專利名稱：鏈霉菌gsdx-1318及發(fā)酵法生產(chǎn)寡聚糖類抗生素阿維拉霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是鏈霉菌及一種發(fā)酵生產(chǎn)寡聚糖類抗生物阿維拉霉素的方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)、工業(yè)生物技術(shù)、發(fā)酵工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
抗生素添加于飼料中用以促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)發(fā)育和提高產(chǎn)量報(bào)道已有近60年的歷史，許多國(guó)家都長(zhǎng)期應(yīng)用抗生素添加劑。然而，伴隨著抗生素類促生長(zhǎng)劑的廣泛使用，一系列問題也逐漸顯露，主要是藥物殘留和耐藥性問題。長(zhǎng)期、廣泛、不加選擇地使用抗生素飼料給細(xì)菌性疾病的控制和治療帶來了極大的麻煩和困難，同時(shí)也給人類的健康帶來潛在的威脅。目前雖然關(guān)于是否應(yīng)該在飼料中使用抗生素存在眾多的爭(zhēng)議，但實(shí)踐證明，合理地使用抗生素添加劑能都促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)，提高飼料的轉(zhuǎn)化率。同時(shí)也有報(bào)告顯示，禁止在飼料中添加抗生素或其他抗菌促生長(zhǎng)劑的國(guó)家會(huì)造成畜牧業(yè)生產(chǎn)成本增加、盈利減少，同時(shí)也有可能引發(fā)諸如生態(tài)環(huán)境及國(guó)家之間的貿(mào)易戰(zhàn)爭(zhēng)等問題。事實(shí)上，抗生素添加劑仍在大量使用，只有對(duì)它們進(jìn)行全面的認(rèn)識(shí)和合理的應(yīng)用，才能充分發(fā)揮其有利作用，并避免對(duì)人類健康造成傷害。當(dāng)務(wù)之急便是針對(duì)微生物的耐藥性進(jìn)行研究，開發(fā)廣譜、高效、安全的新型飼料添加劑，這不僅能帶來顯著的經(jīng)濟(jì)效益，還具有極其重要的社會(huì)意義。阿維拉霉素(Avilamycin)，是一種安全性高，無殘留，毒性小，不存在交叉耐藥性， 易降解，對(duì)環(huán)境污染小的廣譜、高效、安全的新型飼料添加劑。它又稱卑霉素、阿美拉霉素、 肥拉霉素，是由綠色產(chǎn)色鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種寡聚糖類抗生素。作為一種新型的飼料添加劑，具有一下特點(diǎn)①飼料中添加微量的阿維拉霉素就能促進(jìn)畜禽的增重。②具有強(qiáng)烈的抗革蘭氏陽(yáng)性菌微生物活性。③由于其不易吸收，只在消化管內(nèi)發(fā)揮其效果，不會(huì)殘留與畜禽體內(nèi)。④與臨床上現(xiàn)有的抗生素或抗菌藥之間不存在交叉耐藥性。⑤在飼料中有良好的穩(wěn)定性。作為一種動(dòng)物專用抗生素，阿維拉霉素即能夠滿足人們對(duì)安全性的要求，又可提高畜禽的產(chǎn)量。但目前阿維拉霉素工藝過程復(fù)雜，發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，生產(chǎn)成本高，單位效價(jià)低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)背景技術(shù)的不足之處，篩選了一株阿維拉霉素生產(chǎn)菌，它為鏈霉菌GSDX-1318，分類命名為鏈霉菌，拉丁學(xué)名是Mi^ptomyces sp.，其保藏編號(hào)為CCTCC NO =M 2010028，保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期是2010 年2月3日。該菌株是由浙江天目山區(qū)土壤中分離得到的鏈霉菌株經(jīng)過物理誘變、分子生物技術(shù)處理后篩選到的穩(wěn)定的阿維拉霉素高產(chǎn)菌株。其發(fā)酵產(chǎn)物阿維拉霉素具有強(qiáng)烈的抗微生物活性，且敏感菌幾乎不對(duì)阿維拉霉素產(chǎn)生耐藥性。本發(fā)明另一個(gè)所要解決的技術(shù)問題是提供一種發(fā)酵法生產(chǎn)寡聚糖類抗生素阿維拉霉素的方法，工藝過程簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低。為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案它包括以下步驟(1)、斜面培養(yǎng)將權(quán)利要求1所述的鏈霉菌GSDX-1318接種于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上，進(jìn)行斜面培養(yǎng)；(2)、對(duì)斜面培養(yǎng)而得的孢子進(jìn)行種子培養(yǎng)，得到種子液；(3)、發(fā)酵培養(yǎng)將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到權(quán)利要求1所述的鏈霉菌GSDX-1318的發(fā)酵液，分離后獲得寡聚糖類抗生素阿維拉霉素。由于采用本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明利用鏈霉菌GSDX-1318，采用發(fā)酵法生產(chǎn)寡聚糖類抗生素阿維拉霉素，工藝過程簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低。本發(fā)明生產(chǎn)的寡聚糖類抗生素阿維拉霉素可以作為一種廣譜、高效、安全的新型飼料添加劑。進(jìn)一步地，在進(jìn)行斜面培養(yǎng)時(shí)，營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的重量百分配比為淀粉0.5 1%、酵母浸出粉0.4 1%、葡萄糖0.4 1%、大豆蛋白胨或胰蛋白胨0.3 0.5%、瓊脂1. 5 2%、水余量，營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的pH = 7. 2-7. 4，培養(yǎng)溫度^-37°C，培養(yǎng)時(shí)間3_5天；在步驟O)中，用0.9%生理鹽水將斜面上培養(yǎng)的孢子制成孢子懸液，并接種到IOOml種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基的重量百分比為甘露醇1 3. 0%、豆粕粉2 4. 0%、L-纈氨酸2 3%，水余量，種子培養(yǎng)基的pH = 7. 2-7. 4。培養(yǎng)溫度為^°C，轉(zhuǎn)速為 220rpm，培養(yǎng)時(shí)間2 3天；發(fā)酵培養(yǎng)基的重量百分配比為可溶性淀粉1 2. 0%、豆粕粉1 2. 0%、大豆蛋白胨 0. 3 0. 5%、D-木糖 0. 05 0. 78%、L-纈氨酸0. 1 0. 23%、CaC03 0.03 0.05%、 MgSO4 0. 03 0. 05%、MnCl2 0. 03 0. 05 %、水余量，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH = 7. 2-7. 4，溫度控制在，轉(zhuǎn)速在200-450rpm，發(fā)酵4-8天。所述的鏈霉菌GSDX-1318在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)后，大量的灰白色營(yíng)養(yǎng)菌絲平鋪于培養(yǎng)基表面，氣生菌絲呈現(xiàn)白色至微灰色。由于采用本發(fā)明的上述技術(shù)方案，根據(jù)菌株生長(zhǎng)代謝過程中對(duì)氧需求量的不同， 進(jìn)行分階段控制溶氧，這是一個(gè)有氧、微氧等多階段的集成發(fā)酵，本發(fā)明在起始低葡萄糖濃度發(fā)酵生產(chǎn)過程中通過流加葡萄糖、豆油等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的方法流加碳源、氮源的方法，并通過發(fā)酵不同階段對(duì)溶氧的需求差異的情況下實(shí)現(xiàn)了阿維拉霉素產(chǎn)生菌的高密度培養(yǎng)，單位體積發(fā)酵液中阿維拉霉素效價(jià)高，采用HPLC進(jìn)行定量分析，單位體積發(fā)酵中阿維拉霉素效價(jià)達(dá)到 1194. 6 2265. 02mg/l。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 鏈霉菌GSDX-1318可在^_37°C，pH偏堿性條件生長(zhǎng)。菌絲放射狀伸展，形成有規(guī)則的螺旋的單軸孢子，螺旋緊密。菌絲顏色較深，直徑較粗。大部分氣生菌絲成熟，分化成孢子絲，螺旋緊密的單軸孢子頭。通過橫隔分裂產(chǎn)生成串的分生孢子。將鏈霉菌GSDX-1318 接種到多種常用天然與合成培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)特征(表1)。表1 鏈霉菌GSDX-1318在各種測(cè)試平板上的培養(yǎng)特征
權(quán)利要求
1.鏈霉菌GSDX-1318，分類命名為鏈霉菌(Sti^ptomycessp.)，其保藏編號(hào)為CCTCC NO =M 2010028，保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。
2.一種發(fā)酵法產(chǎn)生寡聚糖類抗生素阿維拉霉素的方法，其特征在于它包括以下步驟(1)、斜面培養(yǎng)將權(quán)利要求1所述的鏈霉菌GSDX-1318接種于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上，進(jìn)行斜面培養(yǎng)；(2)、對(duì)斜面培養(yǎng)而得的孢子進(jìn)行種子培養(yǎng)，得到種子液；(3)、發(fā)酵培養(yǎng)將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到權(quán)利要求1所述的鏈霉菌 GSDX-1318的發(fā)酵液，分離后獲得寡聚糖類抗生素阿維拉霉素。
3.如權(quán)利要求2所述的一種發(fā)酵法生產(chǎn)寡聚糖類抗生素阿維拉霉素的方法，其特征在于在進(jìn)行斜面培養(yǎng)時(shí)，營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的重量百分配比為淀粉0. 5 1%、酵母浸出粉0. 4 1 %、葡萄糖0. 4 1 %、大豆蛋白胨或胰蛋白胨0. 3 0. 5 %、瓊脂1. 5 2 %、水余量，營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的PH = 7. 2-7. 4，培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時(shí)間3_5天；在步驟O)中，用0.9%生理鹽水將斜面上培養(yǎng)的孢子制成孢子懸液，并接種到IOOml 種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基的重量百分比為甘露醇1 3. 0 %、豆粕粉2 4. 0 %、L-纈氨酸2 3%，水余量，種子培養(yǎng)基的pH = 7. 2-7. 4。培養(yǎng)溫度為^°C，轉(zhuǎn)速為220rpm，培養(yǎng)時(shí)間2 3天；發(fā)酵培養(yǎng)基的重量百分配比為可溶性淀粉1 2. 0%、豆粕粉1 2. 0%、大豆蛋白胨 0. 3 0. 5 %、D-木糖 0. 05 0. 78 %、L-纈氨酸 0. 1 0. 23 %、CaCO3 0. 03 0. 05 %、 MgSO4 0. 03 0. 05%、MnCl2 0. 03 0. 05 %、水余量，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH = 7. 2-7. 4，溫度控制在，轉(zhuǎn)速在200-450rpm，發(fā)酵4-8天。
4.如權(quán)利要求2所述的一種發(fā)酵法生產(chǎn)寡聚糖類抗生素阿維拉霉素的方法，其特征在于在步驟(3)中，用與發(fā)酵液等量的甲醇30°C浸泡池，采用離心法進(jìn)行提取分離，再采用凝膠樹脂方法進(jìn)行分離，獲得寡聚糖類抗生素阿維拉霉素。
5.如權(quán)利要求3所述的一種發(fā)酵法生產(chǎn)寡聚糖抗生素阿維拉霉素的方法，其特征在于所述的鏈霉菌GSDX-1318在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)后，大量的灰白色營(yíng)養(yǎng)菌絲平鋪于培養(yǎng)基表面，氣生菌絲呈現(xiàn)白色至微灰色。
全文摘要
本發(fā)明篩選一株阿維拉霉素生產(chǎn)菌，它為鏈霉菌GSDX-1318，分類命名為鏈霉菌，拉丁學(xué)名是Streptomyces sp.，并提供一種發(fā)酵法生產(chǎn)寡聚糖類抗生素阿維拉霉素的方法，它包括以下步驟(1)、斜面培養(yǎng)將鏈霉菌GSDX-1318接種于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上，進(jìn)行斜面培養(yǎng)；(2)、對(duì)斜面培養(yǎng)而得的孢子進(jìn)行種子培養(yǎng)，得到種子液；(3)、發(fā)酵培養(yǎng)將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到權(quán)利要求1所述的鏈霉菌GSDX-1318的發(fā)酵液，分離后獲得寡聚糖類抗生素阿維拉霉素。本發(fā)明采用發(fā)酵法生產(chǎn)寡聚糖類抗生素阿維拉霉素，工藝過程簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低。本發(fā)明生產(chǎn)的寡聚糖類抗生素阿維拉霉素可以作為一種廣譜、高效、安全的新型飼料添加劑。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102161975SQ201010204909
公開日2011年8月24日 申請(qǐng)日期2010年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月21日
發(fā)明者張虹, 梁新樂, 王宏, 金英燕, 陳敏 申請(qǐng)人:浙江工商大學(xué)