸二氫鉀7g/L，七水合硫酸鎂1. 5g/L，其余為水，調(diào)節(jié) 培養(yǎng)基的PH值為6 8，維持發(fā)酵罐的溫度在25 28°C，每分鐘的空氣流量為發(fā)酵液體積的1 倍，培養(yǎng)120h，發(fā)酵結(jié)束，得到發(fā)酵液；
(2)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的溫度至60°C，并用鹽酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值到4.5，持續(xù)攪拌12小時(shí)， 使發(fā)酵液中的微生物細(xì)胞自溶后，獲得50L發(fā)酵液；
(3)取步驟(2)得到的發(fā)酵液50L，加入50L6號(hào)抽提溶劑，在50°C的溫度條件下，機(jī)械 攪拌60min，靜置分層，收集上層混合油；
(4)在下層溶液中再加入50L6號(hào)抽提溶劑進(jìn)行二次萃取，萃取步驟如上，收集上層混 合油，如此重復(fù)萃取2次，共萃取3次；
(5)將上述收集得到的上層混合油混合，送入脫油罐脫溶，得油脂1021g。生產(chǎn)提油率的計(jì)算
取IL步驟(2)得到的發(fā)酵液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室提油，提取油脂22. 4g，將IL生產(chǎn)提油提取 的油脂量與IL實(shí)驗(yàn)室提油提取的油脂量進(jìn)行相比，由此計(jì)算本實(shí)施例的生產(chǎn)提油率為91. 1%。 上述實(shí)施例2和實(shí)施例4中在加入萃取劑進(jìn)行萃取之前，先加入破乳劑，可加快 萃取過(guò)程中的分層，縮短靜置分層時(shí)間，從而提高萃取效率。
權(quán)利要求
一種微生物油脂的提取方法，其特征在于包括以下步驟(1)將產(chǎn)油微生物菌種接種到液體培養(yǎng)基中發(fā)酵，控制發(fā)酵過(guò)程中液體培養(yǎng)基的pH值為6~8，通過(guò)72~200h的發(fā)酵，得到發(fā)酵液；(2)調(diào)節(jié)步驟(1)得到的發(fā)酵液溫度為40~60℃，并將發(fā)酵液的pH值調(diào)節(jié)為3.5～4.5，進(jìn)行攪拌，使微生物在12h內(nèi)自溶；(3)在步驟(2)得到的發(fā)酵液中加入萃取溶劑進(jìn)行萃取，收集上層混合油；(4)在步驟(3)萃取分離得到的下層溶液中加入萃取溶劑，進(jìn)行二次萃取，收集上層混合油；(5)將步驟(3)和步驟(4)得到的上層混合油混合，蒸餾回收其中的萃取溶劑，即得微生物油脂產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物油脂的提取方法，其特征在于在進(jìn)行步驟(3)之前， 在發(fā)酵液中加入破乳劑，破乳劑的重量和發(fā)酵液的體積的比例為0. 01 0. 05:1 kg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物油脂的提取方法，其特征在于所述的破乳劑為無(wú)機(jī) 鹽或與水互溶的有機(jī)溶劑，所述的無(wú)機(jī)鹽為氯化鈉或氯化鈣，所述的有機(jī)溶劑為乙醇或丙酮。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物油脂的提取方法，其特征在于所述產(chǎn)油微生物中干 物質(zhì)的含油量大于或等于30%，具體為隱球酵母、高山被孢霉中的一種或海洋微藻中的任一 種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物油脂的提取方法，其特征在于步驟(1)所述的發(fā)酵步 驟具體為將產(chǎn)油微生物菌種接種到斜面后，進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐中，將 培養(yǎng)基的PH值控制在6 8，調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度為20 30°C，每分鐘的空氣流量為發(fā)酵液體積 的0. 5 1. 5倍，培養(yǎng)72 200h，得到發(fā)酵液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物油脂的提取方法，其特征在于步驟(2)所述的pH調(diào) 節(jié)劑為鹽酸、硫酸、磷酸、檸檬酸中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物油脂的提取方法，其特征在于所述步驟(3)的具體 步驟為在步驟(2)得到的發(fā)酵液中加入萃取溶劑，所述萃取溶劑的體積為發(fā)酵液體積的 50 200%，調(diào)節(jié)萃取溫度為40 60°C，攪拌30 60min，靜置分層，收集上層混合油。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物油脂的提取方法，其特征在于所述步驟(4)的具體步 驟為在步驟(3)萃取分離得到的下層溶液中加入萃取溶劑，所述萃取溶劑的體積為下層 溶液體積的100 200%，調(diào)節(jié)萃取溫度在40 60°C，攪拌30 60min，靜置分層，收集上層 混合油。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物油脂的提取方法，其特征在于所述的萃取溶劑為6 號(hào)抽提溶劑、己烷、庚烷或石油醚。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物油脂的提取方法，其特征在于在進(jìn)行步驟(5)之前， 將步驟(4)重復(fù)進(jìn)行至少一次。
全文摘要
一種微生物油脂的提取方法，包括以下步驟(1)將產(chǎn)油微生物菌種發(fā)酵，得到發(fā)酵液；(2)將步驟(1)得到的發(fā)酵液的pH值調(diào)節(jié)為3.5～4.5，使微生物自溶；(3)在步驟(2)得到的發(fā)酵液中加入萃取溶劑進(jìn)行萃取，收集上層混合油；(4)在步驟(3)萃取分離得到的下層溶液中加入萃取溶劑，進(jìn)行二次萃取，收集上層混合油；(5)將步驟(3)和步驟(4)得到的上層混合油混合，蒸餾回收其中的萃取溶劑，即得微生物油脂產(chǎn)品。該提取方法能有效萃取出微生物細(xì)胞內(nèi)的油脂，即提油率高，且提油效率高，工藝簡(jiǎn)單，有利于實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P7/64GK101985637SQ20101052770
公開(kāi)日2011年3月16日 申請(qǐng)日期2010年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月2日
發(fā)明者向麗, 唐孝鵬, 尚耘, 汪志明, 肖子豪, 馬凡提 申請(qǐng)人:嘉吉烯王生物工程(武漢)有限公司