專利名稱：一種豬瘟病毒核酸標準物質(zhì)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豬瘟病毒核酸標準物質(zhì)的制備方法，屬于標準物質(zhì)技術(shù)和獸用生物制 品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬瘟(ClassicalSwine Fever，CSF)是由豬癌病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的一種高度接觸性、致死性的豬傳染病，在世界上很多國家和地區(qū)均有發(fā) 生，給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將豬瘟列為法定通報 性疫病，我國將其劃為一類動物傳染病。隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)發(fā)展，RT-PCR、熒光定量PCR等檢測技術(shù)也逐漸廣泛應(yīng) 用于豬瘟病毒檢測。這類技術(shù)通過檢測病毒特異性的核酸片段來檢測豬瘟病毒，具有靈敏 性高、檢測快速等優(yōu)點；但也易受試劑盒質(zhì)量、核酸提取、翻轉(zhuǎn)錄效率、核酸污染、RNA酶污 染等影響，實驗結(jié)果往往因為試劑質(zhì)量、人員的經(jīng)驗和能力以及實驗設(shè)施、環(huán)境的影響而存 在較大誤差，嚴重制約了檢測結(jié)果的準確性，因此亟需使用標準物質(zhì)作為客觀、公正的標 尺，用于檢測試劑盒產(chǎn)品的質(zhì)量控制、科學(xué)研究與實驗室診斷的參照以及實驗室之間的能 力比對。然而，由于豬瘟病毒核酸標準物質(zhì)的質(zhì)量要求很高，制備程序和檢驗、標定方法嚴 格，有關(guān)制備程序和標定方法至今未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種豬瘟病毒核酸標準物質(zhì)的制備方法。本發(fā)明包括以下技術(shù)方案(1)選擇豬瘟病毒基因保守區(qū)為擴增靶區(qū)，與一般PCR或熒光PCR檢測的目標片段 相適應(yīng)；(2)設(shè)計、合成針對該基因保守區(qū)的上下游引物；(3)目標序列擴增用RNA提取試劑盒提取病毒液(組織)總RNA ；用隨機引物反 轉(zhuǎn)錄，獲得總cDNA ；再用病毒特異的上下游引物擴增目標片段；通過核酸電泳檢測擴增產(chǎn) 物；(4)目的基因的克隆將擴增產(chǎn)物用純化試劑盒純化、回收；將目的基因片段克隆 至載體；轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌；涂于篩選培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12-16h ；挑取轉(zhuǎn)化成功的菌落， 接種于液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)12 16h ；用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，雙向測序鑒 定；(5)體外轉(zhuǎn)錄對提取的質(zhì)粒酶切；回收含啟動子和目的基因的DNA片段；用轉(zhuǎn)錄 試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄；加入DNase去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的DNA ；重新提取、純化RNA ；在無RNA酶 的水中重溶RNA ；(6)分裝將重溶的RNA分裝至無RNA酶的小管中，20 μ L/管，_80°C凍存；(7) RNA拷貝數(shù)測定取體外轉(zhuǎn)錄的RNA (6)，用無RNA酶滅菌水作10倍和100倍稀釋，測定其在260nm和280nm的吸光度值(OD)，根據(jù)吸光值及稀釋倍數(shù)計算體外轉(zhuǎn)錄樣品濃 度，必要時可測定多次統(tǒng)計分析；根據(jù)已知RNA核酸序列，推算單個RNA模板的分子量；根 據(jù)樣品濃度和單個RNA分子量計算RNA單位體積內(nèi)的拷貝數(shù)；(8)檢驗1)均勻性試驗從樣品隨機選取一定數(shù)量的樣品(根據(jù)統(tǒng)計需要)，檢測每個樣品 單位體積RNA拷貝數(shù)，對結(jié)果進行統(tǒng)計分析，要求各樣品的檢測值之間經(jīng)統(tǒng)計分析無顯著
差異；2)穩(wěn)定性試驗每隔一定時間隨機抽取樣品進行檢測，根據(jù)單位體積RNA拷貝數(shù) 下降情況，計算其保存期；(9)協(xié)作標定將樣品分發(fā)國內(nèi)相關(guān)機構(gòu)，讓各單位檢測收到的樣品單位體積RNA 拷貝數(shù)；(10)定值對所有樣品的測定結(jié)果進行統(tǒng)計、分析，剔除異常值；確定該標準物質(zhì) 最終的單位體積RNA拷貝數(shù)。本發(fā)明的詳細描述1.選擇豬瘟病毒基因保守區(qū)5’端非編碼區(qū)(5’ UTR)為擴增靶區(qū)。2.設(shè)計、合成引物Al :5，-AGT ACA GGG TAG TCG TCA GTG GTT CG-3，；A2 5' -CTG CTG TAC ATG GCA CAT GGA GTT G-3'；由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，用DEPC水配成0. 25 μ Μ, -20°C保存?zhèn)溆谩?.目標序列擴增用TRIzol Reagent試劑盒(購自Invitrogen公司)提取病毒液(組織)總RNA ； 取 10μ1 RNA，加入 2μ1 Oligo(dT)和 8μ 1 反轉(zhuǎn)錄液(5XBuffer 4μ1，2μ1 DTT，1 μ 1 dNTP，0. 5μ 1 反轉(zhuǎn)錄酶，0. 5 μ 1 RNasin)，按 42°C 60min、70°C /15min 反轉(zhuǎn)錄，獲得總 cDNA ；取10μ1 cDNA，加入 29μ1 H20,95°C 預(yù)變性 5min，加入 11 μ 1 PCR 液(10 X Buffer 5μ 1, Al 1 μ 1, Α2 1 μ 1，dNTP 2μ 1，Taq 酶 2μ 1)，按 94 °C/lmin，57 "C /lmin, 72°C /lmin40S進行35個循環(huán)；最后再72°C延伸IOmin ；取5 10 μ 1擴增產(chǎn)物進行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn) 目標條帶則表明擴增成功(如圖1)。4.目的基因的克隆將擴增產(chǎn)物用純化試劑盒純化、回收；將目的基因片段克隆至pGEM-T Easy載體 (購自Promega公司)；轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109 (購自Promega公司)；涂于含有X-Gal和IPTG的AMP+LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)12 16h ；隨機挑取3 4 個白色單菌落，接種于AMP+LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)12 16h ；用 Wizard Plus Minipreps DNA Purification System 試劑盒(購自 Promega 公 司)提取重組質(zhì)粒，送至北京華大中生科技發(fā)展有限公司雙向測序鑒定，結(jié)果與設(shè)計的目 的基因片段序列一致。5.體外轉(zhuǎn)錄對提取的質(zhì)粒用Pvu II酶切；用DNA片段回收試劑盒回收含T7啟動子和目的基
4因的DNA片段；用 Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System_T7 試劑盒(購自 Promega 公司)進行體外轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系如下T7 Transcription 5 X Buffer 20 μ 1, dNTP 30 μ 1, Linear DNA template 5 μ 1, Enzyme Mix (Τ7) 10 μ 1，補充 DEPC 水至 100 μ 1，37°C/5h ；加入DNase 37°C /15min去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的DNA ；用TRIzol Reagent試劑盒(購自Invitrogen公司)重新提取、純化RNA ；在DEPC 水中重溶RNA。6.分裝將重溶的RNA分裝至DEPC水處理過的小管中，20 μ L/管，_80°C凍存。7. RNA拷貝數(shù)測定制備的RNA樣品經(jīng)10倍和100倍稀釋，吸光光度值測定結(jié)果是10倍稀釋，0D260 =0. 44406，濃度為 35. 5248 μ g/ml ； 100 倍稀釋，0D260 = 0. 03481，濃度為 3. 4827 μ g/ml ； 根據(jù)核酸序列推算出單鏈模板的分子量MW = 669. 40kDa ；經(jīng)計算，得出每管RNA分子的拷 貝數(shù)為3. 11 X IO12拷貝/20 μ L·8.豬瘟病毒核酸標準物質(zhì)檢驗和定值(1)均勻性試驗從樣品隨機選取10支樣品，檢測每個樣品單位體積RNA拷貝數(shù)， 結(jié)果見表1。經(jīng)統(tǒng)計分析，各樣品之間無顯著差異，表明該批樣品均勻性良好。(2)穩(wěn)定性試驗每隔1周隨機抽取樣品進行檢測，結(jié)果11周后檢測結(jié)果與第1個 月檢測結(jié)果無顯著差異，說明該樣品穩(wěn)定性良好，經(jīng)推測，其穩(wěn)定保存期在5年以上。(3)協(xié)作標定將樣品分發(fā)國內(nèi)相關(guān)機構(gòu)，讓各單位檢測收到的樣品單位體積RNA 拷貝數(shù)；結(jié)果見表2。(4)定值對所有樣品的測定結(jié)果進行統(tǒng)計、分析，剔除異常值；確定該標準物質(zhì) 最終單位體積RNA拷貝數(shù)為3. 11 士0. 027 X IO12拷貝/20 μ 1。本發(fā)明的積極意義本發(fā)明涉及一種豬瘟病毒核酸標準物質(zhì)的制備方法。應(yīng)用本發(fā)明制備的豬瘟病毒 核酸標準物質(zhì)具有以下優(yōu)點和用途(1)以豬瘟病毒基因序列的高度保守區(qū)為擴增靶區(qū)，與一般PCR或熒光PCR檢測的 目標片段相適應(yīng)，特異性好，適用范圍廣，并且不會泄露我國豬瘟病毒特有的基因信息；(2)利用本發(fā)明制備的豬瘟病毒核酸標準物質(zhì)無感染性，沒有生物安全風(fēng)險，可以 廣范應(yīng)用，適用范圍廣、安全性高；(3)利用本發(fā)明制備的豬瘟病毒核酸標準物質(zhì)是RNA片段而不是DNA片段或質(zhì)粒， 與豬瘟病毒原有核酸種類保持了一致，可以充分控制受試者的實驗條件和實驗過程；(4)利用本發(fā)明制備的豬瘟病毒核酸標準物質(zhì)經(jīng)測定和計算得出的拷貝數(shù)定值準 確，而且經(jīng)過協(xié)作標定定值，更增加了其可信度；(5)利用本發(fā)明制備的豬瘟病毒核酸標準物質(zhì)可以根據(jù)已知的拷貝數(shù)稀釋成單位 體積含有不同拷貝數(shù)的一系列樣品，用于RT-PCR或熒光定量PCR診斷試劑的質(zhì)量控制、科 學(xué)研究與實驗室診斷的對照以及實驗室之間的能力比對。


圖ICSFV 5’ UTR擴增結(jié)果 圖中所示M_DL2000marker 病毒培養(yǎng)液擴增產(chǎn)物；2_未接種病毒培養(yǎng)液擴增產(chǎn)物 實施例實施例11.選擇豬瘟病毒基因保守區(qū)5’端非編碼區(qū)(5’ UTR)為擴增靶區(qū)。2.設(shè)計、合成引物:A1 5'-AGT ACA GGG TAG TCG TCA GTG GTT CG_3，;A2 5'-CTG CTG TAC ATG GCA CAT GGA GTT G_3，；由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，用DEPC水配成 0. 25 μ M，_20°C保存?zhèn)溆谩?.目標序列擴增用TRIzol Reagent試劑盒(購自Invitrogen公司)提取病 毒液(組織)總RNA ；取10 μ 1 RNA,加入2 μ 1 Oligo (dT)和8 μ 1反轉(zhuǎn)錄液(5XBuffer 4μ1，2μ1 DTT, 1 μ 1 dNTP，0. 5 μ 1 反轉(zhuǎn)錄酶，0. 5 μ 1 RNasin)，按 42°C 60min、70°C/15min 反轉(zhuǎn)錄，獲得總cDNA ；取10 μ IcDNA,加入29 μ 1 H20,95°C預(yù)變性5min,加入11 μ 1 PCR液 (10 X Buffer 5μ1，Α1 1 μ 1,Α2 1 μ l,dNTP 2 μ 1，Taq酶 2 μ 1)，按 94°C/lmin, 57°C/lmin， 72°C /lmin40S進行35個循環(huán)；最后再72°C延伸IOmin ；取5 10 μ 1擴增產(chǎn)物進行0. 8% 瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)目標條帶則表明擴增成功(如圖1)。4.目的基因的克隆將擴增產(chǎn)物用純化試劑盒純化、回收；將目的基因片段克隆 至pGEM-T Easy載體(購自Promega公司)；轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109 (購自Promega公 司)；涂于含有X-Gal和IPTG的AMP+LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)12 16h ；隨機挑取3_4個白 色單菌落，接種于AMP+LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)12 16h ；用Wizard Plus Minipreps DNAPurification System試劑盒(購自Promega公司)提取重組質(zhì)粒，送至北京華大中生 科技發(fā)展有限公司雙向測序鑒定，結(jié)果與設(shè)計的目的基因片段序列一致。5.體外轉(zhuǎn)錄對提取的質(zhì)粒用Pvu II酶切；用DNA片段回收試劑盒回收含T7啟 動子和目的基因的 DNA 片段；用 Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System_T7 試 劑盒(購自Promega公司)進行體外轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系如下T7 Transcription 5 X Buffer 20 μ 1, dNTP 30 μ 1, Linear DNA template 5 μ 1, Enzyme Mix (Τ7) 10 μ 1，_卜胃 DEPC m 100 μ 1，37°C /5h ；加入 DNase37°C /15min 去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的 DNA ；用 TRIzol Reagent 試劑 盒(購自Invitrogen公司)重新提取、純化RNA ；在DEPC水中重溶RNA。6.分裝將重溶的RNA分裝至DEPC水處理過的小管中，20 μ L/管，_80°C凍存。實施例2RNA拷貝數(shù)測定制備的RNA樣品經(jīng)10倍和100倍稀釋，吸光光度值測定結(jié)果是10倍稀釋，0D260 =0. 44406，濃度為 35. 5248 μ g/ml ；100 倍稀釋，0D260 = 0. 03481，濃度為 3. 4827 μ g/ml ； 根據(jù)核酸序列推算出單鏈模板的分子量MW = 669. 40kDa ；經(jīng)計算，得出每管RNA分子的拷 貝數(shù)為3. 11 X IO12拷貝/20 μ L·實施例3豬瘟病毒核酸標準物質(zhì)檢驗和定值1.均勻性試驗從樣品隨機選取10支樣品，檢測每個樣品單位體積RNA拷貝數(shù)， 結(jié)果見表1。經(jīng)統(tǒng)計分析，各樣品之間無顯著差異，表明該批樣品均勻性良好。表IRNA樣品拷貝數(shù)(X IO12拷貝/20 μ 1)
6

3.13 3.11 3.09 3.07 3.12 3.07 3.08 3.14 3.12 3. 09 3.10±0.0252.穩(wěn)定性試驗每隔1周隨機抽取樣品進行檢測，結(jié)果11周后檢測結(jié)果與第1個 月檢測結(jié)果無顯著差異，說明該樣品穩(wěn)定性良好，經(jīng)推測，其穩(wěn)定保存期在5年以上。3.協(xié)作標定將樣品分發(fā)國內(nèi)相關(guān)機構(gòu)，讓各單位檢測收到的樣品單位體積RNA 拷貝數(shù)；結(jié)果見表2。表2各協(xié)作單位測定的RNA樣品拷貝數(shù)(X1012拷貝/20 μ 1) 4.定值對所有樣品的測定結(jié)果進行統(tǒng)計、分析，剔除異常值；確定該標準物質(zhì)最 終單位體積RNA拷貝數(shù)為3. 11 ±0. 027X IO12拷貝/20 μ 1。
權(quán)利要求
一種豬瘟病毒核酸標準物質(zhì)的制備方法，其特征在于包括以下技術(shù)步驟(1)選擇豬瘟病毒基因保守區(qū)為擴增靶區(qū)；(2)設(shè)計、合成針對該基因保守區(qū)的上下游引物；(3)目標序列擴增提取病毒液或組織的總RNA；用隨機引物反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA；再用上下游引物擴增目標片段；電泳檢測擴增產(chǎn)物；(4)目的基因的克隆將擴增產(chǎn)物純化、回收；將目的基因片段克隆至載體；轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞；挑取轉(zhuǎn)化成功的菌落，大量培養(yǎng)；提取重組質(zhì)粒，雙向測序鑒定；(5)體外轉(zhuǎn)錄對提取的質(zhì)粒酶切；回收含啟動子和目的基因的DNA片段；用轉(zhuǎn)錄試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄；加入DNase去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的DNA；重新提取、純化RNA；在無RNA酶的水中重溶RNA；(6)分裝將重溶的RNA分裝至無RNA酶的小管中，20μL/管， 80℃凍存；(7)RNA拷貝數(shù)測定取體外轉(zhuǎn)錄的RNA，用無RNA酶滅菌水作10倍和100倍稀釋，測定其在260nm和280nm的OD值，計算體外轉(zhuǎn)錄樣品濃度；根據(jù)已知RNA核酸序列，推算單個RNA模板的分子量，計算RNA單位體積內(nèi)的拷貝數(shù)；(8)檢驗1)均勻性試驗從樣品隨機選取一定數(shù)量的樣品，檢測每個樣品單位體積RNA拷貝數(shù)，對結(jié)果進行統(tǒng)計分析，要求各檢測值之間無顯著差異；2)穩(wěn)定性試驗每隔一定時間隨機抽取樣品進行檢測，根據(jù)單位體積RNA拷貝數(shù)下降情況，計算其保存期；(9)協(xié)作標定將樣品分發(fā)國內(nèi)相關(guān)機構(gòu)，檢測單位體積RNA拷貝數(shù)；(10)定值對所有測定結(jié)果進行統(tǒng)計、分析，剔除異常值；確定該標準物質(zhì)最終的單位體積RNA拷貝數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬瘟病毒核酸標準物質(zhì)的制備方法。本發(fā)明所涉及的豬瘟病毒核酸標準物質(zhì)是通過以下技術(shù)步驟制備的(1)選擇基因保守區(qū)為擴增靶區(qū)；(2)引物設(shè)計、合成；(3)序列擴增；(4)克隆、鑒定；(5)體外轉(zhuǎn)錄；(6)分裝；(7)RNA拷貝數(shù)測定；(8)檢驗；(9)協(xié)作標定；(10)定值。利用本發(fā)明制備的豬瘟病毒核酸標準物質(zhì)無感染性、適用范圍廣、均勻性好、穩(wěn)定性高、拷貝數(shù)定值準確，可用于RT-PCR或熒光定量PCR診斷試劑的質(zhì)量控制、科學(xué)研究與實驗室診斷的對照以及實驗室之間的能力比對。
文檔編號C12R1/93GK101906487SQ20101024513
公開日2010年12月8日 申請日期2010年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月5日
發(fā)明者關(guān)孚時, 戴志紅, 李翠, 王在時, 蔣卉 申請人:中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所