專利名稱：2型豬圓環(huán)病毒和其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種2型豬圓環(huán)病毒和其用途。
背景技術：
2型豬圓環(huán)病毒(PCM)是一種小型、二十面體的無包膜DNA病毒，其直徑在17到 22納米的范圍內(nèi)并含有單鏈圓形基因組。PCV2與1型豬圓環(huán)病毒(PCVl)具有約80%的 序列一致度。盡管PCVl是不致病的，但感染PCV2的豬會有例如以下癥狀斷奶后多系統(tǒng) 衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)、豬呼吸道疾病綜合 征(porcine respiratory disease complex，PRDC)、PCV2 引起的腸炎、PCV2 引起的生殖疾 病、豬皮炎腎炎綜合征(porcine dermatitis η印hritissyndrome，PDNS)、萎縮癥、呼吸道 癥狀、腹瀉、黃疸和胃潰瘍。PCV2是圓環(huán)病毒科的一員。PCV2基因組并不編碼病毒DNA聚 合酶，此使其依賴于細胞酶來完成其感染周期。當將PCV2接種于豬體內(nèi)時，在病毒復制方面觀察到高度變化。已觀察到當同時接 禾中其它如豬生殖_呼吸道綜合征病毒(porcine reproductiveand respiratory syndrome virus, PRRSV)或豬細小病毒的病毒時，PCV2能夠在宿主體內(nèi)較好地復制(Allan等人 (2000)Arch Virol. 145,2421-2429 ；Allan 等人(2000) J Vet Med B. 47,81-94)。存在于受PCV2感染的細胞培養(yǎng)物中的PCV2滴度一般在3. 4到4. 51ogl0TCID50/ 毫升范圍內(nèi)。美國專利第7，566，562號公開一種活體外培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒的方法，所述方法 包括給培養(yǎng)基中的連續(xù)動物細胞系細胞接種豬圓環(huán)病毒；在一或多種核內(nèi)質溶酶體系統(tǒng) 酸化抑制劑的存在下培養(yǎng)所述培養(yǎng)基中的所述連續(xù)動物細胞系；以及從所述培養(yǎng)基和/或 所述受感染的連續(xù)動物細胞系分離出所述豬圓環(huán)病毒。然而，仍需要開發(fā)在宿主細胞內(nèi)具有高復制能力的PCV2。特別是還需要開發(fā)在不 使用如至少一種核內(nèi)質溶酶體系統(tǒng)酸化抑制劑的病毒復制增強劑的情況下具有高復制能 力的PCV2。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種在宿主細胞內(nèi)具有高復制能力的2型豬圓環(huán)病毒(PCV2)。本發(fā)明還提供一種使在宿主細胞內(nèi)具有高復制能力的PCV2減毒的方法。本發(fā)明還提供一種免疫原性組合物，其包括在宿主細胞內(nèi)具有高復制能力的減毒 PCV2。本發(fā)明還提供一種使用所述免疫原性組合物來預防或治療動物的PCV2感染相關疾病的方法。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種用于治療或預防動物的圓環(huán)病毒感染的組合 物，所述組合物包含至少一種選自由減毒圓環(huán)病毒PCV2 GC0504和PCV2 GC0505組成的群
組的減毒病毒。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種產(chǎn)生減毒圓環(huán)病毒的方法，所述方法包含使 至少一種選自由圓環(huán)病毒PCV2 GC0504和PCV2 GC0505組成的群組的病毒與福爾馬林反 應，從而制備減毒圓環(huán)病毒。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種治療或預防動物的圓環(huán)病毒感染的方法，所 述方法包含向所述動物投予有效量的根據(jù)權利要求1至11中任一權利要求所述的組合物。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種圓環(huán)病毒PCV2 GC0504，其包含具有SEQ ID NO 1的核苷酸序列的基因組。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種圓環(huán)病毒PCV2 GC0505，其包含具有SEQ ID NO :4的核苷酸序列的基因組。


通過參考隨附圖式詳細地描述本發(fā)明的例示性實施例，本發(fā)明的上述和其它特征 與優(yōu)勢將變得更加明顯，在隨附圖式中圖1為說明各種濃度的PCV2的實時聚合酶鏈式反應(PCR)結果的圖。圖2為說明在PCV2攻擊-接種到幼豬體內(nèi)后經(jīng)鼻腔的PCV2洗脫的圖。圖3為說明在攻擊-接種PCV2和豬生殖-呼吸道綜合征病毒(PRRSV)到幼豬體 內(nèi)后經(jīng)鼻腔的PCV2洗脫的圖。圖4為說明在PCV2攻擊-接種到幼豬體內(nèi)后經(jīng)排泄物的PCV2洗脫的圖。圖5為說明在攻擊-接種PCV2和PRRSV到幼豬體內(nèi)后經(jīng)排泄物的PCV2洗脫的圖。
具體實施例方式在下文中，現(xiàn)將參考附圖更充分地描述本發(fā)明，在附圖中展示本發(fā)明的例示性實 施例。本發(fā)明的一或多個實施例提供一種用于治療或預防動物的圓環(huán)病毒感染的組合 物，所述組合物包括至少一種選自由減毒圓環(huán)病毒PCV2GC0504和PCV2 GC0505組成的群組
的減毒病毒。PCV2 GC0504可以包括具有SEQ ID NO 1的核苷酸序列的基因組。所述基因組可 以具有由SEQ ID NO :1的核苷酸序列的51st到992nd核苷酸組成的開放閱讀框架I(ORFl) 核苷酸序列和與SEQ ID NO 1的核苷酸序列的1037th到1735th核苷酸互補的0RF2核苷酸 序列。ORFl核苷酸序列為正義鏈的并且可以編碼復制酶蛋白。0RF2核苷酸序列為反義鏈 的并且可以編碼衣殼蛋白。ORFl蛋白和0RF2蛋白可以分別地具有SEQ ID NO :2和SEQ ID NO 3的氨基酸序列。因為PCV2 GC0504在宿主細胞中具有高增殖活性，故可以容易地獲得PCV2 GC0504病毒粒子。因此，PCV2 GC0504可以有效地用于制備減毒圓環(huán)病毒疫苗。舉例來 說，PCV2 GC0504可以通過以下步驟來制備將冊_15細胞培養(yǎng)于補充有10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco，s modified Eagle medium，DMEM) (900毫升DMEMU00毫升胎牛血清(FBS)、100微克/毫升鏈霉素 (streptomycin),200國際單位/毫升青霉素(penicillin)和100微克/毫升卡那霉 素(kanamycin))中形成單層；由此移除所述培養(yǎng)基；通過用胰蛋白酶處理來由此分離出 PK-15細胞；添加104 6TCID5。/0. 1毫升的PCV2到PK-15細胞懸浮液中以供接種；在37°CT 靜止培養(yǎng)所述細胞3到4天；通過凍融所述細胞三次來完全地破壞所述細胞；以及以每分 鐘2，500轉的速度離心所述細胞15分鐘，從而獲得上清液。在所述上清液中，PCV2 GC0504 的平均含量等于或大于IO5 6TCID5tl/毫升，例如在IO5 6到IO6 tlTCID5ci/毫升范圍內(nèi)。由此可 見PCV2 GC0504具有高增殖活性。PCV2 GC0504的高增殖活性也可以在無增殖增強劑(如 葡糖胺)存在時獲得。PCV2 GC0505可以包括具有SEQ ID NO 4的核苷酸序列的基因組。所述基因組可 以具有由SEQ ID NO :4的核苷酸序列的51st到992nd核苷酸組成的ORFl核苷酸序列和與 SEQ ID NO 4的核苷酸序列的1036th到1734th核苷酸互補的0RF2核苷酸序列。ORFl核苷 酸序列為正義鏈的并且可以編碼復制酶蛋白。0RF2核苷酸序列為反義鏈的并且可以編碼衣 殼蛋白。ORFl蛋白和0RF2蛋白可以分別地具有SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6的氨基酸序 列。因為PCV2 GC0505在宿主細胞中具有高增殖活性，故可以容易地獲得PCV2 GC0505 病毒粒子。因此，PCV2 GC0505可以有效地用于制備減毒圓環(huán)病毒疫苗。舉例來說，PCV2 GC0505可以通過以下步驟來制備將Η -15細胞培養(yǎng)于補充有10%胎牛血清(FBQ的達爾 伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM) (900毫升DMEMU00毫升10%胎牛血清(FBS)、100微克/ 毫升鏈霉素、200國際單位/毫升青霉素和100微克/毫升卡那霉素)中形成單層；由此移 除所述培養(yǎng)基；通過用胰蛋白酶處理來由此分離出冊-15細胞；添加104 6TCID5Q/0. 1毫升的 PCV2到細胞懸浮液中以供接種；在37°C下靜止培養(yǎng)所述細胞3到4天；通過凍融所述細胞 三次來完全地破壞所述細胞；以及以每分鐘2，500轉的速度離心所述細胞15分鐘，從而獲 得上清液。在所述上清液中，PCV2 GC0505的平均含量等于或大于IO5 6TCID5tl/毫升，例如 在IO5 6到IO6 ciTCID5q/毫升范圍內(nèi)。由此可見PCV2GC0505具有高增殖活性。PCV2 GC0505 的高增殖活性也可以在無增殖增強劑(如葡糖胺)存在時獲得。至少一種選自由PCV2 GC0504和PCV2 GC0505組成的群組的圓環(huán)病毒可以通過 使用所屬領域的任何已知方法由其基因組序列制備。所述圓環(huán)病毒可以通過將其基因組 序列插入到PCV2的宿主細胞中或宿主動物體內(nèi)并且從所述宿主細胞或宿主動物分離出感 染性PCV2而產(chǎn)生。宿主細胞可以為H(-15細胞。宿主動物可以為豬。舉例來說，所述圓 環(huán)病毒可以通過以下步驟來產(chǎn)生獲得具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的核苷酸序列 的PCV2 GC0504或PCV2 GC0505的基因組DNA ；將所述DNA引入到重組載體中；將所述重組 載體插入到PCV2的宿主細胞中或宿主動物體內(nèi)；以及從所述宿主細胞或宿主動物分離出 感染性PCV2。舉例來說，具有SEQID NO 1或SEQ ID NO 2的核苷酸序列的PCV2 GC0504 或PCV2 GC0505的基因組DNA可利用DNA合成來獲得?？梢院铣烧麄€基因組DNA或基因 組DNA的片段。當合成基因組DNA的片段時，連接所述片段來制備基因組DNA。可以利用 酶(如DNA連接酶和DNA激酶)來進行連接。所屬領域的技術人員可以容易地合成出長 度為約1. 8kb的PCV2 GC0504或PCV2 GC0505的基因組DNA。可以將所合成的基因組DNA或包括所述基因組DNA的載體插入到宿主細胞中或宿主動物體內(nèi)?？梢允褂妹绹鴮＠?請公開案第2004/0253270A1號(例如第0084到0086號段落，實例2到5，以及圖1)中所 公開以及i^enaux，M等人(J. Vir. 2002年1月，第M1-551頁)所公開的方法來產(chǎn)生病毒， 這些文獻的公開內(nèi)容以全文引用的方式并入本文中。若使用這些方法來產(chǎn)生PCV2 GC0504 或PCV2GC0505，可以利用聚合酶鏈式反應(PCR)使用合成基因組DNA作為模板以及使用一 對具有獨特限制酶位點(例如SacII位點)的正向引物和反向引物來擴增PCV2 GC0504或 PCV2 GC0505的整個基因組。為了獲得包括PCV2基因組的串聯(lián)二聚體的DNA克隆，將PCR 產(chǎn)物連接到載體(例如，TAge質粒載體(Clontech Jalo Alto，Clif))，以使大腸桿菌Dffia 感受態(tài)細胞轉化。使載體與已轉化的細胞分離，以鑒定整個基因組的存在以及使用限制酶 (例如McII)進行切割，并且使用DNA連接酶連接所切割的PCV2基因組DNA，從而制備串聯(lián) 二聚體。接著,在 pBluescript SK(+)載體(pSK) (Stratagene 公司，La Jolla, Calif)中 克隆串聯(lián)二聚體，以制備包括PCV2基因組的串聯(lián)二聚體的重組質粒(PCV2分子DNA克隆)。 接著，可以將PCV2分子DNA克隆活體外轉染到H(-15細胞中。培養(yǎng)已轉染的冊_15細胞， 并加以破壞來分離出病毒，從而獲得PCV2。PCV2可以被活體內(nèi)接種(例如鼻內(nèi)接種)到宿 主動物(例如豬)體內(nèi)并且從所述宿主動物分離出來。減毒圓環(huán)病毒PCV2 GC0504和PCV2 GC0505可能不會感染宿主細胞并且不會引起 病理病變而具有免疫原性。或者，PCV2 GC0504和PCV2GC0505可能會感染宿主細胞，但不會 引起病理病變而具有免疫原性。病理病變可以為細胞、組織和個體中由所屬領域內(nèi)已知的 圓環(huán)病毒感染宿主引起而出現(xiàn)的任何癥狀。舉例來說，病理病變可以包括選自由以下組成 的群組的至少一種癥狀先天性震顫、斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、消瘦、呼吸困難、 呼吸急促、黃疸、腹瀉、咳嗽、中樞神經(jīng)系統(tǒng)不穩(wěn)定、重量損失、急性血管炎(LangOhr，2010， Vet pathol.，第47卷，第140-147頁)、繁殖疾病(流產(chǎn)、死產(chǎn)、胎兒木乃伊化等，Hansen, 2010，VetMicrobiol.，電子出版物先于印刷物)和豬皮炎腎病綜合征(PDNS)?？梢允褂盟鶎兕I域內(nèi)已知的任何方法來進行減毒。舉例來說，可以通過圓環(huán)病 毒在細胞(如H(-15細胞)中反復傳代或通過活化圓環(huán)病毒相關的核酸內(nèi)切酶來進行減 毒。另外，可以利用化學方法，例如使病毒暴露于甲醛(福爾馬林)、多聚甲醛、丙內(nèi)酯、 二甲亞胺或其衍生物，或利用紫外線照射來進行減毒。舉例來說，使至少一種選自由PCV2 GC0504和PCV2 GC0505組成的群組的病毒與甲醛反應而被減毒。在所述反應中，甲醛的用 量以反應溶液總重量計，可以在0.2重量％到0.5重量％范圍內(nèi)?？梢栽谑覝叵?，在以每分 鐘100轉的速度攪拌時進行反應，持續(xù)10到M小時。所述組合物可以用來治療或預防動物的由PCV2感染引起的病理病變。舉例來說， 病理病變可以包括至少一種選自由以下組成的群組的癥狀先天性震顫、斷奶后多系統(tǒng)衰 竭綜合征(PMWS)、消瘦、呼吸困難、呼吸急促、黃疸、腹瀉、咳嗽、中樞神經(jīng)系統(tǒng)不穩(wěn)定、重量 損失和豬皮炎腎病綜合征(PDNS)。PCV2 GC0504和PCV2 GC0505在組合物中的含量可以視動物類型、疾病嚴重度、動 物年齡和組合物的調(diào)配而變化。舉例來說，PCV2 GC0504和PCV2 GC0505的量可以等于或 大于104_ 5TCID5tl，例如在單一劑量下在IO4-5TCID50到IO6-5TCID50范圍內(nèi)。在組合物中，要進行預防或要對其感染進行治療的圓環(huán)病毒可以選自由PCVh和 PCV2b組成的群組。例如，所述圓環(huán)病毒可以包括PCMa和PCV2b。PCV2可分為兩種基因型PCVh*PCV2b，但PCVh*PCV2b不屬于亞株。因此，根據(jù)本發(fā)明一個實施例包括減毒 PCV2 GC0504和PCV2 GC0505的組合物可以防御屬于PCV^i* PCV2b (亦即所有PCV2)的病組合物可以進一步包括獸醫(yī)學上可接受的載劑。載劑可以為所屬領域內(nèi)常用于維 持組合物免疫原性的任何載劑。例如，載劑可以包括至少一種選自由稀釋劑、賦形劑、佐劑 和凍干穩(wěn)定劑組成的群組的載劑。稀釋劑可以包括至少一種選自由水(如無菌水)和緩沖 溶液組成的群組的稀釋劑。佐劑可以為所屬領域內(nèi)常用于改善PCV2 GC0504和PCV2 GC0505 的免疫原性的任何佐劑。舉例來說，佐劑可以包括至少一種選自由氫氧化鋁、皂角苷、聚磷 腈和莫他尼德凝膠(montanide gel )組成的群組的佐劑。凍干穩(wěn)定劑可以為碳水化合 物，如山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、蔗糖、葡聚糖或葡萄糖；蛋白質，如白蛋白或酪蛋白；這些 化合物的衍生物；或緩沖劑，如堿金屬磷酸鹽。如所屬領域的技術人員眾所周知，載劑的量 可以視載劑類型而變化。以組合物總重量計，組合物可以包括5%到15%的載劑。根據(jù)本發(fā)明實施例，組合物可以包括每一個單位劑量組合物各自為104_ 5TCID5tl或 IO4-5TCID50 以上(例如，IO4 5TCID5tl 到 107_5TCID5。、IO4 5TCID5tl 到 IO6 5TCID5。、或 IO6 ciTCID50 到 IO7 ciTCID5tl)的 PCV2 GC0504 和 PCV2 GC0505 以及 5%到 10%的 montanide gel (以組合 物總重量計)。Montanide gel (SEPPIC，巴黎，法國)是由合成聚合物和親水膠組成。組合物可以為呈所屬領域內(nèi)已知的任何調(diào)配物形式的免疫原性組合物。組合物可 以為口服或非經(jīng)腸調(diào)配物。組合物的調(diào)配物可以為凍干調(diào)配物、顆粒、粉末、液體、藥片、膠 囊、糖漿粉或注射劑。凍干調(diào)配物可以在使用前溶于已滅菌的液體載劑(例如無菌水)中。可以使用所屬領域內(nèi)常用于投予免疫原性組合物的任何方法來投予組合物。舉例 來說，組合物可以經(jīng)由諸如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、口服、經(jīng)皮、粘膜、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)或皮下途徑的途 徑投予個體。投藥可以為全身投藥或局部投藥。在所述組合物中，動物可以選自由豬、小鼠和豚鼠組成的群組。本發(fā)明的一或多個實施例提供一種產(chǎn)生減毒圓環(huán)病毒的方法，所述方法包括使至 少一種選自由PCV2 GC0504和PCV2 GC0505組成的群組的病毒與福爾馬林反應，從而獲得 減毒圓環(huán)病毒。可以通過添加病毒到包括福爾馬林的反應溶液中以及維持所述反應溶液來進行 反應。以反應溶液總重量計，福爾馬林的量可以在0.2重量％到0.5重量％范圍內(nèi)?？梢?在室溫下進行反應。所述反應可以進行10到M小時?？梢栽诿糠昼?00轉的攪拌下進行 反應。本發(fā)明的一或多個實施例提供一種治療或預防動物的圓環(huán)病毒感染的方法，所述 方法包括向所述動物投予有效量的組合物。可以使用所屬領域內(nèi)常用于投予免疫原性組合物的任何方法來投予組合物。組合 物可以口服投予或非經(jīng)腸投予。舉例來說，組合物可以經(jīng)由諸如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、口服、經(jīng) 皮、粘膜、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、直腸或皮下途徑的途徑投予個體。投藥可以為全身投藥或局部投 藥?？梢酝ㄟ^注射或輸注進行投藥?？梢酝队杞M合物一次或一次以上，例如，兩次或兩次以上。可以投予組合物兩次。 舉例來說，可以投予組合物一次并且在從第一次投予起2周后再次投予。動物可以選自由 豬、小鼠和豚鼠組成的群組。
“有效量”是指可有效地用于預防或治療動物的PCV2感染的量。預防治療除了預 防動物的PCV2感染以外，還包括去除和減少由PCV2感染引起的病變。有效量可以視動物類 型、疾病嚴重度、動物年齡和組合物的調(diào)配而變化。舉例來說，有效量的PCV2 GC0504和PCV2 GC0505可以包括在單一劑量下各自為IO4 5TCID5tl或IO4 5TCID5tl以上(例如，104_ 5TCID5tl至Ij IO7.5TCID50UO4.5TCID50 至Ij IO6.5TCID50、或 IO6.0TCID50 至Ij IO7.0TCID50)的 PCV2 GC0504 禾口 PCV2 GC0505。組合物如上文所定義。動物可以為由PCV2感染引起病理病變的任何動物。例如， 動物可以選自由豬、小鼠和豚鼠組成的群組。本發(fā)明的一或多個實施例提供一種圓環(huán)病毒PCV2 GC0504，其包括具有SEQ ID NO 1的核苷酸序列的基因組。所述基因組可以具有由SEQ ID NO=I的核苷酸序列的51st到992nd核苷酸組成的 ORFl核苷酸序列和與SEQ ID NO=I的核苷酸序列的1037th到1735th核苷酸互補的0RF2核 苷酸序列。ORFl核苷酸序列為正義鏈的并且可以編碼復制酶蛋白。0RF2核苷酸序列為反義 鏈的并且可以編碼衣殼蛋白。ORFl蛋白和0RF2蛋白可以分別地具有SEQ ID NO :2和SEQ ID NO 3的氨基酸序列。PCV2 GC0504可以包括以SEQ ID NO 1的基因組序列表示的任何病毒粒子。圓環(huán) 病毒PCV2 GC0504可以包括至少一種選自由具有SEQ IDNO 2和SEQ ID NO 3的氨基酸序 列的ORFl和0RF2組成的群組的氨基酸序列。圓環(huán)病毒PCV2 GC0504為PCV24a病毒。由于在宿主細胞中具有高增殖活性，故PCV2 GC0504可以有效地用于制備減毒圓 環(huán)病毒疫苗。舉例來說，PCV2 GC0504可以通過以下步驟來制備將冊_15細胞培養(yǎng)于補充 有10%胎牛血清(FBS)的達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM) (900毫升DMEM、100毫升 10%胎牛血清(FBS)、100微克/毫升鏈霉素、200國際單位/毫升青霉素和100微克/毫 升卡那霉素)中形成單層；由此移除所述培養(yǎng)基；通過用胰蛋白酶處理來由此分離出冊-15 細胞；添加104_6TCID5tlA). 1毫升的PCV2到細胞懸浮液中以供接種；在37°C下靜止培養(yǎng)所述 細胞3到4天；通過凍融三次來完全地破壞所述細胞；以及以每分鐘2，500轉的速度離心所 述細胞15分鐘，從而獲得上清液。在所述上清液中，PCV2 GC0504的平均含量等于或大于 IO5 6TCID5tl/毫升，例如在IO5.6到IO6 qTCID5q/毫升范圍內(nèi)。由此可見PCV2GC0504具有高增 殖活性。PCV2 GC0504為屬于PCV2ja的病毒。減毒圓環(huán)病毒PCV2 GC0504可以針對各種PCMa病毒株具有免疫原性。本發(fā)明的一或多個實施例提供一種圓環(huán)病毒PCV2 GC0505，其包括具有SEQ ID NO 2的核苷酸序列的基因組。PCV2 GC0505可以包括具有SEQ ID NO 4的核苷酸序列的基因組。所述基因組可 以具有由SEQ ID NO :4的核苷酸序列的51st到992nd核苷酸組成的ORFl核苷酸序列和與 SEQ ID NO 4的核苷酸序列的1036th到1734th核苷酸互補的0RF2核苷酸序列。ORFl核苷 酸序列為正義鏈的并且可以編碼復制酶蛋白。0RF2核苷酸序列為反義鏈的并且可以編碼 衣殼蛋白。ORFl蛋白和0RF2蛋白可以分別地具有SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6的氨基 酸序列。PCV2 GC0505可以包括以SEQ ID NO :4的基因組序列表示的任何病毒粒子。PCV2 GC0505可以包括至少一種選自由具有SEQ IDNO 5和SEQ ID NO 6的氨基酸序列的ORFl 和0RF2組成的群組的氨基酸序列。PCV2 GC0505為屬于PCV2_2b的病毒。
由于在宿主細胞中具有高增殖活性，故PCV2 GC0505可以有效地用于制備減毒圓 環(huán)病毒疫苗。舉例來說，PCV2 GC0505可以通過以下步驟來制備將冊_15細胞培養(yǎng)于補充 有10%胎牛血清(FBS)的達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM) (900毫升DMEM、100毫升 8%胎牛血清(FBQ、100微克/毫升鏈霉素、200國際單位/毫升青霉素和100微克/毫升 卡那霉素)中形成單層；由此移除所述培養(yǎng)基；通過用胰蛋白酶處理來由此分離出PK-15 細胞；添加IO4 6TCID5ciA). 1毫升的PCV2到細胞懸浮液中以供接種；在37°C下靜止培養(yǎng)所述 細胞3到4天；通過凍融三次來完全地破壞所述細胞；以及以每分鐘2，500轉的速度離心所 述細胞15分鐘，從而獲得上清液。在所述上清液中，PCV2 GC0505的平均含量等于或大于 IO5 6TCID5tl/毫升，例如在IO5.6到IO6 qTCID5q/毫升范圍內(nèi)。由此可見PCV2 GC0505具有高 增殖活性。減毒圓環(huán)病毒PCV2 GC0505可以針對各種PCV2b病毒株具有免疫原性。PCV2 GC0504和PCV2 GC0505各自可以在豬細胞系中活體外或活體內(nèi)復制。所述 細胞系可以為永生化細胞系。所述細胞系可以選自由豬腎上皮細胞系H(-15與SK、單骨髓 細胞系3D4/31和睪丸細胞系ST組成的群組。在此以序列表形式附上本文所述的核苷酸序列，此公開內(nèi)容以引用的方式并入本 文中。將參考以下實例更詳細地描述本發(fā)明。這些實例僅用于說明目的，而不作為對本 發(fā)明范圍的限制。實例11.分離病毒和鑒定增殖活性使用 PCR和間接免疫熒光試驗(indirect immunofluorescence assay，IFA)從要 求在2005到2007之間的豬的樣本分離出PCV。用PCV分離株感染PK-15細胞，并且加以培 養(yǎng)以測量增殖病毒粒子數(shù)目，并且接著選擇具有最高增殖活性的PCV分離株。首先，在37°C下將冊-15細胞培養(yǎng)于補充有10%胎牛血清(FBS)的達爾伯克氏 改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM) (900毫升DMEMU00毫升10%胎牛血清(FBS)、100微克/毫升 鏈霉素、200國際單位/毫升青霉素和100微克/毫升卡那霉素)中形成單層。接著，從具 有單層的冊-15細胞移除培養(yǎng)基，并且通過用胰蛋白酶處理來由此分離出PK-15細胞。添 加104 5TCID5Q/0. 1毫升的PCV2到含有病毒的細胞懸浮液中以供接種，并且在37°C下靜止 培養(yǎng)細胞3到4天。凍融已培養(yǎng)的細胞三次以完全地破壞細胞，并且以每分鐘2，500轉的 速度離心細胞15分鐘。使用PCR和IFA測量在由離心獲得的上清液中PCV2的含量。結 果，鑒定出兩種PCV2分離株具有高病毒含量。然后，將這兩種分離株稱為PCV2 GC0504和 PCV2GC0505。PCV2 GC0504 為 PCV2_2a 病毒并且具有 SEQ ID NO :1 的基因組序列。PCV2 GC0505為PCV24b病毒并且具有SEQ ID NO :2的基因組序列。在培養(yǎng)基中復制PCV2 GC0504 和PCV2 GC0505,以便使其平均含量在IO5.6到IO7 0TCID50/毫升的范圍內(nèi)。經(jīng)鑒定，PCV2 GC0504和PCV2GC0505的增殖活性比現(xiàn)有的PCV2高10倍以上。因此，至少一種選自由PCV2 GC0504和PCV2 GC0505組成的群組的病毒可以有效地提供制備減毒或滅活疫苗所需的病 毒。因此，使用所獲得的PCV2(原液病毒(bulkvirus))來減毒以下病毒。在這點上，PCR為實時PCR。在實時PCR中，使用由Takara制造的SYBR綠作為試 劑。將通過稀釋IO6 tlTCID5ci/毫升的PCV2 GC0505 10次而獲得的樣品用作模板，并且使用對 PCV2 的 0RF2 具特異性的引物(5' -TAGGTT AGG GCT GTG GCC TT-3'正向引物，SEQ ID NO 7 ；禾口 5' -CCG CACCTT CGG ATA TAC TG-3'反向引物，SEQ ID NO :8)。將樣品維持在 94°C下10秒，在94°C下5秒，以及在60°C下40秒，并且重復此過程40次。預期擴增產(chǎn)物 為26;3bp。結果，以IOTCID5tl/毫升的濃度成功地檢測出病毒(圖1)。圖1為說明各種濃度 的PCV2的實時聚合酶鏈式反應(PCR)結果的圖。用實時PCR測得的Ct值與用IFA測得的病毒滴度之間的關系是以以下式1定義。式 1y = 4. 1291x+4. 458在式1中，y為Ct值，χ為IFA滴度(Iog10)，并且單位為TCID50/0. 1毫升。根據(jù) 式1，相關系數(shù)(R2)為0.9988，此指示可靠性為約99.9%。因為實時PCR顯示出能夠檢測 10TCID50/1毫升的病毒濃度的高靈敏度并且得以快速進行，因此其可有效地用于測量病毒。使用夾心間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(sandwich indirect enzyme-1 inkedimmunosorbent assay, ELISA) UlJfi PCV2 牛寺胃個生^#。首先，在包括2. 93克NaHC03、1. 59克Na2C03、1000毫升水和0. 5M碳酸鹽緩沖液的 包被緩沖液(PH 9. 6)中稀釋PCV2特異性抗體到5-10微克/孔的濃度，并且向ELISA板的 各孔添加100微升所稀釋的溶液并在37°C下吸附于ELISA板持續(xù)2小時。用PBS-T洗滌吸 附有抗體的ELISA板三次。向各孔中添加200微升阻斷緩沖液(BSA 1_2克、PBS 100毫升 1-2% BSA)并且將板維持在37°C下2小時。將板洗滌三次。接著，用PBS稀釋PCV2抗原10 倍到20倍，將所稀釋的溶液添加到各孔中，并且將板維持在37°C下1小時。將板洗滌三次。 接著，向抗原已敏化的板的各孔中添加通過用包括8. 0克NaCl、0. 2克無水KH2PO4U. 19克 無水Na2HPO4^O. 2克KCl和1000毫升水的稀釋緩沖液(pH 7. 2-7. 4)稀釋樣品(血清)到 1 50的比率而獲得的稀釋樣品(血清)，并且將板維持在37°C下1小時。用洗滌緩沖液 (Tween 200. 5毫升、PBS 1，000毫升0. 05% PBST)洗滌板五次，并且向板中添加100微升 已用稀釋緩沖液稀釋的抗GP IgG HRP結合物。將混合物維持在37°C下1小時。洗滌板五 次，并且向板的各孔中添加100微升的OPD底物。將板維持在室溫下10分鐘，并且向其中 添加50微升中止溶液(2. 5M ，然后在492納米下測量吸光度。將所分離的PCV2 GC0504和PCV2 GC0505接種到具有單層的冊_15細胞，并且在 37°C下培養(yǎng)細胞72小時，以獲得感染病毒的溶液。以每分鐘2，500轉的速度離心所述溶液 15分鐘，并且將上清液或凍干上清液保存在等于或低于-80°C的溫度下。2.病毒的減毒和制備包括減毒病毒的免疫原性組合物(2. 1)病毒的減毒在以上獲得病毒原液的操作1中，將濃度為IO6 tlTCID5c/毫升或以上的原液病毒用 于減毒。在補充有10% FBS的DMEM(900毫升DMEMUOOml毫升10% FBSUOO微克/毫升 鏈霉素、200國際單位/毫升青霉素和100微克/毫升卡那霉素)中將福爾馬林以0. 3% 的濃度添加到原液病毒中，并且將培養(yǎng)基維持在室溫下M小時以減毒PCV2 GC0504和 PCV2GC0505。使用減毒PCV2 GC0504和PCV2 GC0505作為原液物質來制備免疫原性組合物。(2. 2)制備免疫原性組合物將操作(2. 1)中制備的PCV2 GC0504和PCV2 GC0505各自的濃度分別設定為 IO6 ciTCID5tl/毫升，并且以45 45的比率混合PCV2 GC0504和PCV2 GC0505。向其中添加Motanide gel 到10% (w/w)的濃度，并且在室溫下以每分鐘100轉的速度攪拌混合物1 小時以上。將所制備的免疫原性組合物的PH值維持在6. 0-8. 0范圍內(nèi)，并且將福爾馬林的 濃度維持為等于或小于0.3重量％。除非另有說明，否則將在以下過程中使用在此制備的 免疫原性組合物。在下文中，免疫原性組合物也被稱為“疫苗”。(3)鑒定減毒和穩(wěn)定性(3. 1)鑒定減毒離心已減毒的樣品，并且向透析膜添加適量樣品。在4°C下用磷酸鹽緩沖溶液 (PBS)以樣品的100倍或以上的量透析樣品過夜，以移除減毒試劑。將所得物質用于實驗。使原代豬腎細胞或冊-15細胞在燒瓶(25平方厘米)中增殖以供組織培養(yǎng)。原 代細胞為已培養(yǎng)4-7天的細胞，并且經(jīng)鑒定，PK-15細胞在實驗之前未經(jīng)PCVl感染。從增 殖細胞移除培養(yǎng)基，將1毫升樣品接種到經(jīng)組織培養(yǎng)的細胞中并在37°C下敏化1小時。接 著，向其中添加用于維持細胞的新培養(yǎng)基，并且進一步培養(yǎng)細胞7天以鑒定細胞病變效應 (cytopathiceffect, CPE)。當移除上清液時，使用IFA鑒定豬圓環(huán)病毒的增殖。結果，在原代豬腎細胞或H(-15細胞中未觀察到由豬圓環(huán)病毒或任何其它 病毒引起的CPE。另外，在上清液中，未觀察到針對小雞和豬血細胞的血細胞凝集 (hemagglutination, HA)，并且用IFA未檢測到病毒。(3. 2)鑒定穩(wěn)定性使用體重在15-20克范圍內(nèi)的8只小鼠和體重在300-400克范圍內(nèi)的4只豚鼠。 另外，使用3到5周齡、未經(jīng)PCV2相關疫苗接種并未暴露于PCV2的2只健康幼豬。將0. 5毫升(106_tlTCID5tl/毫升)的組合物經(jīng)腹膜內(nèi)接種到8只小鼠體內(nèi)，將2毫升 (IO6 0TCID50/毫升)的組合物經(jīng)肌肉內(nèi)或皮下接種到4只豚鼠體內(nèi)，并將2毫升組合物經(jīng)腹 膜內(nèi)接種到兩只幼豬體內(nèi)，并且在7天內(nèi)觀察這些動物是否活著。在將IO6 tlTCID5ci/毫升的 單一劑量接種到2只幼豬頸部右側的肌肉中之后，觀察此2只幼豬是否在1到2小時內(nèi)具 有過敏反應或發(fā)燒現(xiàn)象以及是否在21天內(nèi)存活并且無如化膿或壞死的副作用。作為分不 同組接種組合物到小鼠、豚鼠和幼豬體內(nèi)的結果，它們在實驗期間均活著并無任何副作用。(3. 3)抗體滴度向動物投予免疫原性組合物，并且測量血清的抗體滴度。使用夾心間接ELISA或 IFA測量抗體滴度。準備體重在300到350克范圍內(nèi)的10只豚鼠。其中的8只用作接種組，而其余2 只用作對照組。經(jīng)皮下向接種組接種0.5毫升(106 tlTCID5ci/毫升)的組合物。在3周后， 抽取10只豚鼠的血液樣品，并使用IFA或夾心間接ELISA測量其抗體滴度。使用夾心間接ELISA測量的抗體滴度是通過將接種組T的平均吸光度(0. D.)除 以對照組C的平均吸光度(O.D.)來計算。當所述T/C為2.0或以上，用IFA獲得的接種組 的平均抗體滴度的T/C為1 倍或以上，并且對照組呈陰性時，可確定免疫原性組合物為適 當?shù)?。使用ELISA測量的抗體滴度展示于以下表1中。表 1編號組吸光度吸光度(T/C )1接種0. 889 Q丄對照0. 30/. yO接種0. 823· 4L對照0. 243接種0. 873_ 0對照0. 294接種0. 88O Q對照0. 30L · 7如表1所示，相較于對照組，免疫原性組合物具有適合于接種組(實驗組)的免疫 原性。3.鑒定免疫原性組合物的有效性此處，測定在動物體內(nèi)誘發(fā)免疫力所需的免疫原性組合物的最小量(最小免疫力 所需的抗原量)，并且鑒定當將免疫原性組合物接種到動物體內(nèi)時例如誘導免疫力的能力 和體重增加率的有效性。除了使用IO3-5UO4-5UO5-5^P IO6-5TCID50/毫升的PCV2滴度以外，使用相同免疫原 性組合物來測量最小免疫力所需的抗原量G次重復)。使用免疫原性組合物來測量有效 性。使用幼豬進行測定最小免疫力所需的抗原量的實驗。以2周的間隔分兩次向對豬 圓環(huán)病毒呈陰性的15只3周齡幼豬接種抗原含量為103 5、IO4 5UO5 5和IO6 5TCID5tl/毫升的 PCV2疫苗，并將3只幼豬用作對照組。在接種之前以及在從第二次接種起2周后抽取幼豬 的血液樣品，以測量PCV2的抗體滴度。使用幼豬測試免疫原性組合物的有效性。以2周的間隔分兩次向對豬圓環(huán)病毒呈 陰性的4只3周齡幼豬接種免疫原性組合物，并且將2只幼豬用作對照組。在第二次接種 的2周、4周、2個月、3個月和4個月之后抽取幼豬的血液樣品，并且使用ELISA測量PCV 抗體滴度以及使用IFA測量血清中和(serum neutralizing, SN)抗體滴度，此如上文所述 O^ort等人，2007 :Vet Microbiol 125，第M4-255頁)。使用ELISA獲得的抗體滴度指示 所有抗體均由抗原誘導產(chǎn)生，并且SN抗體滴度指示血清中和抗體滴度為在血清中存在的 抗體之間能夠中和病原體(如病毒)的抗體水平。另外，測量免疫原性組合物對幼豬體重增加率的影響。在第一次接種之前、在第二 次接種之前、在從第二次接種起2周后以及在從第二次接種起6周后，測量幼豬的體重，以 鑒定體重增加率。作為測量最小免疫力所需的抗原量以及使用ELISA測量第二次接種后的抗 體滴度的結果，在IO3 5 TCID5tl/毫升下鑒定出抗體滴度的變化。然而，當抗原含量大于 IO4-5TCID50/毫升時，相較于對照組，抗體滴度顯著增加(ρ < 0. 05)(表2)。表 2視PCV2含量而定的免疫原性(ELISA)
權利要求
1.一種用于治療或預防動物的圓環(huán)病毒感染的組合物，所述組合物包含至少一種選自 由減毒圓環(huán)病毒PCV2GC0504和PCV2GC0505組成的群組的減毒病毒。
2.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中PCV2GC0504包含具有SEQIDNO 1的核苷酸序 列的基因組。
3.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中PCV2GC0505包含具有SEQIDNO 4的核苷酸序 列的基因組。
4.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中PCV2GC0504和PCV2GC0505是通過與甲醛反應而被減毒。
5.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中PCV2GC0504和PCV2GC0505的量在單一劑量下 分別在 IO4-5TCID50 到 IO6-5TCID50 范圍內(nèi)。
6.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中用于預防和治療圓環(huán)病毒感染的所述圓環(huán)病毒 是選自由PCVh和PCV2b組成的群組。
7.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中用于預防和治療圓環(huán)病毒感染的所述圓環(huán)病毒 包含 PCMa 和 PCV2b。
8.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其進一步包含獸醫(yī)學上可接受的賦形劑。
9.根據(jù)權利要求8所述的組合物，其中所述賦形劑是莫他尼德凝膠。
10.根據(jù)權利要求8所述的組合物，其中所述賦形劑的量以所述組合物總重量計，在 5%到15%范圍內(nèi)。
11.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中所述動物是選自由豬、小鼠和豚鼠組成的群組。
12.—種產(chǎn)生減毒圓環(huán)病毒的方法，所述方法包含使至少一種選自由圓環(huán)病毒 PCV2GC0504和PCV2GC0505組成的群組的病毒與福爾馬林反應，從而制備減毒圓環(huán)病毒。
13.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中所述福爾馬林的量以反應溶液總重量計，在0.2 重量％到0.5重量％范圍內(nèi)。
14.一種治療或預防動物的圓環(huán)病毒感染的方法，所述方法包含向所述動物投予有效 量的根據(jù)權利要求1至11中任一權利要求所述的組合物。
15.根據(jù)權利要求14所述的方法，其中所述動物是選自由豬、小鼠和豚鼠組成的群組。
16.根據(jù)權利要求14所述的方法，其中所述組合物是以口服或非經(jīng)腸方式投予。
17.根據(jù)權利要求14所述的方法，其中所述組合物是以注射方式投予。
18.一種圓環(huán)病毒PCV2 GC0504，其包含具有SEQ ID NO=I的核苷酸序列的基因組。
19.一種圓環(huán)病毒PCV2 GC0505，其包含具有SEQ ID NO :4的核苷酸序列的基因組。
全文摘要
本發(fā)明提供一種在宿主細胞內(nèi)具有高復制能力的2型豬圓環(huán)病毒(PCV2)和其用途。
文檔編號C12N7/06GK102145165SQ20101019849
公開日2011年8月10日 申請日期2010年6月7日 優(yōu)先權日2010年2月4日
發(fā)明者姜普圭, 宋錞燮, 樸奉均, 金慧權 申請人:綠十字獸醫(yī)藥品株式會社