一種新型β-1,4-甘露聚糖酶(AuMan26A)的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種來(lái)源于宇佐美曲霉Aspergillus?usamii?E001的β-1，4-甘露聚糖酶基因的克隆方法，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO：1，命名為Auman26A。生物信息學(xué)分析表明該甘露聚糖酶屬于糖苷水解酶第26家族，命名為AuMan26A，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO：2。本發(fā)明還公開(kāi)了AuMan26A基因在畢赤酵母中異源表達(dá)、活性測(cè)定及酶學(xué)性質(zhì)的分析方法，制備的重組酶熱穩(wěn)定性極好，具有較大的工業(yè)化生產(chǎn)潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【專利說(shuō)明】—種新型β-1,4-甘露聚糖酶(AUMan26A)的制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種來(lái)源于宇佐美曲霉Aspergillus usamii EOOl的β-1,4-甘露聚糖酶(AuMan26A)的基因的克隆、異源表達(dá)、活性測(cè)定及酶學(xué)性質(zhì)的分析方法，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]β -甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)是內(nèi)切β -1,4-甘露聚糖甘露糖苷水解酶的簡(jiǎn)稱，能夠隨機(jī)催化甘露聚糖分子主鏈中β -1, 4-D-甘露糖苷鍵的水解，是甘露聚糖降解酶系中最重要的組分，屬于半纖維素酶類。它廣泛存在于多種生物體內(nèi)，在食品、醫(yī)藥、飼料、紡織、紙漿漂白、能源開(kāi)發(fā)等眾多領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值?；谝患?jí)結(jié)構(gòu)的同源性和疏水簇分析，絕大多數(shù)β -甘露聚糖酶都屬于糖苷水解酶(GH)第5或26家族。而GH5和GH26家族的β_甘露聚糖酶的活性位點(diǎn)作用模式不盡相同，從而表現(xiàn)出各自特異的生物學(xué)性質(zhì)。近年來(lái)的研究表明GH26家族β -甘露聚糖酶在催化活性和熱穩(wěn)定性方面具有較為優(yōu)良的特性，這為GH26家族β-甘露聚糖酶的深入研究提供了參考。自然界微生物中具有豐富的酶資源，利用生物信息學(xué)和基因組學(xué)相結(jié)合的方法從微生物中挖掘具有優(yōu)良性狀的新型酶是一條獲取優(yōu)良酶的有效途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種來(lái)源于宇佐美曲霉Aspergillus usamii EOOl的β_1,4-甘露聚糖酶(AuMan26A)的基因克隆、異源表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)的分析方法，為拓展β _甘露聚糖酶的研究領(lǐng)域奠定了理論基礎(chǔ)，同時(shí)為其它新型酶的挖掘提供了新的策略。
[0004]A.usamii EOOl菌株由江南大學(xué)篩選和保藏，已于2005年在《食品與發(fā)酵工業(yè)》雜志的Vol.31，N0.4，Pg.50公 開(kāi)，本發(fā)明人承諾該菌株在20年內(nèi)向公眾發(fā)放。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案:基于NCBI上AspergillusnigerCBS513.88菌株的基因組序列，參照推測(cè)出的黑曲霉GH26家族β -甘露聚糖酶序列，借助RT-PCR技術(shù)從A.usamiiEOOl中克隆出AuMan26A的編碼基因，通過(guò)pPIC9KM質(zhì)粒在畢赤酵母GS115中實(shí)現(xiàn)了天然N端異源表達(dá)并檢測(cè)其酶學(xué)性質(zhì)。
[0006]所述的一種源自宇佐美曲霉A.usamii EOOl菌株新型基因Auman26A對(duì)應(yīng)的核苷酸和氨基酸序列分別為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
[0007]所述的能夠?qū)崿F(xiàn)天然N端表達(dá)的質(zhì)粒pPIC9KM已申請(qǐng)專利(專利申請(qǐng)?zhí)?201110410391.0)。
[0008]所述的重組甘露聚糖酶的活性測(cè)定方法:
[0009]采用改良的DNS試劑法，取2.4mL5mg / ml角豆膠溶液(ρΗ5.5的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制)于40°C預(yù)熱5min后加入0.1mL適當(dāng)稀釋的酶液,40°C下準(zhǔn)確反應(yīng)10min,加入2.5mL DNS試劑，沸水浴中顯色7min，加入5mL去離子水混勻后測(cè)定0054(|。在上述反應(yīng)條件下，每分鐘產(chǎn)生I μ rnol還原糖(以甘露糖計(jì))所需的酶量定義為I個(gè)酶活性單位(U)。[0010]所述的Auman26A基因克隆、異源表達(dá):
[0011](l)AuMan26A成熟肽的編碼基因的克隆:基于宇佐美曲霉與黑曲霉基因序列的相似性，參照NCBI上公布的A.niger CBS 513.88菌株基因組中推測(cè)的Man26A的基因序列(登錄號(hào):XM_001397260.1)，結(jié)合生物信息學(xué)分析的手段，設(shè)計(jì)出一對(duì)擴(kuò)增編碼AuMan26A成熟肽cDNA的特異性上下游引物。
【權(quán)利要求】
1.一種來(lái)源于宇佐美曲霉Aspergillus usamii EOOl的β-1,4-甘露聚糖酶基因Auman26A，其對(duì)應(yīng)的核苷酸和蛋白質(zhì)序列分別為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
2.Auman26A基因克隆、異源表達(dá)、活性測(cè)定及分析和酶學(xué)性質(zhì)分析方法: (1)Auman26A基因的克隆:基于宇佐美曲霉與黑曲霉基因序列的相似性，參照NCBI上公布的A.nigerCBS513.88菌株基因組中推測(cè)的Man26A的基因序列(登錄號(hào):XM_001397260.1)，結(jié)合生物信息學(xué)分析的手段，設(shè)計(jì)出一對(duì)擴(kuò)增編碼AuMan26A成熟肽cDNA的特異性上下游引物AuMan26A-F和AuMan26A_R:
【文檔編號(hào)】C12N15/56GK103642826SQ201310666414
【公開(kāi)日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】李劍芳, 趙梅, 王春娟, 董運(yùn)海, 鄔敏辰 申請(qǐng)人:江南大學(xué)