專利名稱：一種利用味精發(fā)酵廢棄菌體生產(chǎn)有機(jī)酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化工領(lǐng)域中的有機(jī)酸的發(fā)酵方法，具體地說(shuō)，涉及利用味精發(fā)酵 廢棄菌體谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)來(lái)生產(chǎn)有機(jī)酸的方法。
背景技術(shù)：
谷氨酸棒桿菌是目前味精行業(yè)中L-谷氨酸發(fā)酵的一種非常重要的生產(chǎn)菌種，谷 氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸是一個(gè)好氧過(guò)程，產(chǎn)生大量的生物質(zhì)菌體。目前的工藝中，發(fā) 酵結(jié)束后產(chǎn)生的大量生物質(zhì)(廢棄的菌體)被用于生產(chǎn)菌體蛋白飼料用于畜牧業(yè)，或者用 于提取核苷酸等低價(jià)值產(chǎn)品，資源利用率低下。一般味精發(fā)酵一噸廢棄菌體中可回收核苷 8-10公斤(150元/公斤)，其余再作為蛋白飼料(2000元/噸)，且該過(guò)程需要對(duì)菌體進(jìn)行 生化處理，消耗一定的物能，也會(huì)增加對(duì)環(huán)境的污染，所以如何更加合理的處理味精發(fā)酵的 廢棄菌體是味精產(chǎn)業(yè)中資源高效利用的關(guān)鍵問(wèn)題。近幾年，日本科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸棒 桿菌在厭氧條件下培養(yǎng)具有良好的有機(jī)酸生產(chǎn)潛力，積累大量的乳酸、丁二酸和乙酸。谷氨 酸棒桿菌生長(zhǎng)迅速、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、耐受性強(qiáng)、發(fā)酵條件成熟，同時(shí)由于其厭氧代謝途徑中 部分酶的缺失，使得其在厭氧條件下副產(chǎn)物較少，成為最具潛力的生產(chǎn)有機(jī)酸的工業(yè)菌種。 但是該過(guò)程中的厭氧發(fā)酵需要高產(chǎn)量的菌體積累，所消耗的大量物能使得該應(yīng)用還不能滿 足工業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)要求，如果能夠?qū)⑽毒a(chǎn)的廢棄菌體資源化利用，來(lái)作為谷氨酸棒桿 菌厭氧發(fā)酵有機(jī)酸的菌體積累，則可有效解決有機(jī)酸發(fā)酵的高成本問(wèn)題，使其具備產(chǎn)業(yè)化 的價(jià)值。丁二酸又稱琥珀酸，是一種二元有機(jī)酸，它是一種重要的C4平臺(tái)化合物，可作為 合成復(fù)雜有機(jī)化合物的中間體，廣泛應(yīng)用于合成塑料、橡膠和染料、制藥、食品加工和其它 工業(yè)中，其市場(chǎng)需求量與日俱增。傳統(tǒng)的化學(xué)合成丁二酸法因?yàn)槭褂没?、環(huán)境污染等 原因受到較大限制，而微生物發(fā)酵法由于效率高、污染小等優(yōu)點(diǎn)，正在被廣泛深入的研究。 但目前用于發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的菌株主要是從特征性厭氧環(huán)境(瘤胃、腸胃等)中篩選出的 菌株或基因工程菌，由于在理想狀態(tài)下丁二酸產(chǎn)率伴隨著菌體濃度而增加，為了保持一個(gè) 相對(duì)穩(wěn)定丁二酸高產(chǎn)率，必須使發(fā)酵菌體達(dá)到一個(gè)高濃度的細(xì)胞密度，這個(gè)過(guò)程在實(shí)際生 產(chǎn)中要耗費(fèi)大量的培養(yǎng)時(shí)間與物能消耗，所以如何能夠降低菌體富集的成本成了有機(jī)酸發(fā) 酵產(chǎn)業(yè)化需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。D-乳酸作為一個(gè)重要的手性中間體，已被用于多種手性物質(zhì)的合成。近年來(lái)高光 學(xué)純度的D-乳酸因?yàn)樵谔岣呔廴樗岵牧闲阅芊矫娴膶?shí)際應(yīng)用而得到了更多的關(guān)注。微生 物發(fā)酵法是目前制備D-乳酸的最主要方法之一，現(xiàn)有的生產(chǎn)工藝都是利用細(xì)菌將碳水化 合物經(jīng)厭氧發(fā)酵而成，生產(chǎn)差異主要在菌種，而這個(gè)過(guò)程中提高D-乳酸生產(chǎn)效率的關(guān)鍵仍 是菌體的高密度培養(yǎng)。目前國(guó)內(nèi)外研究較多的D-乳酸生產(chǎn)菌主要集中在乳桿菌屬和芽孢 乳桿菌屬，這兩類菌都是專性或兼性厭氧菌，大規(guī)模高產(chǎn)量的D-乳酸生產(chǎn)依賴于菌體富集 的發(fā)酵耗能，使得D-乳酸生產(chǎn)的關(guān)鍵問(wèn)題同樣集中在獲得大量的發(fā)酵菌體，這同樣也關(guān)系 到聚乳酸產(chǎn)品的生產(chǎn)成本的降低，使得作為環(huán)保塑料的聚乳酸有機(jī)會(huì)取代傳統(tǒng)塑料。
除谷氨酸以外，谷氨酸棒桿菌在其它氨基酸及其衍生物(如L-賴氨酸、L-蘇氨酸、 L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-谷氨酰胺等)工業(yè)生產(chǎn)中一直占據(jù)中堅(jiān)地位。這些氨基酸的 理化性質(zhì)與谷氨酸相似，在生產(chǎn)工藝上可以借鑒味精生產(chǎn)成熟的路線，因而其廢棄菌體的 處理也成為了發(fā)酵產(chǎn)業(yè)資源化高效利用的關(guān)鍵問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問(wèn)題是提供一種利用生產(chǎn)味精發(fā)酵廢液中的菌體回收再次發(fā) 酵來(lái)生產(chǎn)有機(jī)酸的方法，方法簡(jiǎn)便，設(shè)備要求不高，易于自動(dòng)化控制，具有廣泛的社會(huì)和經(jīng) 濟(jì)效益。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下收集味精發(fā)酵廢棄菌體谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，厭氧發(fā)酵 培養(yǎng)基重懸該菌泥，然后轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中，向發(fā)酵罐中的厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基中通入CO2氣體維 持罐內(nèi)正壓(一般可控制通氣量在0. 2 0. 5v/vm)，30°C下，攪拌培養(yǎng)24 40小時(shí)，并維 持厭氧發(fā)酵液的pH在5. 5 7. 0，發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸；其中，所述的厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基包括如 下組分葡萄糖 40 80g/L，K2HPO4 · 3H20 0. 5g/L，KH2PO4 0. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L， FeSO4 · 7H20 6mg/L, MnSO4 · H2O 6mg/L,生物素 0. 2mg/L,維生素 Bl 200 μ g/L, NaHC0342g/L, 初始PH7.0 ；所述的有機(jī)酸為丁二酸、乳酸和乙酸。其中，使用碳酸鹽、氨水和堿液中的任意 一種或幾種的組合維持厭氧發(fā)酵液的pH在5. 5 7. 0。有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)勢(shì)。1、對(duì)本發(fā)明制得的產(chǎn)品進(jìn)行分析，結(jié)果，谷氨酸棒桿菌在厭氧條件下，能顯著的 積累丁二酸、乳酸、乙酸，有機(jī)酸生產(chǎn)強(qiáng)度最高可達(dá)2. ASg*!/1*!^,綜合質(zhì)量產(chǎn)率最高可達(dá) 1. 05g/g(glucose)，因此其產(chǎn)業(yè)化的經(jīng)濟(jì)效益是明顯的。2、利用本發(fā)明的方法，味精好氧發(fā)酵階段結(jié)束時(shí)產(chǎn)生大量的菌體，直接利用其生 產(chǎn)有機(jī)酸，省去了厭氧過(guò)程之前需要富集菌體的過(guò)程，有效的利用了生物質(zhì)資源，降低了生 產(chǎn)成本。發(fā)酵有機(jī)酸后的廢棄菌體，仍可利用現(xiàn)有工藝再生產(chǎn)蛋白飼料添加劑、核酸等，同 樣可滿足實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)在經(jīng)濟(jì)上的要求。3、利用本發(fā)明的方法，在厭氧產(chǎn)酸階段，厭氧環(huán)境降低了整個(gè)過(guò)程中的能量消耗， 同時(shí)每產(chǎn)生一分子丁二酸相對(duì)應(yīng)的將固定一分子的CO2，對(duì)于控制碳排放具有極其重要的
眉、O4、本發(fā)明的生產(chǎn)工藝較原有的單純發(fā)酵有機(jī)酸沒(méi)有增加新的輔料，因此不會(huì)造成 對(duì)環(huán)境的二次污染，同時(shí)減少了原有工藝中味精發(fā)酵廢棄菌體的后處理與有機(jī)酸發(fā)酵富集 菌體的過(guò)程，減少了對(duì)環(huán)境的污染，是環(huán)境友好的工藝方法。5、除L-谷氨酸以外，谷氨酸棒桿菌也廣泛的應(yīng)用于多種氨基酸及其相關(guān)衍生物 的生產(chǎn)，其主要的產(chǎn)品包括L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-谷氨酰胺等。 這些產(chǎn)品的廢棄菌體同樣可利用該方法實(shí)現(xiàn)有機(jī)酸的發(fā)酵，這為谷氨酸棒桿菌在工業(yè)生產(chǎn) 中的綜合開發(fā)利用，乃至微生物發(fā)酵工業(yè)中生物資源的充分利用提供了一種新的思路。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
收集味精工業(yè)用谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum ATCC 10128) 發(fā)酵L-谷氨酸的廢棄菌體，最終獲得生物量10g-dry cell XT10 (OD600nm = 0. 25g-dry cell XL-1)。將菌泥用好氧結(jié)束時(shí)等體積的厭氧培養(yǎng)基充分懸浮，轉(zhuǎn)移至厭氧發(fā)酵罐中，之后 將CO2氣體以0. 2v/vm的通氣速率流入發(fā)酵罐的厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，溫 度控制在30°C，厭氧發(fā)酵24小時(shí)。厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖40g/L, K2HPO4 · 3H20 0. 5g/L，KH2PO4 0. 5g/L， MgSO4 · 7Η200· 5g/L, FeSO4 · 7H20 6mg/L, MnSO4 · H2O 6mg/L,生物素 0. 2mg/L,維生素 Bl 200 μ g/L, NaHCO3 42g/L。初始 pH7. O。發(fā)酵結(jié)果，主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為乳酸、乙酸和丁二酸，其產(chǎn)量分別為6. 72g/L、l. 34g/L、 30. 5g/L，有機(jī)酸生產(chǎn)強(qiáng)度1. eg*!/1*!^,綜合質(zhì)量產(chǎn)率為0. 96g/g (glucose)。實(shí)施例2 收集味精工業(yè)用谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum ATCC 10128) 發(fā)酵L-谷氨酸的廢棄菌體，最終獲得生物量10g-dry cell XT10 (OD600nm = 0. 25g-dry cell XL-1)。將菌泥用好氧結(jié)束時(shí)等體積的厭氧培養(yǎng)基充分懸浮，轉(zhuǎn)移至厭氧發(fā)酵罐中，之后 將CO2氣體以0. 2v/vm的通氣速率流入發(fā)酵罐的厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，溫 度控制在30°C，厭氧發(fā)酵32小時(shí)。厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖80g/L, K2HPO4 · 3H20 0. 5g/L，KH2PO4 0. 5g/L， MgSO4 · 7Η200· 5g/L, FeSO4 · 7H20 6mg/L, MnSO4 · H2O 6mg/L,生物素 0. 2mg/L,維生素 Bl 200 μ g/L, NaHCO3 42g/L。初始 pH7. 0。發(fā)酵結(jié)果，主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為乳酸、乙酸和丁二酸，其產(chǎn)量分別為56.82g/L、3. 15g/ L、19. 28g/L，有機(jī)酸生產(chǎn)強(qiáng)度2. ASg*!/1*!^,綜合質(zhì)量產(chǎn)率為0. 99g/g (glucose)。實(shí)施例3 收集味精工業(yè)用谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum ATCC 10129) 發(fā)酵L-谷氨酸的廢棄菌體，最終獲得生物量10g-dry cell XT10 (OD600nm = 0. 25g-dry cell XL-1)。將處理過(guò)的菌泥用好氧結(jié)束時(shí)等體積的厭氧培養(yǎng)基充分懸浮，轉(zhuǎn)移至厭氧發(fā)酵罐 中，之后將CO2氣體以0. 2v/vm的通氣速率流入發(fā)酵罐的厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速為 200rpm，溫度控制在30°C，厭氧發(fā)酵28小時(shí)。厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖40g/L, K2HPO4 · 3H20 0. 5g/L，KH2PO4 0. 5g/L， MgSO4 · 7Η200· 5g/L, FeSO4 · 7H20 6mg/L, MnSO4 · H2O 6mg/L,生物素 0. 2mg/L,維生素 Bl 200 μ g/L, NaHCO3 42g/L。初始 pH7. 0。發(fā)酵結(jié)果，主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為乳酸、乙酸和丁二酸，其產(chǎn)量分別為16. 84g/L、1. 26g/ L、20. 64g/L，有機(jī)酸生產(chǎn)強(qiáng)度1. SSg*!/1*!^,綜合質(zhì)量產(chǎn)率為0. 97g/g (glucose)。實(shí)施例4 收集味精工業(yè)用谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum ATCC 10129) 發(fā)酵L-谷氨酸的廢棄菌體，最終獲得生物量10g-dry cell XT10 (OD600nm = 0. 25g-dry cell XL-1)。
將處理過(guò)的菌泥用好氧結(jié)束時(shí)等體積的厭氧培養(yǎng)基充分懸浮，轉(zhuǎn)移至厭氧發(fā)酵罐 中，之后將CO2氣體以0. 2v/vm的通氣速率流入發(fā)酵罐的厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速為 200rpm，溫度控制在30°C，厭氧發(fā)酵40小時(shí)。厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖80g/L, K2HPO4 · 3H20 0. 5g/L，KH2PO4 0. 5g/L， MgSO4 · 7Η200· 5g/L, FeSO4 · 7H20 6mg/L, MnSO4 · H2O 6mg/L,生物素 0. 2mg/L,維生素 Bl 200 μ g/L, NaHCO3 42g/L。初始 pH7. 0。發(fā)酵結(jié)果，主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為乳酸、乙酸和丁二酸，其產(chǎn)量分別為33. 98g/L、2. 26g/ L、47. 88g/L，有機(jī)酸生產(chǎn)強(qiáng)度2. Ig*!/1*!^,綜合質(zhì)量產(chǎn)率為1. 05g/g (glucose)。注本發(fā)明實(shí)施例中所采用的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum ATCC10128)和谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum ATCC 10129)均為常規(guī)使用的 菌種，可市售獲得。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
一種利用味精發(fā)酵廢棄菌體生產(chǎn)有機(jī)酸的方法，其特征在于收集味精發(fā)酵廢棄菌體谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基重懸該菌泥，然后轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中，向發(fā)酵罐中的厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基中通入CO2氣體維持罐內(nèi)正壓，30℃下，攪拌培養(yǎng)24～40小時(shí)，并維持厭氧發(fā)酵液的pH在5.5～7.0，發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸；其中，所述的厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下組分葡萄糖40～80g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 6mg/L，MnSO4·H2O 6mg/L，生物素0.2mg/L，維生素B1 200μg/L，NaHCO3 42g/L，初始pH7.0；所述的有機(jī)酸為丁二酸、乳酸和乙酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用味精發(fā)酵廢棄菌體生產(chǎn)有機(jī)酸的方法，其特征在于使用 碳酸鹽、氨水和堿液中的任意一種或幾種的組合維持厭氧發(fā)酵液的pH在5. 5 7. 0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用味精發(fā)酵廢棄菌體生產(chǎn)有機(jī)酸的方法，以味精生產(chǎn)中谷氨酸棒桿菌在好氧條件下發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸好氧過(guò)程結(jié)束后的廢棄菌體回收轉(zhuǎn)入?yún)捬鯒l件生產(chǎn)有機(jī)酸。以厭氧培養(yǎng)基重懸菌泥，接種后將CO2氣體通入發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，攪拌培養(yǎng)24～48小時(shí)，并維持發(fā)酵液的pH在5.5-7.0。對(duì)制得的產(chǎn)品進(jìn)行分析結(jié)果，谷氨酸棒桿菌在厭氧條件下，能顯著的積累丁二酸、乳酸、乙酸。
文檔編號(hào)C12P7/56GK101942486SQ20101027482
公開日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2010年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月7日
發(fā)明者嚴(yán)明, 劉兆星, 李艷, 歐陽(yáng)平凱, 蔡萍, 許晟, 郝寧 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)