專利名稱：脂肪酶催化豬油合成抗壞血酸脂肪酸酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脂肪酶催化豬油合成抗壞血酸脂肪酸酯的方法，屬于生物催化領(lǐng)域。 更具體地說，本發(fā)明提供一種以天然動(dòng)物油脂-豬油和L-抗壞血酸為原料，非水體系中脂 肪酶催化豬油進(jìn)行醇解和轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)合成抗壞血酸脂肪酸酯的方法。
背景技術(shù)：
L-抗壞血酸脂肪酸酯(L-Ascorbyl Fatty Acid Esters, AFAE)是指利用化學(xué)或 酶催化不同?；w和L-抗壞血酸通過?；磻?yīng)得到的具有抗氧化性和表面活性的酯 類，包括L-抗壞血酸月桂酸酯(L-ascorbyl laurate)、L_抗壞血酸豆蔻酸酯(L-ascorbyl myristate)、L-抗壞血酸棕櫚酸酯(L-ascorbyl palmitate)以及L-抗壞血酸硬脂酸酯 (L-ascorbyl stearate)等。其中L-抗壞血酸棕櫚酸酯應(yīng)用最廣泛，是世界衛(wèi)生組織、食品 添加劑聯(lián)合委員會(huì)認(rèn)可的營養(yǎng)型抗氧化劑，并被美國藥典收載。L-抗壞血酸脂肪酸酯是一 種新型的多功能食品添加劑。由于其既含有親水性的L-抗壞血酸，又含有親油性的脂肪酸 鏈，使得它們兼具脂溶性抗氧化劑和食品乳化劑的特性，在食品工業(yè)中具有廣泛的用途。L-抗壞血酸脂肪酸酯的合成主要有化學(xué)合成法和酶催化合成法兩類。其中化學(xué)合 成法因成本低、收率高等優(yōu)點(diǎn)在工業(yè)生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用。但化學(xué)合成方法副反應(yīng)多，得到的產(chǎn) 品有害物質(zhì)含量高，很難達(dá)到綠色食品添加劑的要求，而且該工藝還存在能耗高、對(duì)設(shè)備要 求高、環(huán)境污染較為嚴(yán)重等問題。與化學(xué)合成法相比，L-抗壞血酸脂肪酸酯的酶法合成具 有反應(yīng)選擇性高、反應(yīng)條件溫和、副反應(yīng)少、轉(zhuǎn)化率高和產(chǎn)品下游分離操作相對(duì)簡(jiǎn)單、對(duì)設(shè) 備要求不高等優(yōu)點(diǎn)，完全符合綠色化工的發(fā)展趨勢(shì)。盡管目前酶法合成L-抗壞血酸脂肪酸 酯的工業(yè)化生產(chǎn)因酶的應(yīng)用環(huán)境以及成本高的問題還沒有實(shí)現(xiàn)，但它代表了未來產(chǎn)業(yè)的發(fā) 展方向。在酶催化法合成L-抗壞血酸脂肪酸酯的研究中，脂肪酶和溶劑的選擇、最佳反應(yīng) 條件的確定以及經(jīng)濟(jì)性底物的采用成為酶催化合成法發(fā)展的關(guān)鍵。以廉價(jià)的畜牧業(yè)加工副 產(chǎn)品_豬油和L-抗壞血酸為原料，利用生物催化手段制備的L-抗壞血酸脂肪酸酯是一種 混合性酯。該混合性酯既含有不飽和脂肪酸，又有飽和脂肪酸，在抗氧化的同時(shí)還具有可以 提供給人體多種脂肪酸和L-抗壞血酸的生理學(xué)效價(jià)的特性，屬于一種高效、營養(yǎng)、多功能 食品添加劑，符合目前綠色食品添加劑安全、營養(yǎng)、多功能的發(fā)展趨勢(shì)。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明目的是針對(duì)酶法合成L-抗壞血酸脂肪酸酯成本高的問題，提供一種脂肪 酶催化豬油合成抗壞血酸脂肪酸酯的方法，探索了一種L-抗壞血酸脂肪酸酯酶法合成的 新途徑。技術(shù)方案1.復(fù)合脂肪酸甲酯的制備
稱取豬油，按精制豬油與甲醇摩爾比為1 4 5加入甲醇，按豬油體積分?jǐn)?shù)40% 加入叔戊醇，混合均勻后，按豬油質(zhì)量分?jǐn)?shù)2 5%加入固定化脂肪酶Novozym 435，置于 50°C恒溫?fù)u床中以200r/min的轉(zhuǎn)速醇解反應(yīng)10h，反應(yīng)結(jié)束后，過濾除去固定化脂肪酶，反 應(yīng)液經(jīng)減壓蒸餾出甲醇和叔戊醇，并移入分液漏斗，靜置后分離出下層的甘油，上層為純度 98%油狀的復(fù)合脂肪酸甲酯；2.非水體系中脂肪酶催化合成L-抗壞血酸脂肪酸酯(1)按L-抗壞血酸與復(fù)合脂肪酸甲酯的摩爾比為1 2 11稱取L-抗壞血酸和 復(fù)合脂肪酸甲酯，加入20ml反應(yīng)介質(zhì)中，在反應(yīng)溫度50 55°C下預(yù)熱使反應(yīng)物溶解并混 合均勻，然后按復(fù)合脂肪酸甲酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)10 20%加入Novozym 435，反應(yīng)混合物在50 55°C搖床中以180r/min的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)4 33h，得到L-抗壞血酸脂肪酸酯的反應(yīng)液；(2)按L-抗壞血酸與復(fù)合脂肪酸甲酯的摩爾比為1 2 11稱取L-抗壞血酸 和復(fù)合脂肪酸甲酯，在規(guī)格為20*250mm的不銹鋼柱里裝入L-抗壞血酸，20*100mm的不銹 鋼柱里按復(fù)合脂肪酸甲酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)10 20%裝入Novozym 435，放入50 55°C恒溫水浴 鍋中。在稱取復(fù)合脂肪酸甲酯的物料瓶中，加入300ml反應(yīng)介質(zhì)，并通過磁力攪拌器不斷攪 拌。然后依次將蠕動(dòng)泵、L-抗壞血酸柱和酶柱用耐有機(jī)溶劑的硅膠管連接起來。啟動(dòng)恒流 泵，流速為0. 5 2. OmL/min，循環(huán)反應(yīng)20 24h，得到L-抗壞血酸脂肪酸酯的反應(yīng)液；以上所述的反應(yīng)介質(zhì)為異辛烷丙酮體積比7 3、異辛烷叔戊醇體積比 7 3、異辛烷叔丁醇體積比7 3、正己烷丙酮體積比7 3、正己烷叔戊醇體積比 7 3、正己烷叔丁醇體積比7 3、丙酮、叔丁醇或叔戊醇。3.產(chǎn)物的分離純化(1)有機(jī)溶劑萃取法。先通過過濾的方法除去固定化脂肪酶，將濾液真空蒸發(fā)除 去有機(jī)溶劑后，取在25 50°C下溶解于正己烷中，于4°C高速離心20min得到沉淀，沉淀用 乙酸乙酯溶解后，再加入乙酸乙酯體積4倍的去離子水，充分混勻，置于分液漏斗中靜置分 層，取上層液低壓真空干燥得到白色結(jié)晶。(2)硅膠柱分離法。硅膠浸泡于含5%異丙醇的正己烷中，濕法上柱，用含5%異 丙醇的正己烷洗脫2 3個(gè)柱體積平衡后上樣，用含5%異丙醇的正己烷洗脫去雜，然后用 含10%異丙醇和20%異丙醇的正己烷分段洗脫并收集，將收集液低壓真空干燥得到白色結(jié)晶。4.產(chǎn)品的IR分析分離純化得到的產(chǎn)品為白色粉末，對(duì)其進(jìn)行紅外光譜測(cè)定得到光譜圖(圖2)。在 紅外光譜中，2919CHT1和2850CHT1為飽和C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰；1733CHT1為羧酸酯的羰基 伸縮振動(dòng)吸收峰；1660. IcnT1附近的吸收峰為維生素C中C = C雙鍵的吸收峰，說明所得產(chǎn) 物為L(zhǎng)-抗壞血酸脂肪酸酯。同時(shí)，指紋區(qū)的吸收峰(1460，1300，930以及710CHT1)為進(jìn)-步 說明所得產(chǎn)物L(fēng)-抗壞血酸脂肪酸酯提供了佐證。有益效果本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)如下1.本發(fā)明首次提供了一種將豬油轉(zhuǎn)化為抗壞血酸脂肪酸酯的方法，探索了一種從 廉價(jià)的、天然原料出發(fā)，以生物催化方式進(jìn)行L-抗壞血酸脂肪酸酯合成的新途徑。2.本發(fā)明采用脂肪酶在非水體系中催化豬油進(jìn)行醇解和轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)合成抗壞血酸脂肪酸酯的方法，具有副反應(yīng)少，回收率高的特點(diǎn)。3.本發(fā)明與傳統(tǒng)的化學(xué)合成法相比，本發(fā)明的方法使用廉價(jià)的反應(yīng)底物、反應(yīng)條 件溫和、反應(yīng)時(shí)間短、能耗低、副反應(yīng)少、轉(zhuǎn)化率較高和產(chǎn)品下游分離操作簡(jiǎn)單，從而大大降 低了生產(chǎn)成本。同時(shí)本發(fā)明得到的產(chǎn)品具有色澤淺，品質(zhì)高的特點(diǎn)。
四

圖IL-抗壞血酸脂肪酸酯的HPLC圖譜。圖2產(chǎn)品的紅外光譜圖。
五具體實(shí)施例方式1.復(fù)合脂肪酸甲酯的制備取干凈的250ml具塞三角瓶，在瓶中稱取50g豬油，加入9 11.5ml甲醇(精制豬 油與甲醇摩爾比為1 4 5)，加入25ml叔戊醇(相對(duì)豬油體積分?jǐn)?shù)40%)的具塞三角 瓶，混合均勻后，加入1 2. 5g固定化脂肪酶Novozym 435 (相對(duì)豬油質(zhì)量分?jǐn)?shù)2 5% )， 置于50°C恒溫?fù)u床中以200r/min的轉(zhuǎn)速醇解反應(yīng)10h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾除去固定化脂肪 酶，反應(yīng)液經(jīng)減壓蒸餾出甲醇和叔戊醇，并移入分液漏斗，靜置后分離出下層的甘油，上層 可得到純度達(dá)98%油狀的復(fù)合脂肪酸甲酯。2.非水體系中脂肪酶催化合成L-抗壞血酸脂肪酸酯(1)取IOOml的具塞三角瓶，在瓶中稱取0. 176gL_抗壞血酸，稱取0. 577 3. 176g 復(fù)合脂肪酸甲酯(L-抗壞血酸與復(fù)合脂肪酸甲酯的摩爾比為1 2 11)，加入裝有20ml 反應(yīng)介質(zhì)的具塞三角瓶中，在反應(yīng)溫度50 55°C下預(yù)熱使反應(yīng)物溶解并混合均勻，然后加 入0. 06 0. 63g固定化脂肪酶(相對(duì)復(fù)合脂肪酸甲酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)10 20% )。反應(yīng)混合物 在50 55°C搖床中以180r/min的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)4 33h，得到L-抗壞血酸脂肪酸酯的 反應(yīng)液。采用響應(yīng)曲面法對(duì)反應(yīng)條件(底物比率、酶量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間)進(jìn)行了優(yōu) 化。在反應(yīng)介質(zhì)中，L-抗壞血酸與復(fù)合脂肪酸甲酯摩爾比為1 10. 16，酶用量為15. 70%， 反應(yīng)溫度54. 50°C，反應(yīng)時(shí)間32. 16h的反應(yīng)條件下，L-抗壞血酸轉(zhuǎn)化率為74%，優(yōu)化后抗 壞血酸的轉(zhuǎn)化率提高了近20個(gè)百分點(diǎn)。(2)填充床反應(yīng)器中連續(xù)化合成L-抗壞血酸脂肪酸酯。在規(guī)格為20*250mm的不 銹鋼柱里裝入L-抗壞血酸(10 20g)，20*100mm的不銹鋼柱里裝入3 8g固定化脂肪酶 Novozym 435 (相對(duì)復(fù)合脂肪酸甲酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)10 20% )，放入50 55°C ！恒溫水浴鍋中。 在稱取19. 3 38. 6g復(fù)合脂肪酸甲酯(L-抗壞血酸與復(fù)合脂肪酸甲酯的摩爾比為1 8) 的物料瓶中，加入300ml反應(yīng)介質(zhì)，并通過磁力攪拌器不斷攪拌。然后依次將蠕動(dòng)泵、L-抗 壞血酸柱和酶柱用耐有機(jī)溶劑的硅膠管連接起來。啟動(dòng)恒流泵，流速為0. 5 2. OmL/min, 循環(huán)反應(yīng)20 24h，得到L-抗壞血酸脂肪酸酯的反應(yīng)液；以上所述的反應(yīng)介質(zhì)為異辛烷丙酮體積比7 3、異辛烷叔戊醇體積比 7 3、異辛烷叔丁醇體積比7 3、正己烷丙酮體積比7 3、正己烷叔戊醇體積比 7 3、正己烷叔丁醇體積比7 3、丙酮、叔丁醇或叔戊醇。3. L-抗壞血酸脂肪酸酯的HPLC分析
反應(yīng)結(jié)束后，取20 μ 1反應(yīng)液進(jìn)行HPLC分析。C18色譜柱(5 μ m，4. 6mmX 250mm， Agi lent，USA)，柱體溫度保持在30°C，以乙腈-甲醇(1%。三氟乙酸)_水(1%。三氟乙酸)作 為洗脫液，流動(dòng)相流速保持在1. Oml/min,檢測(cè)器波長(zhǎng)245nm，整個(gè)洗脫過程約45min。采用 外標(biāo)法進(jìn)行產(chǎn)物的定量。標(biāo)準(zhǔn)L-抗壞血酸脂肪酸酯的HPLC圖譜(見圖1)。4.產(chǎn)物的分離純化反應(yīng)粗產(chǎn)品中的主要成分是殘留的復(fù)合脂肪酸酯甲酯、未反應(yīng)的L-抗壞血酸和 產(chǎn)物L(fēng)-抗壞血酸脂肪酸酯。純化的目的就是將殘留的復(fù)合脂肪酸酯甲酯和未反應(yīng)的少量 L-抗壞血酸除去。考慮這些反應(yīng)底物和產(chǎn)物的極性差異，采取了有機(jī)溶劑萃取和硅膠柱分 離兩種方法。(1)有機(jī)溶劑萃取。先通過過濾的方法除去固定化脂肪酶，將濾液真空蒸發(fā)除去 有機(jī)溶劑后，取在25 50°C下溶解于60 120ml正己烷中，于4°C高速離心20min得到沉 淀，沉淀用20 40ml乙酸乙酯溶解后，再加入乙酸乙酯體積4倍的去離子水，充分混勻，置 于分液漏斗中靜置分層，取上層液低壓真空干燥得到白色結(jié)晶。(2)硅膠柱分離。硅膠浸泡于含5%異丙醇的正己烷中，濕法上柱，用含5%異丙 醇的正己烷洗脫2 3個(gè)柱體積平衡后上樣，用含5%異丙醇的正己烷洗脫去雜，然后用含 10%異丙醇和20%異丙醇的正己烷分段洗脫并收集，將收集液低壓真空干燥得到白色結(jié)
曰
曰曰°5.產(chǎn)品的IR分析分離純化得到的產(chǎn)品為白色粉末，對(duì)其進(jìn)行紅外光譜測(cè)定得到光譜圖(圖2)。在 紅外光譜中，2919. 4cm"1和2850. 9cm"1為飽和C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰；1733. 5cm"1為羧酸酯 的羰基伸縮振動(dòng)吸收峰；1660. IcnT1附近的吸收峰為維生素C中C = C雙鍵的吸收峰，說明 所得產(chǎn)物為L(zhǎng)-抗壞血酸脂肪酸酯。實(shí)施例1取干凈的250ml具塞三角瓶，在瓶中稱取50g豬油，加入11. 5ml甲醇和25ml叔戊 醇，再加入1. 5g諾維信公司的Novozym 435，置于50°C恒溫水浴搖床以200r/min下反應(yīng) IOh0反應(yīng)結(jié)束后，過濾除去固定化脂肪酶，反應(yīng)液經(jīng)減壓蒸餾出甲醇和叔戊醇，并移入分液 漏斗，靜置后分離出下層的甘油，上層可得到純度為98%油狀的復(fù)合脂肪酸甲酯，回收率為 90%。取IOOml的具塞三角瓶，在瓶中稱取0. 176gL_抗壞血酸，稱取2. 89g復(fù)合脂肪酸 甲酯。加入20ml異辛烷叔戊醇(V/V，7 3)，密封。將三角瓶放入溫度55°C、180r/min 搖床中預(yù)熱30min，使反應(yīng)物溶解并混合均勻，加入0. 3g諾維信公司的Novozym 435，反應(yīng) 24h，取20 μ 1反應(yīng)液進(jìn)行HPLC分析，L-抗壞血酸轉(zhuǎn)化率達(dá)53%。反應(yīng)完畢，反應(yīng)液經(jīng)過 濾除去固定化酶顆粒，25°C 60ml正己烷洗滌，于4°C高速離心20min得到沉淀，沉淀用20ml 乙酸乙酯溶解后，再加入乙酸乙酯體積4倍的去離子水，充分混勻，置于分液漏斗中靜置分 層，取上層液低壓真空干燥，得到0. 20g純度84%的L-抗壞血酸脂肪酸酯，產(chǎn)品回收率為 85%。實(shí)施例2操作步驟同實(shí)施例1，不同之處在于反應(yīng)完畢，反應(yīng)液經(jīng)過硅膠柱層析分離，用 含5%異丙醇的正己烷洗脫2 3個(gè)柱體積平衡后上樣，用含5%異丙醇的正己烷洗脫去雜，然后再用含10%異丙醇和20%異丙醇的正己烷分段洗脫并收集，減壓真空干燥，得到 0. 19g純度95%的L-抗壞血酸脂肪酸酯，產(chǎn)品回收率為80%。實(shí)施例3取干凈的250ml具塞三角瓶，在瓶中稱取50g豬油，加入11. 5ml甲醇和25ml叔戊 醇，再加入1. 5g諾維信公司的Novozym 435，置于50°C恒溫水浴搖床以200r/min下反應(yīng) IOh0反應(yīng)結(jié)束后，過濾除去固定化脂肪酶，反應(yīng)液經(jīng)減壓蒸餾出甲醇和叔戊醇，并移入分液 漏斗，靜置后分離出下層的甘油，上層可得到純度為98%油狀的復(fù)合脂肪酸甲酯，回收率為 90%。取IOOml的具塞三角瓶，在瓶中稱取0. 176g L-抗壞血酸，稱取2. 93g復(fù)合脂肪酸 甲酯，加入20ml異辛烷叔戊醇(V/V，7 3)，密封。將三角瓶放入溫度55°C、180r/min搖 床中預(yù)熱30min，使反應(yīng)物溶解并混合均勻，加入0. 44g諾維信公司的NOVOZym435，反應(yīng)溫 度54. 500C，反應(yīng)32. 16h，取20 μ 1反應(yīng)液進(jìn)行HPLC分析，L-抗壞血酸轉(zhuǎn)化率為74%。反 應(yīng)完畢，反應(yīng)液經(jīng)過濾除去固定化酶顆粒，50°C 60ml正己烷洗滌，于4°C高速離心20min得 到沉淀，沉淀用20ml乙酸乙酯溶解后，再加入乙酸乙酯體積4倍的去離子水，充分混勻，置 于分液漏斗中靜置分層，取上層液低壓真空干燥，得到0. 26g純度84%的L-抗壞血酸脂肪 酸酯，產(chǎn)品回收率為85%。實(shí)施例4操作步驟同實(shí)施例3，不同之處在于反應(yīng)完畢，反應(yīng)液經(jīng)過硅膠柱層析分離，用 含5%異丙醇的正己烷洗脫2 3個(gè)柱體積平衡后上樣，用含5%異丙醇的正己烷洗脫去 雜，然后再用含10%異丙醇和20%異丙醇的正己烷分段洗脫并收集，減壓真空干燥，得到 0. 25g純度為95. 4%的L-抗壞血酸脂肪酸酯，回收率為81 %。實(shí)施例5取干凈的250ml具塞三角瓶，在瓶中稱取50g豬油，加入11. 5ml甲醇和25ml叔戊 醇，再加入1. 5g諾維信公司的Novozym 435，置于50°C恒溫水浴搖床以200r/min下反應(yīng) IOh0反應(yīng)結(jié)束后，過濾除去固定化脂肪酶，反應(yīng)液經(jīng)減壓蒸餾出甲醇和叔戊醇，并移入分液 漏斗，靜置后分離出下層的甘油，上層可得到純度為98%油狀的復(fù)合脂肪酸甲酯，回收率為 90%。在規(guī)格為20*250mm的不銹鋼柱里裝入IOg L-抗壞血酸，20*100mm的不銹鋼柱里 裝入5g諾維信公司的Novozym 435固定化脂肪酶，放入55°C恒溫水浴鍋中。在500ml物料 瓶中稱取19. 3g復(fù)合脂肪酸甲酯，加入300ml異辛烷叔戊醇(V/V，7 3)，通過磁力攪拌 器不斷攪拌。然后依次將蠕動(dòng)泵、L-抗壞血酸柱和酶柱用耐有機(jī)溶劑的硅膠管連接起來。 啟動(dòng)恒流泵，流速1. OmL/min,循環(huán)反應(yīng)24h，取20 μ 1反應(yīng)液進(jìn)行HPLC分析，L-抗壞血酸 轉(zhuǎn)化率達(dá)到51. 3%，反應(yīng)液中的L-抗壞血酸脂肪酸酯濃度為7. 34g/L。反應(yīng)完畢，反應(yīng)液 經(jīng)過過濾除去固定化酶顆粒，500C 120ml正己烷洗滌，于4°C高速離心20min得到沉淀，沉淀 用40ml乙酸乙酯溶解后，再加入乙酸乙酯體積4倍的去離子水，充分混勻，置于分液漏斗中 靜置分層，取上層液低壓真空干燥，得到1. 43g純度95. 5 %的L-抗壞血酸脂肪酸酯，產(chǎn)品回 收率為65%。實(shí)施例6操作步驟同實(shí)施例5，不同之處在于反應(yīng)完畢，反應(yīng)液經(jīng)過硅膠柱層析分離，用
7含5%異丙醇的正己烷洗脫2 3個(gè)柱體積平衡后上樣，用含5%異丙醇的正己烷洗脫去 雜，然后再用含10%異丙醇和20%異丙醇的正己烷分段洗脫并收集，減壓真空干燥，得到 1. 76g純度95%的L-抗壞血酸脂肪酸酯，產(chǎn)品回收率為80%。
權(quán)利要求
脂肪酶催化豬油合成抗壞血酸脂肪酸酯的方法，其特征為1)復(fù)合脂肪酸甲酯的制備稱取豬油，按精制豬油與甲醇摩爾比為1∶4～5加入甲醇，按豬油體積分?jǐn)?shù)40％加入叔戊醇，混合均勻后，按豬油質(zhì)量分?jǐn)?shù)2～5％加入固定化脂肪酶Novozym 435，置于50℃恒溫?fù)u床中以200r/min的轉(zhuǎn)速醇解反應(yīng)10h，反應(yīng)結(jié)束后，過濾除去固定化脂肪酶，反應(yīng)液經(jīng)減壓蒸餾出甲醇和叔戊醇，并移入分液漏斗，靜置后分離出下層的甘油，上層為純度98％油狀的復(fù)合脂肪酸甲酯；2)非水體系中脂肪酶催化合成L 抗壞血酸脂肪酸酯按L 抗壞血酸與復(fù)合脂肪酸甲酯的摩爾比為1∶2～11稱取L 抗壞血酸和步驟1)得到的復(fù)合脂肪酸甲酯，加入20ml反應(yīng)介質(zhì)中，在反應(yīng)溫度50～55℃下預(yù)熱使反應(yīng)物溶解并混合均勻，然后按復(fù)合脂肪酸甲酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)10～20％加入Novozym 435固定化脂肪酶，反應(yīng)混合物在50～55℃搖床中以180r/min的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)4～33h，得到L 抗壞血酸脂肪酸酯的反應(yīng)液；或者按L 抗壞血酸與復(fù)合脂肪酸甲酯的摩爾比為1∶2～11稱取L 抗壞血酸和復(fù)合脂肪酸甲酯，在規(guī)格為20*250mm的不銹鋼柱里裝入L 抗壞血酸，20*100mm的不銹鋼柱里按復(fù)合脂肪酸甲酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)10～20％裝入Novozym 435固定化脂肪酶，放入50～55℃恒溫水浴鍋中，在稱取復(fù)合脂肪酸甲酯的物料瓶中，加入300ml反應(yīng)介質(zhì)，并通過磁力攪拌器不斷攪拌，然后依次將蠕動(dòng)泵、L 抗壞血酸柱和酶柱用耐有機(jī)溶劑的硅膠管連接起來，啟動(dòng)恒流泵，流速為0.5～2.0mL/min，循環(huán)反應(yīng)20～24h，得到L 抗壞血酸脂肪酸酯的反應(yīng)液；3)產(chǎn)物的分離純化有機(jī)溶劑萃取法，先通過過濾的方法除去固定化脂肪酶，將濾液真空蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑后，取在25～50℃下溶解于正己烷中，4℃下靜止，于4℃高速離心20min得到沉淀，沉淀用乙酸乙酯溶解后，再加入乙酸乙酯體積4倍的去離子水，充分混勻，置于分液漏斗中靜置分層，取上層液低壓真空干燥得到白色結(jié)晶；或者硅膠柱分離法，硅膠浸泡于含體積比5％異丙醇的正己烷中，濕法上柱，用含5％異丙醇的正己烷洗脫2～3個(gè)柱體積平衡后上樣，用含體積比5％異丙醇的正己烷洗脫去雜，然后用含10％異丙醇和20％異丙醇的正己烷分段洗脫并收集，將收集液低壓真空干燥得到白色結(jié)晶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述反應(yīng)介質(zhì)為異辛烷丙酮體 積比7 3、異辛烷叔戊醇體積比7 3、異辛烷叔丁醇體積比7 3、正己烷丙酮體 積比7 3、正己烷叔戊醇體積比7 3、正己烷叔丁醇體積比7 3、丙酮、叔丁醇或叔戊醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及脂肪酶催化豬油合成抗壞血酸脂肪酸酯的方法，屬于生物催化領(lǐng)域。以天然動(dòng)物油脂-豬油和L-抗壞血酸為原料，非水體系中脂肪酶催化豬油和甲醇進(jìn)行醇解反應(yīng)制備復(fù)合脂肪酸甲酯，然后再催化復(fù)合脂肪酸甲酯與L-抗壞血酸進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)制備抗壞血酸脂肪酸酯。該方法在反應(yīng)介質(zhì)中，以固定化酶作為催化劑，酶用量為12～20％，底物比率1∶2～11，反應(yīng)溫度50～55℃，反應(yīng)時(shí)間20～32h，然后將反應(yīng)液經(jīng)過濾、洗滌、萃取或硅膠柱分離、低壓真空干燥等步驟制備L-抗壞血酸脂肪酸酯。本發(fā)明的方法利用廉價(jià)的豬油作為反應(yīng)底物，能在較短的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)獲得高的轉(zhuǎn)化率，從而降低了生產(chǎn)成本，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P17/04GK101892275SQ20101022474
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月13日
發(fā)明者劉建偉, 別小妹, 呂鳳霞, 張宇, 趙海珍, 陸兆新 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)