專利名稱：重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體rhTNK-tPA的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)重組蛋白分離純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組人組織 型纖溶酶原激活劑TNK突變體rhTNK-tPA的純化方法。
背景技術(shù)：
重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體(recombinant human tissue-type plasminogen activator for TNK mutant,rhTNK-tPA)是利用基因重組技術(shù)在哺乳動(dòng)物細(xì) 胞中表達(dá)生產(chǎn)的新型溶血栓藥物，臨床用于急性心肌梗塞的溶栓治療，是迄今最安全有效 的溶血栓急救藥物。在rhTNK-tPA的生產(chǎn)過程中，純化工藝對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量有重要影響?，F(xiàn)有的t-PA的純化方案主要針對(duì)其分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來確定。利用t-PA的等電點(diǎn) Pl比較高的特點(diǎn)采用離子交換層析法如SP-S印harose，CM-Sepharose等；利用t_PA分子 中組氨酸、半胱氨酸、色氨酸等含量較高的特點(diǎn)可采用金屬螯合層析法如Zr^-Si^pharose、 Zn2+-POROS 20MC等；由于t_PA分子有一賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)可采用賴氨酸親和層析法如 Lysine-Sepharose ；針對(duì)肝素結(jié)合位點(diǎn)可采用肝素親和層析法如H印arin_S印harose， Heparin HyperD等。上述方法均具有載量不高，流速不快，再生過程繁瑣等問題。其它方 法，如單抗親和層析法、苯甲脒親和層析法、疏水親和層析法如Phenyl-Sepharose等、反相 層析法、分子篩法如Sijphacryl S-200等都可以用來純化t_PA，但考慮到t_PA制劑用量較 大，單抗親和層析法和分子篩法不太適用于t-PA的大規(guī)模純化。苯甲脒是用來純化絲氨酸 蛋白酶的，也有人用來純化t-PA或分離單鏈、雙鏈t-PA，但由于其不能用堿清洗，不能進(jìn)行 去除熱原的處理，加之價(jià)格昂貴，用來純化t-PA不夠理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體rhTNK-tPA 的純化方法，該方法載量高，流速快，再生容易，過程簡(jiǎn)便、成本低。本發(fā)明的上述目的是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種重組人組織型纖溶酶原激 活劑TNK突變體rhTNK-tPA的純化方法，包含以下步驟(1)將rhTNK-tPA的細(xì)胞培養(yǎng)液過濾后取上清液，經(jīng)Blue Sepharose 6FastFlow 親和柱層析后，用洗脫液a洗脫后得含目標(biāo)峰的洗脫液al ；(2)將步驟⑴所得的含目標(biāo)峰的洗脫液al進(jìn)行Lysine HyperD親和柱層析后， 用洗脫液b洗脫得含目標(biāo)峰的洗脫液bl ；(3)取步驟⑵所得的含目標(biāo)峰的洗脫液bl進(jìn)行S印hadex G_25凝膠過濾，經(jīng)洗 脫液c洗脫后即得純化后的重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體rhTNK-tPA。本發(fā)明步驟(1)中在Blue Sepharose 6Fast Flow親和柱層析時(shí)，按 BlueSepharose 6 Fast Flow 對(duì) rhTNK-tPA 的結(jié)合量以 6-lOmg/ml ±真料計(jì)，洗脫液 a 的組 成是20-100mM磷酸鹽緩沖液、1-2M的氯化鈉溶液、2-5M尿素、0. 04%吐溫80，洗脫液的pH值為7. 0-9. 0，洗脫液a的用量是1. 5-3倍柱體積。本發(fā)明步驟(1)中在進(jìn)行Blue Sepharose 6Fast Flow親和柱層析前，需用緩沖 液對(duì)Blue Sepharose 6Fast Flow層析柱進(jìn)行平衡和除雜處理，平衡時(shí)緩沖液的組分為 IO-IOOmM磷酸鹽和0. 04%的吐溫80緩沖液，其用量是柱體積的1. 5-3倍，除雜時(shí)緩沖液的 組分為IO-IOOmM磷酸鹽緩沖液、0. 04%的吐溫80和1-3M的氯化鈉溶液，其用量是柱體積 的1. 5-3倍。本發(fā)明步驟(1)中所得含目標(biāo)峰的洗脫液al需稀釋2-9倍后再進(jìn)行 LysineHyperD親和柱層析。本發(fā)明步驟(2)中在進(jìn)行Lysine HyperD親和柱層析時(shí)，按Lysine HyperD對(duì) rhTNK-tPA的結(jié)合量以6-10mg/ml填料計(jì)，洗脫液b的組成是20_100mM磷酸鹽緩沖液、 0. 1-0. 5M 6-氨基正己酸、0. 1-0. 5M精氨酸、0.04%吐溫80，洗脫液的PH值為7. 0-9.0，洗 脫液b的用量是1. 5-3倍柱體積。本發(fā)明步驟(2)中在進(jìn)行Lysine HyperD親和柱層析前，需用緩沖液對(duì) LysineHyperD層析柱進(jìn)行平衡和除雜處理，平衡時(shí)緩沖液的組分為IO-IOOmM磷酸鹽和 0. 04%的吐溫80緩沖液，其用量是柱體積的1. 5-3倍，除雜時(shí)的緩沖液的組分為IO-IOOmM 磷酸鹽緩沖液、0. 04%的吐溫80和1-3M的氯化鈉溶液，其用量是柱體積的1. 5-3倍。本發(fā)明步驟(3)中在進(jìn)行S^hadex G_25凝膠過濾時(shí)，洗脫液c的組分是 0. 1-0. 5M精氨酸和0. 04% Tween 80，pH值是7. 0-9. 0，洗脫液c的用量是1. 5-3倍柱體積。本發(fā)明步驟(3)中在進(jìn)行S印hadex G_25凝膠過濾前，需用緩沖液對(duì) SephadexG-25層析柱進(jìn)行平衡處理，平衡時(shí)的緩沖液的組分是0. 1-0. 5M精氨酸和0. 04% 吐溫80，pH值是7. 0-9. 0，緩沖液的用量是1. 5-3倍柱體積。本發(fā)明步驟(3)制備的純化后的重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體 rhTNK-tPA的純度大于98%。本發(fā)明的純化原理是rhTNK_tPA為糖基化蛋白，可與Blue Sepharose 6FastFl0W填料特異性結(jié)合；rhTNK-tPA含有賴氨酸口袋，可與lysine HyperD特異性結(jié)合； 其分子量為68KDa，可通過S印hadex G_25Medium過濾進(jìn)行脫鹽。具體為根據(jù)rhTNK-tPA 的純化方案主要針對(duì)其分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來確定，總體方案是先快速濃縮粗純化，再進(jìn)行精純 化。rhTNK-tPA由CHO細(xì)胞表達(dá)，目的蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)上清中的相對(duì)濃度較低，加上樣品 體積大，第一步純化方法必須要處理量大，速度快。要達(dá)到這一目的，使用的層析填料必 須具備對(duì)rhTNK-tPA的結(jié)合量大和流速快的特點(diǎn)。Blue Sepharose 6Fast Flow填料的 載量為6-10mg/ml，其洗水、平衡流速為200cm/h，上樣流速為180cm/h ；與SP-S印harose、 Zn2+-Sepharose, Zn2+-P0R0S 20M等填料相比，其具有載量更高，流速更快、再生更方便的 特點(diǎn)。第二步的精純化必須對(duì)目標(biāo)蛋白具有非常好的特異性，針對(duì)t-PA中含有的賴氨酸 口袋，一般都會(huì)使用賴氨酸相關(guān)填料，通過對(duì)比Lysine-S印harose和Lysine HyperD，發(fā)現(xiàn) Lysine HyperD的載量更高、流速更快；此外用Lysine HyperD精純化時(shí)，rhTNK-tPA的純度 更高。由于Lysine HyperD層析的洗脫峰緩沖液不符合本制品成品配方的要求，所以再利 用S印hadex G-25進(jìn)行脫鹽處理，將rhTNK-tPA置換到最終緩沖液。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)(I)Blue Sepharose 6Fast Flow層析具有載量高，流速快，再生方便，濃縮和純化效果顯著等特點(diǎn)，經(jīng)過Blue Sepharose 6Fast Flow層析，樣品體積可縮小100倍以上；(2)rhTNK-tPA的純化效率高，純化后的rhTNK_tPA占總蛋白量的98%以上，單體 純度大于95%，比活達(dá)到50萬IU/mg ；(3)操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，可線性放大，緩沖液所用原料價(jià)格低廉，能用于大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，以下試劑如無特殊說明均為市售。實(shí)施例1本實(shí)施例提供的重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體rhTNK-tPA的純化方法 如下(1)上清預(yù)處理收獲細(xì)胞在反應(yīng)器中的無血清培養(yǎng)上清，用微孔濾膜過濾去除 細(xì)胞碎片，以保護(hù)純化填料；(2) Blue Sepharose 6Fast Flow親和柱層析用緩沖液A平衡2. 5倍柱體積，緩 沖液A的組分為20mM磷酸鹽緩沖液和0. 04%吐溫80，pH7. 2 ；上樣；用緩沖液A沖洗2. 5 倍柱體積；用緩沖液B洗出雜蛋白，緩沖液B的組分為緩沖液A的基礎(chǔ)上加入2M NaCl ；使 用2. 5倍柱體積的緩沖液C洗脫得到目標(biāo)峰，緩沖液C的組分為20mM磷酸鹽、IMNaCl、2M尿 素和0. 04%吐溫80，pH7. 20 ；目標(biāo)峰使用磷酸鹽緩沖液稀釋2倍后進(jìn)行Lysine HyperD層 析；(3) Lysine HyperD 親和柱層析平衡和上樣過程與 Blue Sepharose 6Fast Flow 層析一致，完成后使用2. 5倍柱體積的緩沖液D洗出雜蛋白，緩沖液D的組分為緩沖液A 的基礎(chǔ)上加入IM NaCl ；使用2. 5倍柱體積的緩沖液E洗脫得到目標(biāo)峰，緩沖液E的組分 為20mM磷酸鹽、0. IM 6-氨基正己酸、0. 2M精氨酸、0. 04 %吐溫80，pH7. 0 ；目標(biāo)峰進(jìn)行 Sephadex G_25Medium 凝膠過濾；(4) Sephadex G-25Medium凝膠過濾使用2. 5倍柱體積緩沖液F進(jìn)行平衡，緩沖 液F的組分為0. IM精氨酸和0. 04%吐溫80，pH7. 0 ；使用25%柱體積的樣品進(jìn)行上樣，再 用緩沖液F將目標(biāo)蛋白洗脫下來，得到符合要求的rhTNK-tPA溶液，制備的純化后的重組人 組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的純度大于98%。所有使用的緩沖液中，均含有體積百分含量為0. 04%的吐溫80。實(shí)施例2 本實(shí)施例提供的重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體rhTNK-tPA的純化方法 如下(1)將rhTNK-tPA的細(xì)胞培養(yǎng)液過濾后取上清液，經(jīng)Blue Sepharose 6FastFlow 親和柱層析后，用洗脫液a洗脫后得含目標(biāo)峰的洗脫液al ；(2)將步驟⑴所得的含目標(biāo)峰的洗脫液al進(jìn)行Lysine HyperD親和柱層析后， 用洗脫液b洗脫得含目標(biāo)峰的洗脫液bl ；(3)取步驟(2)所得的含目標(biāo)峰的洗脫液bl進(jìn)行S印hadex G_25凝膠過濾，經(jīng)洗 脫液c洗脫后即得純化后的重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體rhTNK-tPA。
步驟(1)中在Blue Sepharose 6Fast Flow 親和柱層析時(shí)，按 Blue Sepharose 6Fast Flow對(duì)rhTNK_tPA的結(jié)合量以6_10mg/ml填料計(jì)，洗脫液a的組成是50mM磷酸鹽 緩沖液、1. 5M的氯化鈉溶液、3M尿素、0. 04%吐溫80，洗脫液的pH值為8. 0，洗脫液a的用 量是2倍柱體積。步驟(1)中在進(jìn)行Blue Sepharose 6Fast Flow親和柱層析前，需用緩沖液對(duì) Blue Sepharose 6Fast Flow層析柱進(jìn)行平衡和除雜處理，平衡時(shí)緩沖液的組分為50mM磷 酸鹽和0. 04%的吐溫80緩沖液，其用量是柱體積的2倍，除雜時(shí)緩沖液的組分為50mM磷酸 鹽緩沖液、0. 04%的吐溫80和1. 5M的氯化鈉溶液，其用量是柱體積的2倍。步驟(1)中所得含目標(biāo)峰的洗脫液al需稀釋5倍后再進(jìn)行Lysine HyperD親和 柱層析。步驟(2)中在進(jìn)行Lysine HyperD 親和柱層析時(shí)，按 Lysine HyperD 對(duì) rhTNK-tPA 的結(jié)合量以6-10mg/ml填料計(jì)，洗脫液b的組成是50mM磷酸鹽緩沖液、0. 3M 6-氨基正己 酸、0. 3M精氨酸、0. 04%吐溫80，洗脫液的pH值為8. 0，洗脫液b的用量是2倍柱體積。步驟(2)中在進(jìn)行Lysine HyperD親和柱層析前，需用緩沖液對(duì)Lysine HyperD 層析柱進(jìn)行平衡和除雜處理，平衡時(shí)緩沖液的組分為50mM磷酸鹽和0. 04%的吐溫80緩沖 液，其用量是柱體積的2倍，除雜時(shí)的緩沖液的組分為50mM磷酸鹽緩沖液、0. 04%的吐溫80 和1. 5M的氯化鈉溶液，其用量是柱體積的2倍。步驟(3)中在進(jìn)行Si^phadex G_25凝膠過濾時(shí)，洗脫液c的組分是0. 3M精氨酸和 0. 04% Tween 80，pH值是8. 0，洗脫液c的用量是2倍柱體積。步驟(3)中在進(jìn)行S印hadex G-25凝膠過濾前，需用緩沖液對(duì)S印hadex G-25層 析柱進(jìn)行平衡處理，平衡時(shí)的緩沖液的組分是0. 3M精氨酸和0. 04%吐溫80，pH值是8. 0， 緩沖液的用量是2倍柱體積。步驟(3)制備的純化后的重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體rhTNK-tPA的 純度大于98%。實(shí)施例3本實(shí)施例提供的重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體rhTNK-tPA的純化方法 如下(1)上清預(yù)處理收獲細(xì)胞在反應(yīng)器中的無血清培養(yǎng)上清，用微孔濾膜過濾去除 細(xì)胞碎片，以保護(hù)純化填料；(2)取rhTNK-tPA上清液，經(jīng)Blue Sepharose 6Fast Flow親和柱層析后，用洗脫 液a洗脫后得含目標(biāo)峰的洗脫液al ；(3)將步驟⑴所得含目標(biāo)峰的洗脫液al進(jìn)行Lysine HyperD親和柱層析后，用 洗脫液b洗脫得含目標(biāo)峰的洗脫液bl ；(4)取步驟(2)所得含目標(biāo)峰的洗脫液bl進(jìn)行S印hadex G_25凝膠過濾，經(jīng)洗脫 液c洗脫后即得純化后的重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體。在上述步驟中步驟(2)中在Blue Sepharose 6Fast Flow 親和柱層析時(shí)，按 Blue Sepharose 6FastFlow對(duì)rhTNK-tPA的結(jié)合量以6_10mg/ml填料計(jì)，洗脫液a的組成是100mM磷酸鹽
6緩沖液、2M的氯化鈉溶液、5M尿素、0. 04%吐溫80，洗脫液的pH值為9. 0，洗脫液a的用量 是1.5倍柱體積。步驟(2)中在進(jìn)行Blue Sepharose 6Fast Flow親和柱層析前，需用緩沖液對(duì) Blue Sepharose 6Fast Flow層析柱進(jìn)行平衡和除雜處理，平衡時(shí)緩沖液的組分為IOOmM磷 酸鹽和0. 04%的吐溫80緩沖液，其用量是柱體積的1. 5倍，除雜時(shí)緩沖液的組分為IOOmM 磷酸鹽緩沖液、0. 04%的吐溫80和3M的氯化鈉溶液，其用量是柱體積的1. 5倍。步驟⑵中所得含目標(biāo)峰的洗脫液al需稀釋9倍后再進(jìn)行Lysine HyperD親和 柱層析。步驟(3)中在進(jìn)行Lysine HyperD 親和柱層析時(shí)，按 Lysine HyperD 對(duì) rhTNK-tPA 的結(jié)合量以6-10mg/ml填料計(jì)，洗脫液b的組成是100mM磷酸鹽緩沖液、0. 5M 6-氨基正己 酸、0. 5M精氨酸、0. 04%吐溫80，洗脫液的pH值為9. 0，洗脫液b的用量是1. 5倍柱體積。步驟(3)中在進(jìn)行Lysine HyperD親和柱層析前，需用緩沖液對(duì)Lysine HyperD 層析柱進(jìn)行平衡和除雜處理，平衡時(shí)緩沖液的組分為IOOmM磷酸鹽和0. 04%的吐溫80緩沖 液，其用量是柱體積的1.5倍，除雜時(shí)的緩沖液的組分為IOOmM磷酸鹽緩沖液、0. 04%的吐 溫80和3M的氯化鈉溶液，其用量是柱體積的1. 5倍。步驟⑷中在進(jìn)行S印hadex G_25凝膠過濾時(shí)，洗脫液c的組分是0. 5M精氨酸和 0. 04% Tween 80，pH值是8. 5，洗脫液c的用量是1. 5倍柱體積。步驟(4)中在進(jìn)行S印hadex G-25凝膠過濾前，需用緩沖液對(duì)S印hadex G-25層 析柱進(jìn)行平衡處理，平衡時(shí)的緩沖液的組分是0. 5M精氨酸和0. 04%吐溫80，pH值是9. 0， 緩沖液的用量是1. 5倍柱體積。步驟(4)制備的純化后的重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體rhTNK-tPA的 純度大于98%。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體rhTNK tPA的純化方法，其特征在于包含以下步驟(1)將rhTNK tPA的細(xì)胞培養(yǎng)液過濾后取上清液，經(jīng)Blue Sepharose 6FastFlow親和柱層析后，用洗脫液a洗脫后得含目標(biāo)峰的洗脫液a1；(2)將步驟(1)所得的含目標(biāo)峰的洗脫液a1進(jìn)行Lysine HyperD親和柱層析后，用洗脫液b洗脫得含目標(biāo)峰的洗脫液b1；(3)取步驟(2)所得的含目標(biāo)峰的洗脫液b1進(jìn)行Sephadex G 25凝膠過濾，經(jīng)洗脫液c洗脫后即得純化后的重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體rhTNK tPA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于步驟(1)中在BlueSepharose6Fast Flow親和柱層析時(shí)，按Blue Sepharose 6Fast Flow對(duì)rhTNK-tPA的結(jié)合量以6_10mg/ml填 料計(jì)，洗脫液a的組成是20-100mM磷酸鹽緩沖液、1-2M的氯化鈉溶液、2-5M尿素、0. 04% 吐溫80，洗脫液的pH值為7. 0-9. 0，洗脫液a的用量是1. 5-3倍柱體積。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的純化方法，其特征在于步驟(1)中在進(jìn)行BlueSepharose 6Fast Flow親和柱層析前，需用緩沖液對(duì)Blue Sepharose 6Fast Flow層析柱進(jìn)行平衡和 除雜處理，平衡時(shí)緩沖液的組分為IO-IOOmM磷酸鹽緩沖液和0. 04%的吐溫80，其用量是柱 體積的1. 5-3倍，除雜時(shí)緩沖液的組分為IO-IOOmM磷酸鹽緩沖液、0. 04%的吐溫80和1-3M 的氯化鈉溶液，其用量是柱體積的1. 5-3倍。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于步驟(1)中所得含目標(biāo)峰的洗脫液 al需稀釋2-9倍后再進(jìn)行Lysine HyperD親和柱層析。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于步驟(2)中在進(jìn)行LysineHyperD親 和柱層析時(shí)，按Lysine HyperD對(duì)rhTNK-tPA的結(jié)合量以6-lOmg/ml填料計(jì)，洗脫液b的組 成是20-100mM磷酸鹽緩沖液、0. 1-0. 5M 6-氨基正己酸、0. 1-0. 5M精氨酸、0. 04%吐溫80， 洗脫液的PH值為7. 0-9. 0，洗脫液b的用量是1. 5-3倍柱體積。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的純化方法，其特征在于步驟(2)中在進(jìn)行LysineHyperD親 和柱層析前，需用緩沖液對(duì)Lysine HyperD層析柱進(jìn)行平衡和除雜處理，平衡時(shí)緩沖液的組 分為IO-IOOmM磷酸鹽緩沖液和0. 04%的吐溫80，其用量是柱體積的1. 5-3倍，除雜時(shí)的緩 沖液的組分為IO-IOOmM磷酸鹽緩沖液、0. 04%的吐溫80和1-3M的氯化鈉溶液，其用量是 柱體積的1.5-3倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于步驟(3)中在進(jìn)行S印hadexG-25凝 膠過濾時(shí)，洗脫液c的組分是0. 1-0. 5M精氨酸和0.04% Tween 80，pH值是7. 0-9. 0，洗脫 液c的用量是1. 5-3倍柱體積。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的純化方法，其特征在于步驟(3)中在進(jìn)行S印hadexG-25凝 膠過濾前，需用緩沖液對(duì)S^hadex G-25層析柱進(jìn)行平衡處理，平衡時(shí)的緩沖液的組分是 0. 1-0. 5M精氨酸和0. 04%吐溫80，pH值是7. 0-9. 0，緩沖液的用量是1. 5-3倍柱體積。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于步驟(3)制備的純化后的重組人組 織型纖溶酶原激活劑TNK突變體rhTNK-tPA的純度大于98%。
全文摘要
一種重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體rhTNK-tPA的純化方法，其包含以下步驟(1)將rhTNK-tPA的細(xì)胞培養(yǎng)液過濾后取上清液，經(jīng)Blue Sepharose 6Fast Flow親和柱層析后，用洗脫液a洗脫后得含目標(biāo)峰的洗脫液a1；(2)將步驟(1)所得的含目標(biāo)峰的洗脫液a1進(jìn)行Lysine HyperD親和柱層析后，用洗脫液b洗脫得含目標(biāo)峰的洗脫液b1；(3)取步驟(2)所得的含目標(biāo)峰的洗脫液b1進(jìn)行Sephadex G-25凝膠過濾，經(jīng)洗脫液c洗脫后得純化的重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體rhTNK-tPA。該方法載量高，流速快，再生容易，過程簡(jiǎn)便、成本低，可線性放大，可用于大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N9/48GK101942429SQ20101026386
公開日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2010年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月25日
發(fā)明者吳宜南, 曹鳳蘭, 楊琴, 梁銀冰, 王志堅(jiān), 董珣 申請(qǐng)人:廣州銘康生物工程有限公司