專利名稱：對豬進行抗豬圓環(huán)病毒免疫的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物健康領(lǐng)域，并提供用于保護豬抵抗性病原性豬圓環(huán)病毒2B型株 的方法和組合物。更具體而言，本發(fā)明涉及新近鑒定的病原性豬圓環(huán)病毒2B型株、編碼這 些2B型株的核酸序列及由這些核酸序列編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及用于誘發(fā)對病原性 豬圓環(huán)病毒的免疫應(yīng)答的方法和組合物，其通過施用包含免疫原性有效量的這些2B型豬 圓環(huán)病毒中的至少一種，或編碼這些2B型豬圓環(huán)病毒中的至少一種的核酸或由這些核酸 編碼的蛋白質(zhì)中的至少一種的組合物。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus, PCV)是一種小的二十面體無包膜病毒，含有 大約1. 76kb的單鏈環(huán)狀DNA基因組。其最初是作為豬腎細胞系PK-I 5的細胞培養(yǎng)污染 物而分離到的(I. Tischer 等人，Nature 295:64-66(1982) ；I. Tischer 等人，Zentralbl. Bakteriol. Hyg. Otg. A. 226 (2) 153-167 (1974))。PCV 歸類于圓環(huán)病毒科家族，該病毒 科由三個其他的動物圓環(huán)病毒(雞貧血病毒(CAV)，鸚鵡喙羽病病毒(psittacine beak and feather disease virus, PBFDV)以及最近發(fā)現(xiàn)的來自鴿子的鴿圓環(huán)病毒(columbid circovirus, CoCV))以及三種植物圓環(huán)病毒(香蕉束頂病毒，椰子葉衰敗病毒和地三葉草 矮化病毒)構(gòu)成(M. R. Bassami 等人，Virology 249:453-459(1998) ；J. Mankertz 等人， Virus Genes 16:267-276(1998) ；A. Mankertz 等人，Arch. Virol. 145 :2469_2479 (2000)； B. Μ. Meehan 等人，J. Gen. Virol. 78 :221_227 (1997) ；B. M. Meehan 等人，J. Gen. Virol. 79 2171-2179(1998) ；D. Todd 等人，Arch. Virol. 117 129-135 (1991))。三種之前識別的 動物圓環(huán)病毒成員(PCV、CAV、*PBFDV)相互不分享核苷酸序列同源性或抗原決定簇 (M. R. Bassami等人，1998，見前文；D. Todd等人，1991，見前文)。用PK-15細胞-衍生的PCV 對豬進行實驗性感染沒有產(chǎn)生臨床疾病，因此不認為此病毒對豬有病原性(G. M. Allan等 人，Vet. Microbiol. 44 :49_64(1995) ；I. Tischer 等人，Arch. Virol. 91 :271_276 (1986))。 將這種衍生自污染的PK-15細胞系的非病原性PCV指定為1型豬圓環(huán)病毒或PCVl。斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)首先描述于 1991 年(J. C. Harding 和 E.G. Clark, Swine Health and Production 5 :201-203 (1997))，是斷奶仔豬的一種復(fù)雜疾病，其正變得越來越廣泛。PMWS主要影響 5-18周齡的豬。臨床PMWS表征包括進行性體重下降、呼吸困難、呼吸急促、貧血、腹瀉以及 黃疸。死亡率在-2%內(nèi)變動，在英國的一些復(fù)雜病例中高達40% (M. Muirhead, Vet. Rec. 150 :456(2002))。PMWS的鏡檢病理特征包括肉芽腫性間質(zhì)性肺炎、淋巴結(jié)病、肝炎和 腎炎(G.M-Allan 和 J. A.Ellis, J. Vet. Diagn. Invest. 12 3-14(2000) ; J. C. Harding 禾口 Ε. G. Clark, Swine Health and Production 5:201—203(1997))。雖然PCVl在豬中廣泛存在，卻對豬沒有病原性。PMWS主要的致病因子通常 是標注為2型豬圓環(huán)病毒或PCV2的PCV的病原性株(G. M. Al Ian等人，Vet. Rec. 142 467-468 (1998) ；G. M. Allan 等人，J. Vet. Diagn. Invest. 10 :3_10 (1998) ；G. M. Allan 等 A, Vet. Microbiol. 66 115-23 (1999) ；G.M.Allan 禾口 J. A. Ellis, J. Vet. Diagn.Invest. 12 :3-14 (2000) J.Ellis 等人 Can. Vet. J. 39 44-51(1998) ； A. L. Hamel 等人， J. Virol. 72 :5262_5267 (1998) ；B. M. Meehan 等人，1998，見前文；I. Morozov 等人，J. Clin. Microbiol. 36 =2535-2541 (1998))。已經(jīng)確定了 PMWS-相關(guān)PCV2的完整基因組序列 (M. Fenaux 等人，J. Clin. Microbiol. 38 :2494_503 (2000) ；A. L. Hamel 等人，1998，見前文； J. Mankertz 等人，1998，見前文；B. M. Meehan 等人，1997，見前文；B. M. Meehan 等人，1998，見 前文；I. Morozov等人，1998，見前文)。序列分析顯示PMWS-相關(guān)PCV2與非病原性PCVl只共有大約75 %的核苷酸序列同 一性。非病原性PCVl和病原性PCV2 二者的0RF2基因都編碼主要免疫原性病毒衣殼蛋白質(zhì) (P. Nawagitgul 等人’ Immunol. Clin. Diagn. Lab Immunol. 1 33-40 (2002) ；P. Nawagitgul 等人，J. Gen. Virol. 81 :2281_2287 (2000))。由于其對豬產(chǎn)業(yè)的潛在影響，開發(fā)抗PCV2的疫苗變得至關(guān)重要。例如，美國專利 號6，287，856 (Poet等人)和WO 99/45956描述了來自鸚鵡喙羽病病毒(BFDV)(感染鳥類 的圓環(huán)病毒)以及來自豬圓環(huán)病毒(PCV)的核酸。該專利提出包含裸DNA或mRNA的疫苗 組合物并公開了用于在真核細胞中PCV瞬時表達的核酸載體，其包含衍生自人巨細胞病毒 的順式作用轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控序列或者功能性連接于所述序列的核酸上的早期基因增強子 或啟動子。美國專利號6，217，883 (Allan等人)以及法國專利號2，781，159B描述了從加 拿大、加尼弗尼亞和法國(布列塔尼)的PMWS感染豬獲得的肺或神經(jīng)節(jié)樣品中分離五 種PCV株，及其與至少一種豬細小病毒抗原組合用于疫苗/免疫原性組合物的用途。由 0RF1-0RF13構(gòu)成的PCV2開放閱讀框(ORF)編碼的蛋白質(zhì)在專利中已有廣泛描述，但沒有 任何顯示出免疫原性屬性的特異性蛋白質(zhì)的范例。該專利進一步描述了由DNA質(zhì)粒、線性 DNA分子以及含有并在體內(nèi)表達編碼PCV抗原的核酸分子的重組病毒構(gòu)成的載體。若干其他參考文獻，例如，美國專利號6，391，314 Bl ；美國專利號6，368，601 Bl ；法國專利號 2，769，321 ；法國專利號 2，769，322 ；W001/96377 A2 ；WO 00/01409 ；WO 99/18214 ；WO 00/77216 A2 ；W001/16330 A2 ；WO 99/29871 ；等等，描述了施用作為疫苗組 合物的PCVl或PCV2多肽或編碼多種病毒株的多肽的核酸。本文任何參考的引用不應(yīng)當被認為是承認這些參考作為先于本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。發(fā)明概述在其最廣的方面，本發(fā)明提供對兩種新型2型豬圓環(huán)病毒(PCV2)株的分離和鑒 定，其中每種病毒株可單獨使用或組合使用，用來制備用于保護豬抵抗免受病原性PCV2感 染或用于減輕至少一種與斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)相關(guān)的癥狀的疫苗或免疫原性 組合物.因此，本發(fā)明的第一個方面提供了分離的2型豬圓環(huán)病毒，其基因組包含SEQ ID N0:1(標注為FD07)或2(標注為FDJE)中任何一個的核酸分子，或其基因組包含與SEQ ID NO :1或2中任何一個有至少95%序列同源性的核酸分子。在一個實施方式中，所述兩種新近鑒定和分離的豬圓環(huán)病毒為2B型豬圓環(huán)病毒 (PCV2B)。在一個實施方式中，分離的豬圓環(huán)病毒具有與SEQ ID N0:3(來自FD 07)或4(來 自FDJE)中任何一個有至少92%序列同一性的0RF2蛋白質(zhì)。
在一個實施方式中，分離的豬圓環(huán)病毒具有包含SEQ ID NO :3或4中任何一個的 氨基酸序列的0RF2蛋白質(zhì)。本發(fā)明第二個方面提供了編碼病原性2B型豬圓環(huán)病毒或編碼至少一種來自所述 圓環(huán)病毒的蛋白質(zhì)的分離的核酸分子，其中核酸分子包含與SEQ ID NO :1或2中任何一個 有至少95%序列同源性的核苷酸序列。在一個實施方式中，分離的核酸分子包含SEQ ID NO :1或2中任何一個的核苷酸 序列。在一個實施方式中，編碼FD07的ORFl復(fù)制酶蛋白質(zhì)的分離的核酸分子包含SEQ ID NO 5的殘基51-995，以及編碼FD07的0RF2衣殼蛋白質(zhì)的分離的核酸分子包含SEQ ID NO 5 的殘基 1033-1734。在一個實施方式中，編碼FDJE的ORF 1復(fù)制酶蛋白質(zhì)的分離的核酸分子包含SEQ ID NO 6的殘基51-995，以及編碼FDJE的0RF2衣殼蛋白質(zhì)的分離的核酸分子包含SEQ ID NO 6 的殘基 1033-1734。在一個實施方式中，分離的核酸分子編碼具有如SEQ ID NO :3或4中所示的氨基 酸序列的0RF2蛋白質(zhì)。本發(fā)明第三個方面提供了包含以下的至少一種的免疫原性或疫苗組合物至少一 種本文描述的分離的2B型豬圓環(huán)病毒，或其組合；編碼至少一種本文描述的分離的2B型豬 圓環(huán)病毒的至少一種核酸分子；編碼來自至少一種本文描述的分離的2B型豬圓環(huán)病毒的 至少一種蛋白質(zhì)的至少一種核酸分子；或獲自至少一種本文描述的分離的2B型豬圓環(huán)病 毒的至少一種蛋白質(zhì)以及藥學(xué)可接受佐劑。在一個實施方式中，疫苗或免疫原性組合物可包含以下的一種或多種a)活的/減毒或修飾的活PCV2B，其基因組包含SEQ ID NO 1或2中任何一個的 核酸分子；b)滅活/失活的PCV2B，其基因組包含SEQ ID NO 1或2中任何一個的核酸分子；c)PCV2B DNA疫苗(例如，質(zhì)粒載體，其表達基因組包含SEQ IDNO :1或2中任何 一個核酸分子的PCV2B的0RF2)；或d)失活的病毒載體(例如棒狀病毒、腺病毒、或痘病毒(如浣熊痘病毒)、或細菌 (如大腸桿菌))，其表達基因組包含SEQ ID N0:1或2中任何一個核酸分子的PCV2B的 0RF2。在一個實施方式中，其中ORF 2基因獲自SEQ ID NO 1或2的2B型豬圓環(huán)病毒的 疫苗或免疫組合物可能交叉保護抵抗豬的2A型、2C型或2D型株或任何其他變體。施用這 種疫苗或免疫原性組合物導(dǎo)致保護豬抵抗低毒力/低死亡率的2A型株，也導(dǎo)致交叉保護抵 抗病原性豬圓環(huán)病毒高毒力/高死亡率的2B型株。所使用的疫苗或免疫原性組合物可以 單劑量或多劑量施用。施用導(dǎo)致保護豬免受斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)相關(guān)的任何 一種或多種癥狀或后遺癥。而且，施用包含任何上文提到的實施方式的疫苗或免疫原性組 合物還降低了與豬圓環(huán)病毒高毒力/高死亡率的2B型株相關(guān)的高于平均的死亡率。在一個實施方式中，上文描述的免疫原性或疫苗組合物可用于誘發(fā)抗豬圓環(huán)病毒 的免疫應(yīng)答，或用于保護豬抵抗病原性PCV2感染，或用于減輕與此疾病相關(guān)的至少一種癥 狀。
在一個實施方式中，上文描述的免疫原性或疫苗組合物進一步包含至少一種其他 的微生物體，或獲自所述微生物體的需要針對其產(chǎn)生免疫應(yīng)答的抗原。在一個實施方式 中，上文描述的免疫原性或疫苗組合物進一步包含編碼來自至少一種其他微生物體(需 要對其產(chǎn)生免疫應(yīng)答)的至少一種抗原的至少一種其他核酸分子。這些其他的微生物體 可選自豬生殖和呼吸綜合征病毒(PRRS)、豬細小病毒(PPV)、豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)、畐Ij豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)、多殺巴其jf德氏菌(Pasteurella multocida)、鏈球菌(Streptococcum suis)、胸膜月市炎方文線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、支氣管炎博德特菌(Bordetellabronchis印tica)、豬霍舌L沙門氏菌 (Salmonella choleraesuis)、豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopa thiae)、鉤端 螺旋體細菌、豬流感病毒、大腸埃希氏菌(Escherichia coli)抗原、豬呼吸冠狀病毒、輪狀 病毒、引起偽狂犬病(Aujesky' s Disease)的病原體、引起豬傳染性腸胃炎的病原體、以 及豬圓環(huán)病毒的第二種不同株。豬圓環(huán)病毒的第二種不同株可以為2A或2B型圓環(huán)病毒。
在一個實施方式中，免疫原性或疫苗組合物與或不與佐劑一起施用。在一個實施方式中，免疫原性或疫苗組合物以單劑量或多劑量皮下、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、 透皮、肝內(nèi)、或通過淋巴內(nèi)途徑施用。本發(fā)明第四個方面提供了一種方法，即免疫豬抵抗病毒感染或斷奶后多系統(tǒng)衰竭 綜合征(PMWS)，或用于預(yù)防由PCV2株引起的豬體內(nèi)的PMWS，或用于減輕與PMWS相關(guān)的至 少一種癥狀，包括對豬施用免疫原性有效量的包含以下一種或多種的組合物a)免疫原性有效量的至少一種由SEQ ID NO 1或2中任何一個核酸分子編碼的2 型豬圓環(huán)病毒，如本文描述的；b)編碼a)的至少一種2型豬圓環(huán)病毒的核酸分子；c)免疫原性有效量的分離自a)的至少一種2型豬圓環(huán)病毒的至少一種蛋白質(zhì)； 或d)免疫原性有效量的編碼C)的至少一種蛋白質(zhì)的至少一種核酸分子。在一個實施方式中，本發(fā)明提供用于免疫或保護豬抵抗豬圓環(huán)病毒的至少一種病 原性株方法，通過施用疫苗或免疫原性組合物，其包含非毒性、生理可接受的載體以及免疫 原性有效量滅活/失活的2型豬圓環(huán)病毒，或活的減毒2型豬圓環(huán)病毒，如本文所描述的， 其基因組包含SEQ ID NO :1或2中任何一個的核酸分子。在一個實施方式中，本發(fā)明的方 法提供了免疫或保護豬抵抗豬圓環(huán)病毒感染，通過施用疫苗或免疫原性組合物，如上文描 述的，其進一步包含佐劑。在一個實施方式中，本發(fā)明提供用于免疫或保護豬抵抗豬圓環(huán)病毒的病原性2B 型株的方法，通過施用疫苗或免疫原性組合物，其包含編碼如SEQ ID NO :1或2所示的2型 豬圓環(huán)病毒的感染性核酸，其中的施用導(dǎo)致一種或多種豬圓環(huán)病毒感染癥狀的減輕。在一個實施方式中，本發(fā)明提供用于免疫或保護豬抵抗豬圓環(huán)病毒的病原性2B 型株的方法，通過施用免疫性有效量的疫苗或免疫原性組合物，其中所述組合物包含來自 如本發(fā)明描述的2型豬圓環(huán)病毒的至少一種蛋白質(zhì)，或編碼來自本發(fā)明的2型豬圓環(huán)病毒 的蛋白質(zhì)的核酸。在一個實施方式中，來自本發(fā)明的2B型豬圓環(huán)病毒的蛋白質(zhì)是0RF2蛋白 質(zhì)。在一個實施方式中，編碼來自本發(fā)明2B型豬圓環(huán)病毒(標注為FD07和FDJE)的0RF2 蛋白質(zhì)的0RF-2基因，分別包含如前述SEQ ID NO 5和6中核苷酸序列的殘基1033-1074，并且由FD07和FDJE的0RF-2基因編碼的蛋白質(zhì)分別包含如前述SEQ ID NO 3和4中的氨
基酸序列。在一個實施方式中，本發(fā)明提供用于免疫或保護豬抵抗豬圓環(huán)病毒的病原性2B 型株的方法，包括施用疫苗或免疫原性組合物，其包含2型豬圓環(huán)病毒，或編碼2型豬圓環(huán) 病毒的核酸，其中豬圓環(huán)病毒由如前所述SEQ ID NO :1或2中的核苷酸序列、其互補鏈、或 與SEQ IDNO 1或2中的核苷酸序列具有至少95%同源性的核酸序列編碼。在一個實施方式中，本發(fā)明提供用于免疫或保護豬抵抗豬圓環(huán)病毒的病原性2B 型株的方法，通過施用疫苗或免疫原性組合物，其包含兩種新型2B型豬圓環(huán)病毒中的至少 一種或編碼本發(fā)明的兩種新型2B型豬圓環(huán)病毒中的至少一種的核酸，或來自本發(fā)明的兩 種2B型株中的至少一種的至少一種蛋白質(zhì)，或編碼這兩種蛋白質(zhì)中的至少一種的核酸，其 中豬圓環(huán)病毒的病原性2B型株為豬圓環(huán)病毒的病毒株，其含有由ORF 2基因編碼的衣殼蛋 白質(zhì)，其顯示出與本發(fā)明描述的兩種豬圓環(huán)病毒2B型株中的至少一種的0RF2基因編碼的 衣殼蛋白質(zhì)不少于92%的序列同一性。SEQ ID NO :3和4顯示了本發(fā)明描述的豬圓環(huán)病毒 2B型株的衣殼蛋白質(zhì)的氨基酸序列。在一個實施方式中，本發(fā)明的方法提供了免疫或保護豬抵抗2B型豬圓環(huán)病毒的 病原性株的感染，包括對豬施用疫苗或免疫原性組合物，其包含2B型豬圓環(huán)病毒，或編碼 2B型豬圓環(huán)病毒或編碼來自本發(fā)明所述的豬圓環(huán)病毒的至少一種蛋白質(zhì)的核酸，其中所述 的施用導(dǎo)致一種或多種以下臨床癥狀的減輕在暴露于2B-型豬圓環(huán)病毒的毒力形式時，豬的一種或多種淋巴或非_淋巴組織 中鏡檢病灶的減少；與豬圓環(huán)病毒感染相關(guān)的病毒血癥的減少；一種或多種組織中2A-型或2B-型核酸水平的減少。在一個實施方式中，所述方法進一步包括在施用如本文描述的2型豬圓環(huán)病毒免 疫原性組合物之前、與之聯(lián)合或之后施用免疫原性有效量的第二種不同的免疫原性組合 物。在一個實施方式中，第二種不同的免疫原性組合物包含免疫原性有效量的至少一 種其他的對豬有病原性的微生物體，或獲自所述的微生物體的至少一種抗原或編碼所述抗 原的核酸分子，其中微生物體選自豬生殖和呼吸綜合征病毒(PRRS)、豬細小病毒(PPV)、 豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌、多殺巴斯德氏菌、鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌、支氣管炎博德 特菌、豬霍亂沙門氏菌、豬紅斑丹毒絲菌、鉤端螺旋體細菌、豬流感病毒、大腸埃希氏菌抗 原、豬呼吸冠狀病毒、輪狀病毒、引起偽狂犬病的病原體、引起豬傳染性腸胃炎的病原體以 及豬圓環(huán)病毒的第二種不同株。豬圓環(huán)病毒的第二種不同株可以為2A或2B型圓環(huán)病毒。本發(fā)明的第五個方面提供了載體，其包含編碼2A型或2B型豬圓環(huán)病毒蛋白質(zhì)的 至少一種外源核酸分子，其中豬圓環(huán)病毒蛋白質(zhì)是0RF2蛋白質(zhì)，并且其中編碼所述蛋白質(zhì) 的外源核酸分子如SEQ ID NO :5或6的殘基1033-1734所示。在一個實施方式中，載體是浣熊痘病毒載體，其含有編碼如本文所描述的PCV2A 或PCV2B豬圓環(huán)病毒的至少一種或二種的核酸分子。在一個實施方式中，載體進一步包含編碼來自對豬有病原性的微生物體的抗原的 一種或多種外源核酸分子，其中微生物體選自豬生殖和呼吸綜合征病毒(PRRS)、豬細小病毒(PPV)、豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌、多殺巴斯德氏菌、鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌、支 氣管炎博德特菌、豬霍亂沙門氏菌、豬紅斑丹毒絲菌、鉤端螺旋體細菌、豬流感病毒、大腸埃 希氏菌抗原、豬呼吸冠狀病毒、輪狀病毒、引起偽狂犬病的病原體、引起豬傳染性腸胃炎的 病原體以及豬圓環(huán)病毒的第二種不同株。本發(fā)明的第六個方面提供了確定豬哺乳動物是否患有斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征 (PMWS)或是否處于發(fā)展斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)風險的方法，該方法包括(I)測量衍生自哺乳動物組織樣品中PCV2核酸或由所述核酸編碼的蛋白質(zhì)的量， 其中所述的PCV2核酸或蛋白質(zhì)為a)包含SEQ ID NO :1、2、5或6中任何一個的核酸，或由其衍生的核酸；b)包含SEQ ID NO :3或4中任何一個的蛋白質(zhì)；c)包含與SEQ ID NO :1、2、5或6中任何一個或其互補物在高度嚴格配對的條件 下可雜交的序列的核酸，或包含由所述可雜交的序列編碼的序列的蛋白質(zhì)；d)與SEQ ID NO :1、2、5或6中任何一個或其互補物具有用NBLAST算法確定的至 少95%同源性的核酸；或由其編碼的蛋白質(zhì)；以及(II)將來自懷疑患有PMWS或處于發(fā)展PMWS的風險的哺乳動物組織樣品中所述核 酸或蛋白質(zhì)的量與來自正常哺乳動物組織樣品中存在的核酸或蛋白質(zhì)的量，或與對正常組 織樣品預(yù)先確定的標準進行比較，其中相比于正常組織樣品中的量或?qū)φ＝M織樣品預(yù)先 確定的標準，來自患有或懷疑患有PMWS的豬哺乳動物組織樣品中所述核酸或蛋白質(zhì)的升 高的量表示哺乳動物患有PMWS或處于發(fā)展PMWS的風險。在一個實施方式中，用于確定豬哺乳動物是否患有PMWS或處于發(fā)展PMWS的風險 的方法提供了測量組織樣品中本發(fā)明的PCV 2B的核酸或蛋白質(zhì)的量，所述組織樣品選自 腹股溝淺淋巴結(jié)、氣管支氣管淋巴結(jié)、頌下淋巴結(jié)、肺、扁桃體、脾、肝、腎、全血和血細胞。附圖簡述

圖1.標注為FD07的2B型豬圓環(huán)病毒的完整基因組序列(SEQ IDNO 1)。圖2.標注為FDJE的2B型豬圓環(huán)病毒的完整基因組序列(SEQ IDNO 2)。圖3.標注為FD07的PCV2B的0RF2衣殼蛋白質(zhì)的氨基酸序列(SEQ ID NO :3)。圖4.標注為FDJE的PCV2B 0RF2衣殼蛋白質(zhì)的氨基酸序列(SEQID NO 4)。圖5.編碼FD07的ORFl和0RF2蛋白質(zhì)的核酸序列(SEQ IDNO 5)。圖6.編碼FDJE的ORFl和0RF2蛋白質(zhì)的核酸序列(SEQ ID NO 6)。發(fā)明詳述在描述本方法和處理方法學(xué)之前，要理解的是本發(fā)明不限于所描述的具體的方 法，以及實驗條件，因為這些方法和條件可能變化。還要理解的是本文使用的術(shù)語學(xué)是僅僅 為了描述具體實施方式
的目的，不預(yù)期為限制性的。如本說明書和附加權(quán)利要求中使用的，單數(shù)形式的“一”、“一個”和“這個”包括復(fù) 數(shù)指代，除非內(nèi)容里清楚地指明另外的意思。因此，例如，提到“方法”包括一種或多種方法， 和/或本文描述的和/或使本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀本公開后變得清楚的類型的步驟等等。因此，在本申請中，可采用本領(lǐng)域之內(nèi)的傳統(tǒng)分子生物學(xué)，微生物學(xué)和重組DNA技 術(shù)。這些技術(shù)在文獻中有全面的解釋。見例如，Sambrook，F(xiàn)ritsch & Maniatis，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Second Edition(1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, New Yorkdt的"Sambrook ^Λ,1989“ ) ；DNA Cloning A Practical Approach, Volumes I and II(D. N. Glover ed. 1985) ；Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait ed. 1984) ；Nucleic Acid Hybridization(B. D. Hames &S. J. Higgins eds. (1985)) ；Transcription And Translation(B. D. Hames & S. J. Higgins，eds. (1984))； Animal Cell Culture(R. I. Freshney, ed. (1986)) ；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press, (1986)) ；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)； F. Μ· Ausubel 等人(eds.), Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)。盡管任何類似于或等價于本文所描述的那些的方法和材料可用于本發(fā)明的實踐 或測試，現(xiàn)在描述的是優(yōu)選的方法和材料。本文提到的所有出版物以其全文并入本文作為參考。定義本文使用的術(shù)語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員認可和已知的意義，然而，為了方便和完整 性，在下文闡述具體術(shù)語及其意義。術(shù)語“佐劑”指的是增強對抗原的免疫應(yīng)答的化合物或混合物。佐劑可起組織 儲庫的作用，緩慢釋放抗原，也可起淋巴系統(tǒng)激活物的作用，非-特異性地增強免疫應(yīng)答 (Hood等人，Immunology，Second Ed. , 1984, Benjamin/Cummings :Menlo Park，California， P. 384)。根據(jù)環(huán)境，沒有佐劑單獨以抗原產(chǎn)生的主要攻擊可能不能誘發(fā)體液或細胞的免 疫應(yīng)答。佐劑包括但不限于，完全弗氏佐劑，不完全弗氏佐劑，皂苷，礦物膠如氫氧化鋁， 表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂，復(fù)合多元醇，聚陰離子，肽，油或烴類乳劑，鑰孔血藍蛋白，二 硝基苯酚，以及潛在有用的人佐劑如BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。優(yōu)選地，佐劑為藥學(xué)可接受的。通過“抗原”，指的是根據(jù)本發(fā)明，含有一種或多種能夠在抗原存在時刺激宿主免 疫系統(tǒng)產(chǎn)生細胞抗原_特異性免疫應(yīng)答或體液抗體應(yīng)答的表位的分子。正常地，表位包 括大約3-15之間，通常大約5-15個氨基酸。給定蛋白質(zhì)的表位可使用許多表位作圖技 術(shù)進行鑒定，這些在本領(lǐng)域熟知。見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed. , 1996) Humana Press, Totowa, N. J0例如， 線性表位可通過例如，同時在固相支持物上合成大量肽，對應(yīng)于蛋白質(zhì)分子的部分的肽，并 將這些肽與抗體反應(yīng)(同時肽仍然連接于支持物)而確定。這些技術(shù)在本領(lǐng)域已知并在例 如，美國專利號 4，708，871 ；Geysen 等人(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 3998-4002 ； Geysen等人(1986)Molec. Immunol. 23 :709_715中有所描述，其以全文并入本文作為參 考。類似地，構(gòu)象的表位容易通過確定氨基酸空間構(gòu)象而鑒定，如通過例如，χ-光結(jié)晶學(xué)和 2-維核磁共振。見，例如Epitope Mapping Protocols (見前文)。進一步地，用于本發(fā)明 的目的，“抗原”指的是包括對天然序列有修飾，如缺失，添加和取代(通常本質(zhì)上是保守性 的，但它們可能為非-保守性的)的蛋白質(zhì)，只要此蛋白質(zhì)保持了誘發(fā)免疫學(xué)應(yīng)答的能力。 這些修飾可能是有意的，如通過定向點突變或通過特定的合成步驟，或通過遺傳工程手段， 或可能為意外的，如通過產(chǎn)生這些抗體的宿主的突變。如本文使用的用于描述例如“減毒病毒”等等中的術(shù)語“減毒”，指的是微生物體， 例如，病毒，其在體外或在體內(nèi)生長或復(fù)制的能力受限。
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除非有另外有指出，如本文使用的術(shù)語“圓環(huán)病毒”，指的是歸類于圓環(huán)病毒科家 族的任何圓環(huán)病毒株。例如，在本發(fā)明中，圓環(huán)病毒為病原性豬圓環(huán)病毒。在具體實施方式
中，病原性豬圓環(huán)病毒為低毒力/低死亡率的2A型豬圓環(huán)病毒株或高毒力/高死亡率的2B 型豬圓環(huán)病毒株。在其認可的意義之內(nèi)，“互補的”被理解為鑒定一條序列中的核苷酸與另一條序列 中的核苷酸根據(jù)規(guī)則A — T，U和C — G(反之亦然)進行雜交(退火)，并且因此在本定義 之內(nèi)“匹配”其伙伴。酶轉(zhuǎn)錄具有可測量的且已經(jīng)熟知的錯誤率(根據(jù)具體所使用的酶)， 因此在使用了本文描述的模式的轉(zhuǎn)錄精確度的限制之內(nèi)，表現(xiàn)在技術(shù)工作者會理解酶的互 補鏈合成的保真度不是絕對的，且擴增子不必在每個核苷酸上與靶標或模板RNA完全匹 配。使用高度嚴格條件的步驟如下。對含有DNA的濾紙進行預(yù)雜交，在包含6X SSC、50mM Tris-HCKpH 7. 5) UmM EDTA、0. 02% PVP、0. 02%聚蔗糖(Ficoll)、0. 02% BSA 和 500 μ g/ ml變性鮭精DNA的緩沖液中在65°C下進行8h至過夜。在65°C下，將濾紙在含有100 μ g/ ml變性鮭精DNA和5-20X106cpm的32P-標記探針的預(yù)雜交混合物中雜交48h。在37°C下， 在含有2X SSC,0. 01 % PVP,0. 01 % Ficoll和0. 01 % BSA的溶液中對濾紙進行Ih的洗 滌。接著在放射自顯影前在0. IX SSC中在50°C下洗滌45min。其他可使用的高度嚴格條 件是本領(lǐng)域熟知的。(見，例如 Sambrook 等人，1989，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York ； 另見，Ausubel 等人，eds. , in the Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals,1987-1997Current Protocols, 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.)。要注意的是在本公開中，術(shù)語如“包括”，“所包括的”，“包括著”，“包含”，“含有”等 等可具有美國專利法中歸于其的意義；例如，它們的意思可以是“包括”，“包括在內(nèi)”，“包括 著”等等。術(shù)語如“基本上由……構(gòu)成”與“基本上由……組成”具有美國專利法中歸于其 的意義，例如，它們允許包括不減損本發(fā)明新型或基本特征的其他成分或步驟，即，它們排 除了減損本發(fā)明新型或基本特征的其他未提及成分或步驟，它們排除了在先技術(shù)的成分或 步驟，如本文引用的或作為參考并入的文獻，尤其是當定義可申請專利的實施方式為此文 獻的一個目標時，例如，對于在先技術(shù)是新型，不明顯的，發(fā)明性的，例如對于本文引用的或 作為參考并入的文獻。并且，術(shù)語“由……構(gòu)成”及“由……組成”具有美國專利法中歸于其 的意義；即，這些術(shù)語為封閉式的。“所編碼的”或“編碼”指的是編碼多肽序列的核酸序列，其中多肽序列含有至少 3-5個氨基酸，更優(yōu)選地至少8-10個氨基酸，甚至更優(yōu)選地至少15-20個氨基酸的氨基酸序 列，由所述核酸序列編碼的多肽。還包括的是多肽序列，其可以由此序列編碼的多肽免疫學(xué) 地鑒定。因此，抗原“多肽”、“蛋白質(zhì)”或“氨基酸”序列可具有與抗原的多肽或氨基酸序列 至少70 %的相似性，優(yōu)選地至少大約80 %的相似性，優(yōu)選地至少大約90-95 %的相似性，最 優(yōu)選地至少大約99 %的相似性。如本發(fā)明上下文中使用的，“基因”為有相關(guān)聯(lián)的遺傳學(xué)功能的核酸分子(染色體， 質(zhì)粒，等等)中的核苷酸的序列?；驗槔缟矬w的一個遺傳單位，包括一段多聚核苷酸 序列(例如，哺乳動物的DNA序列)，其在生物體的基因組之內(nèi)占據(jù)特定的物理位置(“基 因座”或“遺傳座”)?；蚩梢跃幋a表達的產(chǎn)物，如多肽或多聚核苷酸(例如，tRNA)。備選地，基因可以限定對于具體事件/功能，如蛋白質(zhì)和/或核酸結(jié)合的基因組位置(例如，噬 菌體附著位點)，其中基因不編碼表達的產(chǎn)物。通常，基因包括編碼序列，如多肽編碼序列， 和非-編碼序列，如啟動子序列、多-腺苷酸化序列、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(例如增強子序列)。許 多真核基因具有“外顯子”(編碼序列)，其被“內(nèi)含子”(非-編碼序列)隔斷。在特定情 況下，一個基因與其他一個或多個基因(例如，重疊基因)共有序列。因此，“同源性”或“同一性”或“相似性”指的是兩條肽或兩個核酸分子之間的序 列相似性。同源性可通過比較每個序列中的位置而確定，這些序列可經(jīng)比對而用于比較的 目的。當進行比較的序列中一個位置被相同堿基或氨基酸占據(jù)時，則該分子在那個位置處 是相同的。核酸序列之間的同源性或相似性或同一性程度為這些核酸序列共有的位置上相 同或匹配的核苷酸數(shù)量的函數(shù)。氨基酸序列的同一性程度為這些氨基酸序列共有的位置上 相同的氨基酸數(shù)量的函數(shù)。氨基酸序列的同源性或相似性程度為氨基酸，即，在這些氨基酸 序列共有的位置上結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸數(shù)量的函數(shù)?！安幌嚓P(guān)”或“非-同源”序列與本發(fā)明 序列之一共有低于40%的同一性，盡管優(yōu)選地為低于25%的同一性。因此，豬圓環(huán)病毒的 “同源物”或其片段應(yīng)當與豬圓環(huán)病毒或其片段共有至少大約75%的同源性(優(yōu)選地大約 80%同源性，更優(yōu)選地大約90-95%的同源性，最優(yōu)選地大約99%的同源性)。對疫苗或免疫原性組合物的“免疫應(yīng)答”在受試者中產(chǎn)生對抗原或感興趣疫苗組 合物中存在的分子的體液和/或細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。對于本發(fā)明的目的，“體液免疫應(yīng) 答”為抗體_介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，涉及對本發(fā)明的抗原/疫苗具有親和力的抗體的產(chǎn)生，而“細 胞_介導(dǎo)的免疫應(yīng)答”為由T-淋巴細胞和/或其他白細胞介導(dǎo)的應(yīng)答。“細胞-介導(dǎo)的免 疫應(yīng)答”是通過與主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的I類或II類分子相關(guān)的抗原性表位的呈 遞而誘發(fā)。這激活了抗原_特異性⑶4+T輔助細胞或⑶8+細胞毒性T淋巴細胞(“CTL”)。 CTL具有對肽抗原的特異性，所述肽抗原與由主要組織相容性復(fù)合物(MHC)編碼的蛋白質(zhì) 相關(guān)聯(lián)呈遞并在細胞表面表達。CTL幫助誘導(dǎo)及促進在細胞內(nèi)摧毀細胞內(nèi)微生物，或裂解被 這些微生物感染的細胞。細胞免疫的另一個方面涉及通過輔助T-細胞的抗原-特異性應(yīng) 答。輔助T-細胞的作用是幫助刺激非特異性效應(yīng)子細胞針對那些在其表面顯示有與MHC分 子相關(guān)的肽抗原的細胞的功能，并集中了此活性?！凹毎?介導(dǎo)的免疫應(yīng)答”還指產(chǎn)生細胞 因子，趨化因子和其他此類由激活的T-細胞和/或其他白細胞產(chǎn)生的分子，包括源于CD4+ 和CD8+T-細胞的分子。有大量測定可確定具體的抗原或組合物刺激細胞_介導(dǎo)的免疫性 應(yīng)答的能力，如通過淋巴細胞增殖(淋巴細胞激活)測定，CTL細胞毒性細胞測定，通過測 定敏化受試者中特異于抗原的T-淋巴細胞，或通過測量對用抗原重刺激應(yīng)答的T細胞的細 胞因子的產(chǎn)生。這些測定在本領(lǐng)域熟知。見，例如，Erickson等人，J. Immunol. (1993) 151 4189-4199 ；Doe 等人，Eur. J. Immunol. (1994)24 :2369_2376。術(shù)語“免疫原性”指的是抗原或疫苗誘發(fā)免疫應(yīng)答的能力，可以是體液或細胞介導(dǎo) 的，或二者。如本文使用的，“免疫原性有效量”指的是足以誘發(fā)免疫應(yīng)答，細胞(T細胞)或 體液(B細胞或抗原)應(yīng)答或二者的抗原或疫苗的量，這是通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標準 測定所測量的?？乖鳛槊庖咴挠行钥扇缦逻M行測量通過增殖測定，通過細胞裂解 測定，如鉻釋放測定以測量T細胞裂解其特異性靶標細胞的能力，或通過測量血清中特異 于抗原的循環(huán)抗體水平以測量B細胞活性水平。進一步地，免疫應(yīng)答的保護水平可通過用 已經(jīng)注射的抗原攻擊經(jīng)免疫的宿主而進行測量。例如，如果需要對其產(chǎn)生免疫應(yīng)答的抗原為病毒或腫瘤細胞，由“免疫原性有效量”的抗原誘導(dǎo)的保護水平是通過檢測病毒或腫瘤細 胞攻擊動物之后的存活百分比或死亡百分比而測量的。在一個實施方式中，“免疫原性有效 量”的疫苗或免疫原性組合物指的是通過FAID5tl方法(King等人，Journal of Comparative Medicine and Vet. Science, 29 85-89 (1965))以及美國專利號 4，824，785 中測量的病 毒顆粒滴度的范圍為大約l-7Log1(l病毒顆粒/ml。在一個實施方式中，“免疫原性有效量” 的疫苗或免疫原性組合物指的是通過FAID5tl方法(King等人，Journal of Comparative Medicine and Vet. Science, 29 85-89 (1965))以及美國專利號 4，824，785 中測量的病毒 顆粒滴度的范圍為大約2-5Log1(l病毒顆粒/ml。在一個實施方式中，“免疫原性有效量”的 感染性DNA疫苗或免疫原性組合物的范圍可以為大約50-5000 μ g。在一個實施方式中，“免 疫原性有效量”的感染性DNA疫苗或免疫原性組合物的范圍可以為大約50-1000 μ g。在特 定實施方式中，術(shù)語“大約”意思是在20%之內(nèi)，優(yōu)選地在10%之內(nèi)，更優(yōu)選地在5%之內(nèi)。術(shù)語“免疫原性組合物”指的是任何含有抗原，例如微生物體的藥物組合物，所述 組合物可用于在哺乳動物中誘發(fā)免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答可包括T細胞應(yīng)答、B細胞應(yīng)答或T 細胞和B細胞應(yīng)答二者。組合物可起到敏化哺乳動物的作用，通過細胞表面呈遞與MHC分 子相關(guān)的抗原。此外，可產(chǎn)生抗原-特異性T-淋巴細胞或抗體以允許對經(jīng)免疫的宿主的未 來保護?！懊庖咴越M合物”可含有活的、減毒的，或滅活/失活的疫苗，其包含完整微生物 體或由其衍生的免疫原性部分，所述免疫原性部分誘導(dǎo)細胞-介導(dǎo)(T細胞)免疫應(yīng)答或抗 體-介導(dǎo)(B細胞)免疫應(yīng)答或二者，并可保護動物不產(chǎn)生與微生物體相關(guān)的一種或多種癥 狀，或可保護動物不會由于被微生物體感染而死亡。“免疫原性0RF”或“免疫原性0RF”指的是誘發(fā)免疫應(yīng)答的開放閱讀框，例如，0RF2
編碼一種免疫原性衣殼蛋白質(zhì)。本發(fā)明的疫苗和免疫原性組合物能夠進一步包含一種或多種其他的“免疫調(diào)制 劑”，其為擾亂或改變免疫系統(tǒng)的試劑，從而觀察到體液和/或細胞_介導(dǎo)的免疫的上調(diào)或 下調(diào)。在一個具體的實施方式中，優(yōu)選的是免疫系統(tǒng)的體液和/或細胞_介導(dǎo)的分支的上 調(diào)。特定免疫調(diào)制劑的實例包括，例如，“藥學(xué)可接受佐劑”或細胞因子，等等?？捎糜诒景l(fā) 明疫苗的“藥學(xué)可接受佐劑”的非限制性實例包括RIBI佐劑系統(tǒng)(Ribi Inc.，Hamilton, Mont.)、鋁、礦物膠如氫氧化鋁膠，水包油乳劑、油包水乳劑如弗氏完全和不完全佐劑、嵌 ^^M^ (CytRx, Atlanta Ga. ) > QS-21 (Cambridge Biotech Inc. , Cambridge Mass.)、 SAF-M(Chiron, Emeryville Calif.)、AMPHIGEN 佐劑、皂苷、Qui 1 A 或其他皂苷部分、單磷 酰脂Α、以及阿夫立定(Avridine)脂-胺佐劑。用于本發(fā)明疫苗的水包油乳劑的非限制性 實例包括修飾的SEAM62和SEAM 1/2制劑。修飾的SEAM62是含有5% (ν/ν)鯊烯(Sigma)、 1% (v/v) SPAN 85去垢劑(ICI表面活性劑)、0. 7% (v/v) TWEEN 80去垢劑(ICI表面活 性劑)、2. 5% (v/v)乙醇、200yg/ml Quil A、100 μ g/ml 膽固醇和 0. 5% (v/v)卵磷脂的水 包油乳劑。修飾的SEAM 1/2是含有5% (v/v)鯊烯(Sigma)、1% (v/v) SPAN 85去垢劑、 0. 7% (ν/ν) ￥ΕΕΝ 80 去垢劑、2. 5% (ν/ν)乙醇、100yg/ml Quil Α、50 μ g/ml 膽固醇的水 包油乳劑。其他可包括在疫苗中的“免疫調(diào)制劑”包括，例如，一種或多種白介素、干擾素或 其他已知的細胞因子。在一個實施方式中，佐劑可以為環(huán)糊精衍生物或多聚陰離子多聚體， 如分別在美國專利號6，165，995和6，610，310中描述的。術(shù)語“感染性的”指的是病毒在豬中復(fù)制或能夠復(fù)制，不管此病毒是否引起任何疾病。在本發(fā)明中，“感染性” DNA的實例如SEQ ID NO :1或2的PCV2DNA所示。術(shù)語“分離的”或“純化的”意思是材料從其初始環(huán)境(例如，如果其是天然發(fā)生 的，為天然環(huán)境)移出。例如，“分離的”或“純化的”肽或蛋白質(zhì)基本上不含細胞材料或來 自蛋白質(zhì)所衍生自的細胞或組織源的其它污染性蛋白質(zhì)，或當化學(xué)合成時基本上不含化學(xué) 前體或其它化學(xué)物。語句“基本上不含細胞材料”包括這樣的多肽/蛋白質(zhì)的制備物，其中 多肽/蛋白質(zhì)與從中分離或重組產(chǎn)生其的細胞的細胞組分相分離。因此，基本上不含細胞 材料的多肽/蛋白質(zhì)包括這樣的多肽/蛋白質(zhì)的制備物，其具有少于大約30%、20%、10%、 5%、2.5%或1% (以干重計)的污染性蛋白質(zhì)。當多肽/蛋白質(zhì)為重組產(chǎn)生時，還優(yōu)選地 其基本上不含培養(yǎng)基，即，培養(yǎng)基占蛋白質(zhì)制備物體積的少于大約20%、10%或5%。當多 肽/蛋白質(zhì)是通過化學(xué)合成產(chǎn)生時，優(yōu)選地其基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)物，即，其與 蛋白質(zhì)合成中所涉及的化學(xué)前體或其它化學(xué)物相分離。因此，這些多肽/蛋白質(zhì)制備物具 有少于大約30%、20%、10%、5% (以干重計)的目標多肽/蛋白質(zhì)片段以外的化學(xué)前體或 化學(xué)物。“分離的”或“純化的”核酸分子為與其他存在于核酸分子天然來源的核酸分子相 分離的分子。此外，“分離的”核酸分子，如cDNA分子或RNA分子，在由重組技術(shù)產(chǎn)生時可基 本上不含其它細胞材料，或當通過重組技術(shù)產(chǎn)生時不含培養(yǎng)基，或當化學(xué)合成時基本上不 含化學(xué)前體或其它化學(xué)物。術(shù)語“滅活的”或“失活的”在本文交換使用，指的是用于制備疫苗組合物的病毒 的感染性的顯著或完全減少。病毒的滅活或失活可根據(jù)任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的步驟進 行評估，例如，通過分子生物學(xué)方法(PCR)、用于對病毒滴度進行滴定的方法、熒光、免疫學(xué) 方法(ELISA、RIA等等)、可以檢測一種或多種病毒多肽的免疫酶學(xué)方法(Western等等)。 已經(jīng)使用的大量不同的失活試劑和方式包括福爾馬林、疊氮化物、凍融、超聲、熱處理、壓力 驟降、去垢劑(尤其是非-離子去垢劑)、溶酶體、苯酚、蛋白水解酶以及丙內(nèi)酯。術(shù)語“淋巴組織”指的是任何富含淋巴細胞以及輔助細胞如巨噬細胞和網(wǎng)狀細胞， 并由結(jié)締組織的網(wǎng)絡(luò)支持的組織。淋巴組織包括骨髓、胸腺、淋巴結(jié)、脾、扁桃體、增殖腺、派 伊爾集合淋巴結(jié)(Peyer’ s Patch)和粘膜表面上的淋巴細胞聚集物?！胺?淋巴”組織指 的是任何其他不富含如本文定義的淋巴細胞和輔助細胞的組織。如本文使用的，詞語“核酸”或“核酸分子”指的是DNA、RNA、以及任何已知的DNA和 RNA的堿基類似物或由其形成的嵌合物。因此，“核酸”或“核酸分子”指的是核糖核苷(腺 苷、鳥苷、尿苷或胸苷；“RNA分子”)或脫氧核糖核苷(脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷或脫 氧胞苷，“DNA分子”)的磷酸酯多聚物形式，可以是單鏈形式或雙鏈螺旋。雙鏈的DNA-DNA、 DNA-RNA和RNA-RNA螺旋都是可能的。術(shù)語核酸分子，具體而言DNA或RNA分子，僅僅指分 子的一級或二級結(jié)構(gòu)，不限定于任何具體的三級結(jié)構(gòu)。因此，此術(shù)語包括雙鏈DNA，尤其發(fā) 現(xiàn)以線性或環(huán)狀DNA分子(例如，限制酶片段)、質(zhì)粒和染色體。在討論特定雙鏈DNA分子 的結(jié)構(gòu)時，序列可根據(jù)正常的慣例，只給出沿DNA非轉(zhuǎn)錄鏈(g卩，具有與mRNA同源序列的 鏈)5N-3N方向的序列而在本文中描述?！爸亟MDNA分子”是已經(jīng)經(jīng)過分子生物學(xué)操作的DNA 分子?！昂塑账帷敝傅氖荄NA或RNA的亞基，由一個含氮堿基(腺嘌呤，鳥嘌呤、胞嘧啶和 胸腺嘧啶)、一個磷酸分子和一個糖分子(DNA中為脫氧核糖，RNA中為核糖)構(gòu)成。如本文使用的，術(shù)語“開放閱讀框”或“0RF”，或“0RF”，指的是編碼具體的圓環(huán)病毒蛋白質(zhì)或抗原所需要的不含介于中間的終止密碼子的最少的核苷酸序列。術(shù)語“腸道外的”指的是物質(zhì)以經(jīng)過消化道以外的方式被攝入身體內(nèi)或施用，例 如，通過靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)注射。術(shù)語“病原性”指的是任何感染試劑(例如細菌或病毒)引起疾病的能力。在本 發(fā)明中，術(shù)語“病原性”指的是豬圓環(huán)病毒，具體而言為2型豬圓環(huán)病毒，引起豬的疾病(稱 為“斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征”或“PMWS”)的能力。此疾病特征常常在于斷奶的豬的衰竭 性表現(xiàn)或表現(xiàn)不佳，并在于中度至重度的淋巴病理，伴隨淋巴耗盡及淋巴組織中淋巴結(jié)的 組織細胞取代。還已知患有PMWS的豬具有呼吸性疾病，例如，間質(zhì)性肺炎、淋巴組織細胞肝 炎及淋巴組織細胞間質(zhì)性腎炎。與“病原性”2型豬圓環(huán)病毒相關(guān)的其他病況包括分散性生 殖障礙、腸炎和豬皮炎與腎病綜合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS)?！胺?病原性”微生物體指的是缺少上文對于豬圓環(huán)病毒“病原性”株提到的特征的 微生物體?！胺?病原性”豬圓環(huán)病毒通常指1型豬圓環(huán)病毒。豬圓環(huán)病毒的“病原性”株 通常稱為2型豬圓環(huán)病毒?！胺?病原性”豬圓環(huán)病毒通常稱為1型豬圓環(huán)病毒。因此，術(shù)語“一致性百分比”或“序列同一性百分比”指的是兩條氨基酸序列之 間或兩條核苷酸序列之間的序列同一性。可使用多種比對算法和/或程序，包括FASTA、， BLAST 或 ENTREZ。FASTA 和 BLAST 可作為 GCG 序列分析軟件包(University of Wisconsin, Madison, Wis.)的一部分而得到，且可用例如默認設(shè)置而使用。ENTREZ可通過國家生物 技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnologylnformation)，美國國家醫(yī)學(xué)圖書 館(National Library of Medicine)，美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health), (Bethesda,Md)而獲得。在一個實施方式中，兩條序列的同一性百分比可通過GCG 程序，用缺口加權(quán)為1而確定，例如，每個氨基酸缺口被當作兩條序列單一的氨基酸或核苷 酸錯配而加權(quán)。術(shù)語“藥學(xué)可接受載體”意思是聯(lián)邦、州政府或其他管理機構(gòu)許可的載體，或在美 國藥典或其他公認藥典中列出的用于動物，包括人和非_人哺乳動物的載體。術(shù)語“載體” 指的是藥物組合物與之一同施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。這些藥物載體可為滅菌 的液體，如水和油，包括石油、動物、蔬菜或合成來源的油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻 油等的。當藥物組合物靜脈內(nèi)施用時，水為優(yōu)選的載體。鹽水溶液和葡萄糖水溶液以及甘油 溶液也可用作液體載體，具體是用于可注射的溶液。合適的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、 乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油、滑石粉、氯化鈉、 脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。如果有需要，組合物還可含有少量濕潤或乳化 試劑，或PH緩沖試劑。這些組合物可采用溶液、混懸液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊、粉末、持續(xù) 釋放劑型等等形式。組合物可以栓劑配制，具有傳統(tǒng)的結(jié)合物和載體，如三甘油酯?？诜?劑可包含標準載體如藥物級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等等。 合適的藥物載體的實例在 E.W.Martin 的“Remington' s Pharmaceutical Sciences”中有 所描述。制劑應(yīng)當適合于施用的模式?！岸嗑酆塑账帷睘楹怂岫嗑垠w，其通常編碼生物學(xué)活性(例如，免疫原性)蛋白質(zhì)或 多肽。根據(jù)多聚核苷酸編碼的多肽的本質(zhì)，多肽可包括少至如10個核苷酸，例如當多聚核 苷酸編碼抗原時。進一步地，“多肽”可包括雙-和單-鏈序列，指的是來自病毒的CDNA、原 核或真核mRNA、來自病毒(例如，RNA和DNA病毒及逆轉(zhuǎn)錄病毒)的基因組RNA和DNA序列或原核DNA、還有合成的DNA序列，但不限于此。此術(shù)語還涉及包括DNA和RNA的任何已知 堿基類似物的序列。此術(shù)語進一步包括對天然序列的修飾，如缺失、添加和取代(例如，甲 基化或加帽)，優(yōu)選地這樣以使核酸分子編碼例如抗原性蛋白質(zhì)。這些修飾可為有意的，如 通過定點誘變，或通過具體合成步驟，或通過遺傳工程手段，或可為意外的，如通過產(chǎn)生這 些抗原的宿主的突變。術(shù)語“寡聚核苷酸”或“寡聚物”在本文交換使用。術(shù)語“豬的”和“豬”被交換使用，指的是任何豬科家族成員的動物，例如，豬。術(shù)語“保護”指的是通過誘導(dǎo)對具體病原體，例如圓環(huán)病毒的免疫應(yīng)答來保護例如 哺乳動物(具體而言為豬)抵抗感染或疾病。這種保護通常在用本文描述的疫苗組合物處 理哺乳動物之后實現(xiàn)。術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“多肽”和“肽”指的是氨基酸殘基的多聚體，并且不限制其產(chǎn)物的 最小長度。因此，肽、寡肽、二聚體、多聚體等等包括在所述定義之內(nèi)。全長蛋白質(zhì)和其片段 二者都包括在所述定義之內(nèi)。該術(shù)語還包括對天然序列的修飾，如缺失、添加和取代(通常 本質(zhì)上是保守性的，但其可以為非_保守性的)，優(yōu)選地這樣以使此蛋白質(zhì)維持誘發(fā)該蛋白 質(zhì)所施用的動物內(nèi)免疫性應(yīng)答的能力。還包括的為表達后修飾，例如糖基化、乙?；⒘姿?化等等。如本文使用的，術(shù)語“序列同源性”其所有語法形式指的是具有共同進化起源的蛋 白質(zhì)之間的關(guān)系，包括來自不同物種的同源蛋白質(zhì)。(Reeck等人，1987，Cell 50:667)。當至少大約75% (優(yōu)選地至少大約80%，更優(yōu)選地至少大約90或95%，最優(yōu)選 地大約99% )的核苷酸在DNA序列的限定長度上匹配時，兩條DNA序列為“基本上同源”或 “基本上相似”。基本上同源的序列可通過使用序列數(shù)據(jù)庫中可得的標準軟件比較序列，或 在例如如其具體系統(tǒng)規(guī)定的嚴格條件下的Southern雜交實驗中而得到鑒定。規(guī)定恰當?shù)?雜交條件是在本領(lǐng)域技術(shù)之內(nèi)的。見，例如，Maniatis等人，見前文；DNA Cloning, Vols. I & II,見前文；Nucleic Acid Hybridization,見前文)。類似地，當大于70%的氨基酸為相同的，或功能上相同，則兩條氨基酸序列為“基 本上同源的”或“基本上相似的”。優(yōu)選地，相似或同源序列通過使用，例如，GCG(Genetics Computer Group,Program Manual for the GCG Package,Version 7,Madison,Wisconsin) 堆積序列進行比對而鑒定。如本文使用的，“處理”(包括其變體，例如，“治療”或“所處理的”)指的是以下的 一種或多種(i)對感染或再感染的保護，如傳統(tǒng)疫苗中的，(ii)癥狀嚴重性的降低，或癥 狀消除，以及(iii)所考慮的病原體或障礙基本上或完全消除。因此，處理可預(yù)防性地(感 染之前)或治療性地(感染之后)實現(xiàn)。在本發(fā)明中，預(yù)防性處理是優(yōu)選的模式。根據(jù)本 發(fā)明一個具體的實施方式，提供了針對病毒感染處理(包括預(yù)防性地和/或治療性地免疫) 宿主動物的組合物和方法。本發(fā)明的方法用于賦予哺乳動物，優(yōu)選地為豬，預(yù)防性和/或治 療性免疫性。本發(fā)明的方法還可在哺乳動物上實施以用于生物醫(yī)學(xué)研究應(yīng)用。交換使用的術(shù)語“疫苗”或“疫苗組合物”，指的是包含至少一種在動物體內(nèi)誘導(dǎo) 免疫應(yīng)答的免疫原性組合物的藥物組合物。疫苗或疫苗組合物可保護動物不受由于感染產(chǎn) 生的疾病或可能的死亡，并且可包括或不包括增強活性組分免疫學(xué)活性的其他一種或多種 組分。疫苗或疫苗組合物可另外包含進一步的藥物組合物通常所有的組分。疫苗或疫苗組 合物可另外包含進一步的疫苗或疫苗組合物通常所有的組分，包括，例如，佐劑或免疫調(diào)制劑。疫苗的免疫原性活性組分可以包含以其原始形式的完整活生物體，或作為修飾的活疫 苗中減毒生物體，或者滅活或失活疫苗中由恰當方法失活的生物體，或包含病毒的一種或 多種免疫學(xué)組分的亞基疫苗，或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法產(chǎn)生的遺傳工程改造的、突 變的或克隆的疫苗。疫苗可包含一種或同時包括超過一種上文描述的元件。在本發(fā)明中， 疫苗組合物包括但不限于，活的、減毒的或滅活/失活形式的完整嵌合豬圓環(huán)病毒，編碼此 嵌合豬圓環(huán)病毒的感染性核酸，或包括質(zhì)粒、載體，或其他載體以直接將DNA注射入豬的其 它感染性DNA疫苗?？傮w描述由于其對豬產(chǎn)業(yè)潛在的影響，開發(fā)針對病原性形式的2型豬圓環(huán)病毒(PCV2)的疫 苗是非常重要的。人們相信非病原性PCVl針對PCV2感染的用途有限。此外，已經(jīng)出現(xiàn)了新型PCV2毒力株，其特征部分在于比平均死亡率高。這些PCV2 地的高毒力高死亡率病原性株被標注為PCV2B，而低毒力、低死亡率病原性株被標注為 PCV2A。最近提出的對這兩株的備選命名將PCV2A株稱為“基因型II”或“RFLP 422”，而 PCV2B株被稱為“基因型I”或“RFLP 321”。前文描述的特定疫苗組合物可證明對于較低死 亡率、較少毒力的PCV2A病原性株有效，卻沒有一個被顯示對高毒力病原性PCV2B株有效， 所述高毒力病原性PCV2B株的特征部分在于其比平均水平高的死亡率。由于與豬圓環(huán)病毒的這些病原性PCV2B株相關(guān)的感染嚴重性以及高于平均水平 的死亡率，鑒定、分離及利用這些株中的一種或多種用于制備病原性或疫苗組合物以免疫 保護豬抵抗斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)是有利的。針對的是鑒定和分離本發(fā)明的這些PCV2B株。在一個實施方式中，新近鑒定和分離的豬圓環(huán)病毒為2B型株，其具有如SEQ ID NO :1或2中任何一個所示的核酸序列。在一個實施方式中，所分離的豬圓環(huán)病毒為2B型 株，其具有與SEQ ID NO :1或2中任何一個的序列具有至少大約95%序列同源性的核酸序 列。在一個實施方式中，新近鑒定和分離的2B型豬圓環(huán)病毒的0RF2蛋白質(zhì)與SEQ ID NO 3或4中任何一個具有至少92%的序列同一性。在本發(fā)明的一個實施方式中，這些方法提供了對豬進行抗2A或2B型病原性豬圓 環(huán)病毒(PCV2)的免疫，包括施用免疫學(xué)有效量的包含由本發(fā)明核酸編碼的豬圓環(huán)病毒的 免疫學(xué)組合物。具體而言，本發(fā)明的方法提供了疫苗或免疫學(xué)組合物的用途，所述疫苗或免疫學(xué) 組合物包括以下的一種或多種a)免疫學(xué)有效量的至少一種如本文描述的2型豬圓環(huán)病毒，為減毒或失活/滅活 形式；b)編碼a)的至少一種2型豬圓環(huán)病毒的核酸分子；c)免疫學(xué)有效量的分離自a)的至少一種2型豬圓環(huán)病毒的至少一種蛋白質(zhì)；或d)免疫學(xué)有效量的編碼C)的至少一種蛋白質(zhì)的至少一種核酸分子。在一個實施方式中，疫苗或免疫原性組合物可包含PCV2B DNA疫苗(例如，表達 PCV2B 0RF2的質(zhì)粒載體)。在一個實施方式中，疫苗或免疫學(xué)組合物可包含表達PCV2B 0RF2 的失活的病毒載體(例如，棒狀病毒、腺病毒或痘病毒，如浣熊痘病毒；或細菌，如大腸桿 菌)。
還在考慮之內(nèi)的是如本文描述的疫苗或免疫原性組合物對于預(yù)防與斷奶后多系 統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)相關(guān)的一種或多種癥狀有效。這些癥狀可包括，例如，以下的一種或 多種呼吸疾病、一種或多種組織或器官中的鏡檢病變、組織細胞炎癥或淋巴結(jié)耗盡。此外，本文描述的疫苗或免疫原性組合物可與第二種或第三種疫苗或免疫原性組 合物一同使用，所述第二種或第三種疫苗或免疫原性組合物保護豬抵抗一種或多種病原性 豬病毒或細菌，包括豬生殖與呼吸綜合征(PRRS)病毒、豬細小病毒(PPV)、豬肺炎支原體、 副豬嗜血桿菌、多殺巴斯德菌、豬鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌、支氣管炎博德特菌、豬霍亂沙 門氏菌、豬紅斑丹毒絲菌、鉤端螺旋體細菌、豬流感病毒、大腸埃希氏菌抗原、豬呼吸冠狀病 毒、輪狀病毒、引起偽狂犬病的病原體、以及引起豬傳染性腸胃炎的病原體。例如，在一個實 施方式中，PCV疫苗或免疫原性組合物可與豬生殖與呼吸綜合征(PRRS)病毒疫苗或免疫原 性組合物組合。在一個實施方式中，PCV疫苗或免疫原性組合物可與豬肺炎支原體疫苗或 免疫原性組合物組合。在一個實施方式中，PCV疫苗或免疫原性組合物可與豬肺炎支原體 疫苗或免疫原性組合物以及呼吸綜合征(PRRS)病毒疫苗或免疫原性組合物組合。PCV1-2疫苗和免疫原性組合物的用途本發(fā)明提供了對兩種新型病原性PCV2B豬圓環(huán)病毒的鑒定和分離。由于需要疫苗 或免疫原性組合物施用于豬以預(yù)防由豬圓環(huán)病毒病原性株引起的PMWS，或減輕與豬的此疾 病相關(guān)的至少一種癥狀，人們預(yù)期這兩種新型株中的至少一種，或編碼這兩種新型株的至 少一種核酸，或獲自這些株中的至少一種的至少一種蛋白質(zhì)，可配制在疫苗或免疫原性組 合物中用于傳遞至豬中以對豬進行抗該疾病的免疫，從而為豬提供抵抗病毒感染和斷奶后 多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的保護。使用本文描述的方法制備所提出用作本研究的免疫原性或疫苗組合物的、包含至 少一種新近鑒定和分離的PCV2B豬圓環(huán)病毒的疫苗或免疫原性組合物。本發(fā)明的核酸如本文描述的，編碼全長2B型病原性豬圓環(huán)病毒的純化并分離的核酸分子如SEQ ID NO :1和2所示。本領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法可用于產(chǎn)生互補鏈或具有高同源性的核苷酸序 列，例如，通過領(lǐng)域-認可的標準或高嚴格的雜交技術(shù)。包含PCV2 DNA免疫原性衣殼基因 的DNA序列的純化并分離的核酸分子如SEQ ID NO 5和6的殘基1033-1734所示。因此，含有本文描述的PCV2B核酸分子的任何合適的動物細胞可產(chǎn)生活的、感染 性豬圓環(huán)病毒?；畹摹⒏腥拘载i圓環(huán)病毒通過體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)染例如PK-15細胞衍生自DNA 克隆。如上文指出的，PCV2DNA的一個實例如SEQ ID NO :1和2所示的核苷酸序列。本 發(fā)明進一步設(shè)想病毒可衍生自互補鏈或與核苷酸序列具有高同源性，至少80 %，更優(yōu)選地 95-99 %的同源性的核苷酸序列。本發(fā)明范圍內(nèi)還包括的是生物學(xué)功能性質(zhì)粒、病毒載體等等，其含有本文描述的 核酸分子，含有DNA克隆和免疫原性多肽表達產(chǎn)物的載體轉(zhuǎn)染的合適的宿主細胞。在一個 實施方式中，免疫原性蛋白質(zhì)為由來自豬圓環(huán)病毒的病原性2B型株0RF2編碼的衣殼蛋白 質(zhì)，如本文描述的。豬圓環(huán)病毒中的此衣殼蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO :3和4所示。 其生物學(xué)活性變體也進一步包括在本發(fā)明之內(nèi)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會知道如何對多肽序 列中的氨基酸進行修飾、取代、缺失等等，并產(chǎn)生保留與親本序列相同、或基本上相同活性 的生物學(xué)活性變體，不需要過度的努力。
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為產(chǎn)生本發(fā)明免疫原性多肽產(chǎn)品，方法可包括以下步驟在合適的營養(yǎng)條件下，以 允許多肽產(chǎn)物表達的方式培養(yǎng)用本文描述的核酸分子轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細胞，以及通 過本領(lǐng)域已知的標準方法分離所需的多肽產(chǎn)物。免疫原性蛋白質(zhì)可通過其他技術(shù)，如，生物 化學(xué)合成等等而制備，這也是本發(fā)明考慮之內(nèi)的。疫苗和免疫原性組合物對含有病原性PCV2B病毒的疫苗或免疫原性組合物的制備，如本文描述的，以及 使用其保護豬抵抗病原性豬圓環(huán)病毒株感染及PMWS的侵害的方法，也包括在本發(fā)明范圍 之內(nèi)。設(shè)想的是PCV2B的新分離株可用作滅活/失活制備物，或可以經(jīng)減毒或遺傳修飾以 用來對豬進行抗病毒感染和PMWS的免疫。因此，本發(fā)明提出了方法，使用免疫原性有效量 的疫苗或免疫原性組合物對豬進行抵抗病原性圓環(huán)病毒的感染或抵抗PMWS的免疫，所述 疫苗或免疫原性組合物含有本文描述的兩種新型病原性豬圓環(huán)病毒中的至少一種，或編碼 這兩種圓環(huán)病毒中的至少一種的至少一種核酸分子，或獲自這兩種圓環(huán)病毒中的至少一種 的至少一種蛋白質(zhì)。此方法可在需要抵抗病毒感染或PMWS進行保護時保護豬，通過對豬施 用免疫原性有效量的根據(jù)本發(fā)明的疫苗，例如，包含免疫原性量的PCV2B DNA、克隆的病毒、 含有PCV2B DNA的質(zhì)粒或病毒載體、多肽表達產(chǎn)物等等的疫苗。本文描述的疫苗可與第二種 或第三種疫苗或免疫原性組合物一同施用以抵抗其他豬病原體，包括例如PRRSV、PPV和其 他豬感染性因子，其選自以下豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌、多殺巴斯德菌、豬鏈球菌、胸 膜肺炎放線桿菌、支氣管炎博德特菌、豬霍亂沙門氏菌、豬紅斑丹毒絲菌、鉤端螺旋體細菌、 豬流感病毒、大腸埃希氏菌抗原、豬呼吸冠狀病毒、輪狀病毒、引起偽狂犬病的病原體、以及 引起豬傳染性腸胃炎的病原體。具體的組合可包括PCV疫苗或免疫原性組合物與PRRSV疫 苗或免疫原性組合物組合；PCV疫苗或免疫原性組合物與豬肺炎支原體疫苗或免疫原性組 合物組合；或PSV疫苗或免疫原性組合物與前述兩種疫苗或免疫原性組合物的組合。免疫 刺激劑可同時給予豬以提供抵抗其他病毒或細菌感染的廣譜的保護。本發(fā)明的方法中使用的疫苗或免疫原性組合物不限制于任何具體類型或制備方 法。這些疫苗或免疫原性組合物可包括，例如，編碼一種或多種豬圓環(huán)病毒蛋白質(zhì)的核酸、 感染性DNA疫苗(即，使用質(zhì)粒、載體或其他常規(guī)載體以直接將DNA注射入豬)、活的疫苗、 修飾的活疫苗、失活的疫苗、亞基疫苗、減毒的疫苗、遺傳工程改造的疫苗等等。在特定實 施方式中，疫苗可包括感染性PCV2B DNA，合適質(zhì)粒或載體如pSK載體中克隆的PCV DNA基 因組，無毒、活病毒，失活的病毒等等，或可使用病毒載體，例如但不限于，棒狀病毒，腺病毒 載體，或痘病毒載體如浣熊痘病毒，或細菌載體如大腸桿菌。上述的任何一種可用于與非毒 性、生理學(xué)可接受載體以及，可選地，一種或多種佐劑組合使用。失活的病毒疫苗或免疫原性組合物可通過用失活試劑如福爾馬林或疏水溶劑、酸 等等，通過用紫外光或X-射線的輻射，或通過加熱等等處理衍生自克隆的PCV DNA的病毒 而制備。失活是以本領(lǐng)域中理解的方式施行。例如，在化學(xué)失活中，含有病毒的合適的病毒 樣品或血清樣品用足夠量或濃度的失活試劑在足夠高(或低，根據(jù)失活試劑)溫度或PH下 處理足夠長的時間以失活病毒。通過加熱的失活是在足以失活病毒的溫度和時間長度下進 行。通過輻射的失活是使用足以失活病毒的光的波長或其他能源以及時間長度下進行。如 果不能感染對感染易感的細胞，則此病毒被認為已經(jīng)失活。亞基疫苗的制備通常與修飾的活疫苗或失活的疫苗的制備不同。在制備亞基疫苗之前，疫苗的保護性或抗原性組分必須被鑒定。這些保護性或抗原性組分包括病毒衣殼蛋 白質(zhì)的特定氨基酸區(qū)段或片段，其引起豬體內(nèi)特別強烈的保護性或免疫原性應(yīng)答；單一的 或多種病毒衣殼蛋白自身，其寡聚體，以及更高級別的病毒衣殼蛋白質(zhì)相關(guān)物，其形成病毒 亞結(jié)構(gòu)或者這些亞結(jié)構(gòu)可鑒定的部分或單位；病毒表面之上或附近或病毒亞結(jié)構(gòu)之內(nèi)存在 的寡聚糖苷、糖脂或糖蛋白，如與病毒相關(guān)的脂蛋白或脂基，等等。優(yōu)選地，衣殼蛋白質(zhì)，如 由0RF2基因編碼的蛋白質(zhì)被用作亞基疫苗的抗原性組分。由感染性DNA克隆編碼的其他蛋 白質(zhì)也可使用。這些免疫原性組分很容易通過本領(lǐng)域已知的方法進行鑒定。一旦被鑒定， 病毒的保護性或抗原性部分(即，“亞基”)接著通過本領(lǐng)域已知的步驟被純化和/或克隆。 亞基疫苗提供了相對其他基于活病毒的疫苗的優(yōu)勢，因為亞基，如高純化的病毒亞基，比整 個病毒毒性更小。如果亞基疫苗是通過重組遺傳技術(shù)生產(chǎn)的，克隆的亞基如0RF2(衣殼)基 因的表達，例如，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進行優(yōu)化(見，例如Maniatis等 人’ “Molecular Cloning :A Laboratory Manual, " Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Mass. , 1989) 0如果所采用的亞基代表病毒的完成結(jié)構(gòu)特征，如整個 衣殼蛋白質(zhì)，則必須優(yōu)化將其從病毒中分離的步驟。在其他情況下，在優(yōu)化失活操作流程之 后，亞基純化操作流程可在生產(chǎn)之前被優(yōu)化。為從病原性克隆制備減毒的疫苗，適應(yīng)組織培養(yǎng)的、活的、病原性PCV2首先通過 本領(lǐng)域已知方法進行減毒(使其變成非病原性或無害)，通常通過在細胞培養(yǎng)物的系列傳 代而進行。病原性克隆的減毒還可通過基因缺失或病毒-產(chǎn)生基因突變而產(chǎn)生。然后，減 毒的PCV2病毒可用于構(gòu)建保留了 PCV1非病原性基因型的其他PCV2病毒，但其可通過重組 技術(shù)在選自PCV2基因組的免疫原性特征的強度上有變化。在本發(fā)明中所需要的其他遺傳改造的病毒是通過本領(lǐng)域已知技術(shù)產(chǎn)生的。這些技 術(shù)涉及，但不限于，重組DNA的進一步操作，對重組蛋白質(zhì)氨基酸序列的修飾或取代，等等。生產(chǎn)了基于重組DNA技術(shù)的遺傳改造的疫苗，例如，通過鑒定編碼負責在豬體內(nèi) 誘導(dǎo)更強免疫或保護性應(yīng)答的蛋白質(zhì)的病毒基因的備選部分(例如，衍生自0RF3、0RF4等 等的蛋白質(zhì))。這些鑒定的基因或免疫_顯性片段可被克隆入標準蛋白質(zhì)表達載體，如棒 狀病毒載體，以及用于感染合適的宿主細胞(見，例如0' Reilly等人，‘‘Baculovirus Expression Vectors :A Lab Manual, “ Fr eeman & Co. , 1992)。培養(yǎng)宿主細胞,從而表 達所需要的疫苗蛋白質(zhì)，對其進行純化直至所需的程度并配制成合適疫苗產(chǎn)品。如果克隆保留了引起疾病的任何不需要的天然能力，還可能精確找到病毒基因組 中負責毒力的核苷酸序列，并通過例如定點誘變將病毒遺傳改造為無毒。定點誘變能夠添 加、刪除或改變一個或多個核苷酸(見，例如Zoller等人，DNA 3 =479-488,1984)。合成含 有所需突變的寡聚核苷酸并將其與單鏈病毒DNA的部分退火。用產(chǎn)生于此步驟的雜交分子 轉(zhuǎn)化細菌。用分離的含有恰當突變的雙鏈DNA產(chǎn)生全長DNA，這是通過連接到后者的限制性 片段，接著將其轉(zhuǎn)染入合適的細胞培養(yǎng)物。將基因組連接入用于轉(zhuǎn)移的合適載體可通過任 何本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的標準技術(shù)完成。載體轉(zhuǎn)染入用于生產(chǎn)病毒子代的宿主細胞可 使用任何傳統(tǒng)方法，如磷酸鈣或DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、原生質(zhì)體融合及其他熟 知的技術(shù)(例如，Sambrook 等人，‘‘MOlecular Cloning :A Laboratory Manual, “ Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)?？寺〉牟《救缓箫@示出所需的突變。備選地，
21可合成含有恰當突變的兩條寡聚核苷酸。其可退火形成可插入病毒DNA而產(chǎn)生全長DNA的 雙鏈DNA。用于疫苗的遺傳改造的蛋白質(zhì)，例如可在昆蟲細胞、酵母細胞或哺乳動物細胞中 表達?？赏ㄟ^傳統(tǒng)方法純化或分離的遺傳改造的蛋白質(zhì)可直接接種于豬以賦予抵抗PCV2 引起的病毒感染或斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的保護?？梢杂煤蝎@自病毒或拷貝自病毒基因組的編碼一種或多種病毒的免疫-顯性 蛋白質(zhì)的核酸分子的轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化昆蟲細胞系(像HI-FIVE)。轉(zhuǎn)移載體包括，例如，線性化 棒狀病毒DNA和含有所需多聚核苷酸的質(zhì)粒。宿主細胞系可與線性化棒狀病毒DNA和質(zhì)粒 共-轉(zhuǎn)染以產(chǎn)生重組棒狀病毒。備選地，來自患有PMWS的豬的、編碼一種或多種衣殼蛋白質(zhì)的DNA，感染性PCV2 分子DNA克隆或克隆的PCV DNA基因組可被插入活的載體，如痘病毒或腺病毒中，并用作疫
田o對需要抵抗病毒感染或PMWS的保護的豬施用免疫原性有效量的本發(fā)明組合物。 接種豬的免疫原性有效量或免疫原性量可通過傳統(tǒng)測試容易地確定或容易地滴定。有效量 是其中保留了足夠的針對疫苗的免疫原性應(yīng)答以保護暴露于引起PMWS的病毒的豬的量。 優(yōu)選地，保護豬至一定程度，其中病毒疾病的一種至所有不利的生理學(xué)癥狀或影響顯著減 少、減輕或完全預(yù)防。疫苗或免疫原性組合物可以單劑量或重復(fù)劑量施用。劑量范圍可以是例如， 50-5，000微克含有感染性DNA基因組的質(zhì)粒DNA (根據(jù)疫苗的免疫-活性組分的濃度)，但 不應(yīng)當含有足以導(dǎo)致病毒感染的不利反應(yīng)或生理學(xué)癥狀的量的基于病毒的抗原。用于確定 或滴定活性抗原性試劑的合適劑量的方法在本領(lǐng)域已知，其基于豬的體重、抗原和其他典 型因素的濃度。優(yōu)選地，感染性病毒DNA克隆被用作疫苗，或可在體外產(chǎn)生活的感染性疫 苗，然后活疫苗可減毒并然后用作疫苗。在那種情況下，可給予豬100-200微克的克隆PCV DNA或大約10，000的50%組織培養(yǎng)物感染劑量(TCID5(1)的活的減毒病毒?？扇〉兀瑢⒁呙缁蛎庖咴越M合物施用于還未暴露于PCV病毒的豬。含有PCV2 感染性DNA克隆或其其他抗原性形式的疫苗可方便地鼻內(nèi)、透皮地(S卩，在皮膚表面上 或之內(nèi)應(yīng)用以系統(tǒng)性吸收)、腸道外地等等方式施用。腸道外施用途徑包括但不限于，肌 內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)(即，注射的或否則置于皮膚下方的)途徑等等。由于肌肉內(nèi) 和皮內(nèi)接種途徑已經(jīng)在使用病毒感染性DNA克隆的其他研究中獲得成功(E.E. Sparger 等人，“Infection of cats by injection with DNA of feline immunodeficiency virus molecular clone, " Virology 238 157-160 (1997) ；L. Willems 等人，"Invivo transfection ofbovine leukemia provirus into sheep, " Virology 189 775-777(1992))，除了實踐的鼻內(nèi)施用途徑之外，這些途徑是最優(yōu)選的。盡管不夠方便，通 過淋巴結(jié)內(nèi)接種途徑將疫苗給予豬也是考慮之內(nèi)的。獨特的，高度優(yōu)選的施用方法涉及將 含有PCV2或PCV2病毒(減毒的或失活的)的質(zhì)粒DNA以肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、淋巴結(jié)內(nèi)等等直接 注射入豬。當以液體施用時，本疫苗可以以水溶液、糖漿、酏劑、酊劑等的形式制備。這些制劑 在本領(lǐng)域已知，通常通過將抗原和其他一般的添加劑溶解于恰當?shù)妮d體或溶劑系統(tǒng)中而制 備。合適的“生理學(xué)可接受”載體或溶劑包括但不限于，水、鹽水、乙醇、乙二醇、甘油等等。一般的添加劑為，例如，合格的染料、風味劑、味劑和抗微生物防腐劑如硫柳汞(乙基汞硫 代水楊酸鈉)。這些溶液可通過例如添加部分水解明膠、山梨醇或細胞培養(yǎng)基而進行穩(wěn)定， 并且可通過常規(guī)方法使用本領(lǐng)域已知試劑而進行緩沖，所述試劑如磷酸氫二鈉、磷酸二氫 鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、其混合物等等。液體制劑還可包括含有組合其他標準共_制劑物的懸浮試劑或乳化試劑的混懸 液和乳劑。這些液體制劑類型可通過常規(guī)方法進行制備?；鞈乙嚎墒褂美缒z體磨進行制 備。乳劑可使用勻漿器制備。為注射入體液系統(tǒng)而設(shè)計的腸道外制劑，需要合適的等滲性和pH緩沖以達到豬 體液的相應(yīng)水平。根據(jù)需要，等滲性可以用氯化鈉和其他鹽進行恰當?shù)卣{(diào)整。合適的溶劑 如乙醇或丙二醇可用來增加制劑中成分的溶解性以及液體制備物的穩(wěn)定性。本發(fā)明的疫苗 中可使用的進一步的添加劑包括但不限于右旋糖、常規(guī)抗氧化劑及常規(guī)螯合劑如乙二胺四 乙酸(EDTA)。在使用之前腸道外劑型還必須經(jīng)過滅菌。在一個實施方式中，衍生自至少一種本文描述的2B型圓環(huán)病毒的免疫原性0RF2 衣殼基因可用于疫苗或免疫原性組合物中。佐劑本發(fā)明提供對由SEQ ID NO :1和2的核酸序列編碼的兩種新型2B型豬圓環(huán)病毒 (PCV2B)的分離和鑒定。這些新型PCV2B型株分離自環(huán)境暴露的豬，并且這些豬因此可為制 備疫苗和免疫原性組合物的理想候選者。本發(fā)明的一個目標是利用這些株的滅活/失活形 式，或制備這兩種株的減毒形式以制備疫苗或免疫原性組合物。本發(fā)明還有一個目標是將 與或不與佐劑一起遞送至豬群體以預(yù)防PMWS或減輕與此疾病相關(guān)的至少一種癥狀。因此，如本文所描述的，活的、減毒的2B型豬圓環(huán)病毒，或滅活的/失活的豬圓環(huán) 病毒，或編碼這些豬圓環(huán)病毒的核酸，或獲自這些圓環(huán)病毒的至少一種蛋白質(zhì)可與或不與 佐劑一起傳遞。在一個實施方式中，疫苗為滅活/失活的PCV2B圓環(huán)病毒，其與佐劑一起 施用。佐劑是增加豬對疫苗的免疫原性應(yīng)答的物質(zhì)。佐劑可在與疫苗相同的時間相同的 位點施用，或在不同時間，例如，作為加強劑施用。佐劑還可有利地以一種方式或與疫苗施 用的方式或位點不同的位點施用于豬。合適的佐劑包括但不限于，氫氧化鋁(礬)、免疫刺 激復(fù)合物(I SC0MS)、非-離子阻斷多聚體或共多聚體、細胞因子(像IL-1、IL-2、IL-7、 IFN-a、IFN-0、IFN-y 等等)、皂苷、單磷酰脂 A (monophosphoryl lipid A, MLA)、胞壁酰 二肽(MDP)等等。其他合適的佐劑包括，例如，硫酸鉀鋁、分離自大腸埃希氏菌熱-不穩(wěn)定 或熱_穩(wěn)定的腸毒素、霍亂毒素或其B亞基、白喉毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、弗氏不完 全或完全佐劑等等。基于毒素的佐劑，如白喉毒素、破傷風毒素和白喉毒素可在使用之前進 行失活，例如，通過用甲醛進行處理。用于測量免疫應(yīng)答的測定對豬進行抵抗豬圓環(huán)病毒的免疫接種的功能結(jié)果可通過監(jiān)測細胞或體液免疫性 或T細胞活性的誘導(dǎo)的合適的測定來進行評估。這些測定對于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，但可 包括細胞裂解T細胞活性的測量，使用例如鉻釋放測定。備選地，T細胞增殖測定可用作免 疫反應(yīng)性或其缺少的指示。此外，可進行體內(nèi)研究以評估使用本發(fā)明的方法針對病原體進 行免疫接種的哺乳動物中的保護水平。通常的體內(nèi)測定可涉及用抗原，如本文描述的嵌合 豬圓環(huán)病毒對動物進行免疫接種。在等待了足以誘導(dǎo)抗體或T細胞應(yīng)答發(fā)生的時間后(一般是從注射后大約一到兩周)，用抗原(如任何一種病毒)對動物進行攻擊，并監(jiān)測與病毒 感染相關(guān)的一種或多種癥狀的減輕，或動物的存活情況。針對豬圓環(huán)病毒的成功的免疫接 種方案會導(dǎo)致與非-免疫接種對照相比，與病毒感染相關(guān)的一種或多種癥狀的顯著下降， 或病毒血癥的降低，或與病毒感染相關(guān)病變的數(shù)量或嚴重性下降或存活。還可收集血清以 監(jiān)測對免疫注射應(yīng)答而產(chǎn)生的抗體水平，這是通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法測量的。比較2A型和2B型豬圓環(huán)病毒分離株的方法新近鑒定的2B型豬圓環(huán)病毒可能起到疫苗或免疫原性組合物的作用，以提供抵 抗2A型或2B型圓環(huán)病毒的感染的保護，這兩種都在豬體內(nèi)為病原性的。2A型和2B型豬 可通過使用限制片段長度多態(tài)性(RFLP)分析而區(qū)分。RFLP使用酶消化病毒核酸(部分 或全部)，其產(chǎn)生可在膠上看見的特異性切割模式。如果在病毒的酶切位點之間有差異， 則可觀察到不同的模式。這種指紋技術(shù)已經(jīng)常用于DNA病毒。Meng等人(美國專利公開 2005/0147966)描述了 PCR-RFLP測定的用途，其使用Ncol限制酶以區(qū)分非-病原性1型 豬圓環(huán)病毒和病原性2型豬圓環(huán)病毒之間。2000年描述的基于0RF2的PCR-RFLP測定使 用了 HinfI、HinPlI、KpnI、MseI 和 Rsal 酶，能夠在 PCV2 分離株(PCV2A, B, C, D, and E)之 間進行區(qū)分(Hamel AL, Lin LL, Sachvie C, Grudeski E, Nayar GP :PCR detection and characterization of type-2 porcine circovirus. Can J Vet Res. 64 :44_52,2000)。最近描述兩基于0RF2 的 PCR-RFLP 測定使用了 Sau3AI、BanII、Nspl、Xbal 和 Cfrl酶，并且能夠區(qū)分9種不同PCV2基因型(Wen L, Guo X，Yang H :Genotyping of porcine circovirus type 2 from a variety of clinical conditions in China. Vet Microbiol. 110 :141-146，2005)。PCV2RFLP 分析顯示從 RFLP 422 型至 321 型有顯著的 變化，2005, Ontario, Canada (Delay J, McEwen B, Ca rman S, van Dreuel T, Fairies J porcine circovirus type 2—associated disease is increasing. AHL Newsletter. 9 22,2005)。除了使用RFLP分析區(qū)別2A型和2B型豬圓環(huán)病毒，人們相信這兩株可根據(jù)序列分 析而進行區(qū)分。例如，使用序列分析可以表征遺傳信息并對分離株進行相互比較(Choi J， Stevenson GW, Kiupel M，Harrach B，Anothayanontha L，Kanitz CL，Mittal SK Sequence analysis of old and new strains of porcine circovirus associated with congenital tremors in pigs and their comparison with strains involved with postweaning multisystemic wasting syndrome. Can J Vet Res. 66 :217_224， 2002 ；De Boiss eson C，B even V，Bigarr eL, Thi ery R, Rose N，Eveno E，Madec F, Jestin A :Molecularcharacterization of porcine circovirus type 2 isolates from post-Weaning multisystemic wasting syndrome-affected and non-affected pigs. J Gen Virol. 85 :293_304，2004 ；Fenaux M，Halbur PG，GillM，Toth TE，Meng XJ :Genetic characterization of type 2 porcine circovirus(PCV-2) from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome in different geographic regions of North America and development of a differential PCR—restriction fragment length polymorphism assay to detect and differentiate between infections with PCV—1 and PCV-2.J Clin Microbiol. 38 :2494-2503，2000 ；Grierson SS，King DP，Sandvik T,Hicks D,SpencerY,Drew TW,Banks M-Detection and genetic typing of type 2 porcine circovirus in archived pig tissues from the UK. Arch Virol. 149 :1171—1183，2004 ；Kim JH,Lyoo YS Genetic characterization of porcine circovirus—2 field isolates from PMWS pigs. J Vet Sci. 3 31-39,2002 ；Mankertz A,Domingo M，F(xiàn)olch Jl,LeCann P，Jestin A,Segales J,Chmielewicz B,Plana-Durdn J,Soike D-Characterisation of PCV-2 isolates from Spain, Germany and France. Virus Res. 66 :65_77，2000)。為進一步研究 PCV2 分離株之間 的可能差異，有可能對整個PCV2基因組進行測序或只測序0RF2。這兩株還在與疾病自身相關(guān)的病原性、臨床癥狀以及死亡率方面有差異，其中2A 型顯示出較不重度的身體組織病變以及較低的死亡率，相比較的是與2B型株相關(guān)的更嚴 重的病理和更高死亡率。這些臨床參數(shù)可使用本領(lǐng)域已知的標準步驟進行測量，如本發(fā)明 所顯示的。
實施例以下實施例證明了本法的特定方面。然而，應(yīng)當理解的是這些實施例只用于示例 說明，不意味著完全規(guī)定了本發(fā)明的條件和范圍。應(yīng)當清楚的是當給出通常的反應(yīng)條件 (例如，溫度、反應(yīng)時間等等)時，在具體范圍以上或以下的條件都可使用，盡快一般會不那 么方便。除非另外有說明，本文參考的所有部分和百分比都基于重量，所有溫度以攝氏度表
7J\ o實施例1兩種新型豬圓環(huán)病毒2B型株的分離和鑒定規(guī)劃了一項研究以在豬中測試一種新型疫苗制劑以評估其抵抗豬圓環(huán)病毒和豬 肺炎衣原體的效力。在研究過程中，觀察到對照和免疫接種組中幾只豬顯示出PMWS癥狀。 然后證實了這些豬在攻擊之前暴露于環(huán)境的PCV2。對來自這些豬的血液和組織樣品的分子 分析顯示他們具有與用于攻擊的株不同的2B型株。此外，序列分析確立了標注為FD07的 PCV2B株和另一種分離自農(nóng)場的豬的新型PCV2B豬(標注為FDJE)與其他領(lǐng)域研究中鑒定 的和來自其他人之前鑒定的其他2B型株不同。用于分離和鑒定這兩種新型PCV2B株的材 料和方法在下文描述。材料和方法測試動物混合培育的雄性和雌性常規(guī)豬用于此研究。有24只免疫接種豬和24只對照。豬 在免疫接種時為3周齡。用于研究的豬購自商業(yè)農(nóng)場并使用耳朵標簽進行鑒定。豬獲自單一源的獸群。在 首次免疫接種時，豬通過ELISA(S/P比例彡0. 5)確定為PCV2血清陰性。用于研究的靶群 體為健康架子豬(feeder pig)。在其免疫功能方面，選擇用于此研究的動物被視為代表了 美國的架子豬。在FDAH，F(xiàn)ort Dodge, IA將豬圈養(yǎng)在分離設(shè)備中。在整個研究過程中于相似的環(huán) 境中混合免疫接種豬和對照。將小豬按照每窩封閉于房間內(nèi)。圈養(yǎng)間隔依照動物福利的適 用規(guī)則。以標準商業(yè)飲食喂養(yǎng)豬，其自由采食可得的水和食物。需要醫(yī)療看護的豬如必要則在本研究研究者商議之后由植物獸醫(yī)處理。
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血清樣品的PCV2-PCR測試結(jié)果表示在實驗攻擊之前在一個房間中有意外的/環(huán) 境的PCV2暴露于小豬。免疫接種后28天時首次在一只對照小豬的血清中檢測到PCV2，并 通過DNA測序鑒定為豬圓環(huán)病毒2B型株(PCV2B)。此PCV2B感染其他的6只小豬。兩只未 免疫接種的對照豬產(chǎn)生了 PCV2-相關(guān)臨床表征，并由于不良的健康狀況在攻擊后18天處以 安樂死。臨床表征包括但不限于，食欲不振、嗜睡、抑郁、打噴嚏、咳嗽、流鼻涕、眼黏分泌物 以及呼吸困難。在進行安樂死之前，收集組織和血液樣品用于圓環(huán)病毒分析和測序。樣品收集和測試樣品收集鼻腔拭子對PCV2分離株在免疫接種后天數(shù)(DPV)的第0天收集鼻腔拭子以確保測試動物 在免疫接種之前沒有PCV2感染。將鼻腔拭子樣品置于分別的滅菌管，其中含有3mL具有乳 清蛋白水解物(LAH)以及慶大霉素(60iig/mL)、青霉素(100U/mL)和鏈霉素(100iig/mL) 的MEM，并于_50°C或以下溫度儲存直到測試。血清樣品在0、13、28DPV給豬抽血得到血清樣品(不多于10mL)，并在_1、7、14、20DPC用于 ELISA 測試，在 0、13、28DPV，_1、3、7、10、14、17、20DPC 用于 PCR 測試。組織樣品在20/21DPC對所有的動物進行尸檢。收集來自三處淋巴結(jié)(氣管支氣管、髂 (iliac)、腹股溝)、扁桃體和脾的切片并將其在福爾馬林中固定用于組織病原學(xué)檢查以及 PCV2的免疫組化(IHC)測試。樣品測試酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)用間接ELISA檢測血清樣品中的抗-PCV2抗體，氣質(zhì)使用重組PCV2衣殼蛋白質(zhì) (在棒狀病毒中表達)作為捕捉抗原。簡言之，用陽性捕捉抗原(用表達PCV2衣殼蛋白質(zhì) 的重組棒狀病毒感染的Sf9細胞)包被96-孔聚苯乙烯平板。用陰性捕捉抗原(SF9昆蟲 細胞)包被每塊平板的六個孔作為對照。在用封閉試劑處理平板之后，將平板與測試和對 照血清樣品孵育。將測試血清的各樣品添加至用陽性捕捉抗原包被的免疫平板的孔中(每 個測試樣品3個孔)。將陽性對照血清樣品添加至用陽性捕捉抗原(陽性對照)包被的免 疫平板的六個孔以及用陰性性捕捉抗原(陰性對照)包被的免疫平板的六個孔中。然后將 HRP綴合的山羊抗-豬二抗添加入平板。最后，加入TMB (過氧化物酶底物)并孵育一段恰 當持續(xù)的時間。用ELISA平板讀取儀定量所顯的顏色。ELISA平板中的每種試劑都以明確 的方式孵育并在每次連續(xù)的步驟之前洗滌以去除多余試劑。測試樣品和陽性對照的0D是 通過測試樣品和陽性對照的平均0D減去陰性對照的平均0D而計算的。血清滴度表示為S/ P(樣品/陽性對照)比率，即，測試樣品的0D除以陽性對照樣品的0D。PCR 測試PCV2-特異性PCR測試用于檢測PCV2病毒基因組DNA在血清樣品中的存在情況。 使用 QIAGEN MatAttract Virus Mini Kit 和 QIAGEN BioRobot M48 Workstation 從血清 中純化病毒基因組DNA。為檢測PCV2特異性序列，使用ABI AmpliTaq Gold DNA聚合酶 和基因-特異性引物F1PCV2，5，-ATGCCCAGCAAGAAGAATGG-3，(SEQ ID NO 7)和 RPCV2，5，-TGGTTTCCAGTATGT GGTTTCC-3，(SEQ ID NO 8)擴增 592-bp 的片段。用純化的病毒 DNA 作為模板，在95°C下變性lOmin。反應(yīng)的PCR程序由35個循環(huán)的94°C變性30seC，59°C退 火lmin，以及72°C延伸lmin構(gòu)成。用10 y L的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測592bp 的PCV2 DNA片段。組織病理學(xué)在尸體解剖時從各動物中收集脾、扁桃體以及三種(氣管支氣管、髂，腹股溝)淋 巴結(jié)的組織樣品，于10%中性緩沖福爾馬林中固定2-4天，并包埋于石蠟中。用蘇木精和伊 紅對四微米的切片進行染色，在光學(xué)顯微鏡下檢查進行組織病原學(xué)評估。對這些樣品估計淋巴細胞耗盡/組織細胞置換的程度。簡言之，所有組織都以盲 法檢查并對淋巴細胞耗盡和組織細胞置換的水平給出主觀得分。淋巴耗盡的排名得分0-3 是按如下指定的0_正常，1-輕度淋巴耗盡并有整體細胞性丟失，2-中度淋巴耗盡，3-重 度淋巴耗盡并有淋巴濾泡結(jié)構(gòu)丟失。組織細胞置換的排名得分0-3以類似方式按如下指定 的0_正常，1-輕度組織細胞-至-肉芽腫炎癥，2-中度組織細胞-至-肉芽腫炎癥，3-重 度組織細胞-至-肉芽腫炎癥并有囊泡置換。組織病理學(xué)評估由注冊病理學(xué)家在Veterinary Diagnostic Laboratory, College of Veterinary Medicine, Iowa State University (Ames, IA)進行。免疫組化(IHC)測試通過免疫組化測試檢測淋巴結(jié)、扁桃體和脾組織中的PCV2-特異性抗原。簡言之， 將四微米的組織切片置于玻璃片上，并用二甲苯處理以去除石蠟。用溶于PBS的3% H202 處理20min以淬滅清蠟的切片的內(nèi)源過氧化物酶。在用蒸餾水沖洗之后，將切片與在PBS 中1 1，000稀釋的兔抗PCV2多克隆血清在室溫孵育過夜。在用PBS洗滌之后，將切片 與biothynilated山羊抗-兔IgG在室溫下孵育30min。然后將切片與鏈霉親和素過氧化 物酶綴合物孵育并用二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸底物“顯色”?；赑CV2抗原染色水平盲法估計 PCV2抗原的量。排名得分按照如下指定0_無染色，1-低水平染色，2-中等水平染色，以 iS—i^Tfdfe。會且會只±白勺 IHC Veterinary Diagnostic Laboratory in the Iowa State University College of Veterinary Medicine (Ames, IA)進行的。結(jié)果病毒分離在免疫接種后天數(shù)(DPV)的第0天收集鼻腔拭子用于PCV2分離，以確保測試動物 在免疫接種之前沒有PCV2感染。從各測試動物的鼻腔拭子中沒有分離出病毒，表示這些豬 在免疫接種時沒有暴露于環(huán)境PCV2感染。PCV2攻擊材料滴定毒力PCV2攻擊材料(株40895)的滴定結(jié)果顯示于表1。一試三份滴定得到的攻 擊病毒的平均滴度為4. 6Log10 FAID5(1/mL。血清學(xué)PCV2-特異性抗體ELISA的結(jié)果顯示于表2。在0DPV1，對照(C組)的ELISA S/P比率變化范圍是從-0. 009至0. 366，平均S/P 比率是0. 135。免疫接種之后，在13DPV時，對照中ELISA抗體滴度下降到背景水平，并且所 有小豬直到攻擊之日都保持血清陰性。分別地，在13DPV的平均S/P比率為0. 049，在28DPV為0. 023，在35DPV(-1DPC)為0. 004。在PCV2攻擊后，平均S/P比率從在7DPC的0. 125，在 14DPC的0. 612，顯著地增加到在20DPC的0. 922。在0DPV1，免疫接種豬(組V)的ELISA S/P比率變化范圍是從-0. 028至0. 364，平 均S/P比率是0. 126。免疫接種之后，平均S/P比率是在13DPV為0. 041，在28DPV為0. 097， 在35DPV(-1DPC)為0. 167。在PCV2攻擊之后，在早至7DPC觀察到該組小豬的ELISA滴度 有顯著增強，平均S/P比率為在7DPC為1.069，在14DPC為1. 373，在20DPC為1.356。PCV2病毒血癥通過PCV2-特異性PCR對防接種的豬和對照的血清中PCV2病毒血癥的檢測總結(jié) 于表3A。此PCV2-特異性PCR至少比常規(guī)細胞培養(yǎng)方法靈敏1，000倍。在攻擊后(DPC)-l天，意外地發(fā)現(xiàn)24只免疫接種豬當中有3只(豬#P102、P103 及P104)，以及24只對照中有6只(豬#G197、G205、0162、P107、P108和P110)被檢測出血 清樣品的PCV2 DNA為陽性，而所有其他的都維持為陰性。所有9只PCV2陽性豬被圈養(yǎng)在 同一個房間(#12)。不幸地有六只PCV2-感染的豬(豬#P102、P103、P104、P107、P108和 P110)以及兩只非-感染豬被重新安置于#13房間，與8只來自#11房間的在-1DPC非-感 染豬由于空間需求而混合。因此，所有#12和13房間的動物都潛在地暴露于環(huán)境PCV2。為研究PCV2環(huán)境暴露的來源，在0、13和28DPV收集血清樣品，通過PCV2-特異性 PCR進行測試。所有豬都是PCV2陰性，除了豬#P108(對照，#12房間)在13DPV有極強的 陽性PCR帶。此結(jié)果表示意外環(huán)境PCV2暴露源于豬#P108，然后傳播到#12和#13房間的 其他豬。然而，此PCV2的確切來源并不清楚，最可能來自豬# 108在參加研究之前以無法 檢測水平被感染的環(huán)境或農(nóng)場。為確定來自環(huán)境暴露的PCV2的基因型，克隆豬#P108的PCR產(chǎn)物用于測序。DNA 序列分析顯示了來自豬# 108的PCV2為2B型株，與株-#40895(2A)不同。這兩種PCV2株 的基因組共有95. 98%的DNA序列同一性。為進一步區(qū)分實驗PCV2 (株#40895)攻擊與環(huán) 境接觸攻擊(來自豬#P108的2B)，克隆來自所有PCV2病毒血癥豬的PCR產(chǎn)物用于DNA測 序?；蚍中偷慕Y(jié)果顯示于“PCV2攻擊”欄“A”表示血清樣品中沒有檢測到PCV2B，攻擊 只是由實驗PCV2-#40895株產(chǎn)生的；“A+B”表示除了實驗攻擊之外，還檢測到PCV2B，并且由 于相同的序列，所有PCV2B都是來自豬#P108 ；"A+(B) ”表示除了實驗攻擊之外，豬潛在地感 染有PCV2B，因為這些豬與豬#P108在#12/13房間混合。然而，所有這些豬都被保護不受 PCV2攻擊。為估計實驗和環(huán)境接觸攻擊的影響，PCV2病毒血癥的PCR結(jié)果分成三類進行討 論總體比較(表3A)，實驗攻擊(表3B)，以及實驗和環(huán)境接觸攻擊(表3C)。組之間總體比較顯示10/24只(41. 7% )免疫接種豬在血清中PCV2DNA的存在情 況為陽性，至少發(fā)生了單一的陽性和不確定的結(jié)果。如果單一的不確定發(fā)生不可計數(shù)，5/24 只(20. 8% )免疫接種豬為PCV2DNA陽性。相反，24/24只(100% )對照在血清中PCV2DNA 存在情況為陽性且為多發(fā)的。對照中PCV2陽性帶的頻率和濃度比免疫接種豬顯著更高更 強(見表3A)。暴露于PCV2實驗攻擊組之間的比較(表3B)顯示1/9只(11. )免疫接種豬的 PCV2DNA為陽性的，只有單一的陽性發(fā)生。相反，14/14只(100%)對照在血清中PCV2DNA 存在情況為陽性，且為多發(fā)的。
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暴露于PCV2實驗和環(huán)境接觸攻擊組之間的比較(表3C)顯示4/15只(26. 7% ) 免疫接種豬PCV2DNA為陽性的，至少單一的陽性發(fā)生。相反，10/10只(100%)對照在血清 中PCV2 DNA存在情況為陽性，且為多發(fā)的。鏡檢病理_淋巴耗盡就淋巴耗盡，通過顯微鏡檢查淋巴結(jié)結(jié)、脾和扁桃體的組織。鏡檢的病變-淋巴耗 盡的總結(jié)果總結(jié)于表4A(得分為0-3的動物數(shù)量)。組之間總體比較顯示相比于23/24只(95. 8% )對照豬，在15/24只(62. 5% )免 疫接種豬中觀察到至少一種組織中的異常淋巴耗盡得分。相比于14/24只(58. 3% )對照， 在4/24只(16.7%)的免疫接種豬中觀察到中度到重度淋巴耗盡病變。暴露于PCV2實驗攻擊組之間的比較(表4B)顯示相比于13/14只(92. 9% )對照 豬，在6/9只(66.7%)免疫接種豬中觀察到至少一種組織中的異常淋巴耗盡得分。暴露于PCV2實驗和環(huán)境接觸攻擊組之間的比較(表4C)顯示相比于10/10只 (100% )對照豬，在9/15只(60% )免疫接種豬中觀察到至少一種組織中的異常淋巴耗盡 得分。鏡檢病理_組織細胞置換就伴隨囊泡置換的組織細胞_至-肉芽腫炎癥，通過顯微鏡檢查淋巴結(jié)、脾和扁桃 體的組織觀察。鏡檢的病理_組織細胞置換的總結(jié)果總結(jié)于表5?？傮w比較顯示相比于22/24 K (91.7%)對照豬，在15/24只(62. 5% )免疫接種 豬中觀察到至少一種淋巴組織中的異常組織細胞置換得分。免疫組化在淋巴結(jié)、脾和扁桃體中通過IHC染色檢測PCV2抗原的量的結(jié)果總結(jié)于表6 (得 分為0-3的動物數(shù)量)。總體比較顯示相比于23/24只(95. 8% )對照豬，7/24只(29. 2% )免疫接種豬在 至少一種淋巴組織中為PCV2特異性IHC染色。攻擊后臨床觀察就攻擊后臨床表征對個體豬進行每天觀察的結(jié)果顯示于表7。除了 2只對照豬 (#P108和0162)，在任何豬中都沒有觀察到臨床表征。在1DPC觀察到豬# 108的咳嗽，在10DPC有腹瀉，在17DPC變得瘦弱、有腹瀉 且不活躍。該豬發(fā)展了衰竭的明顯臨床表征。由于不良狀況，在18DPC對該小豬實施安 樂死。尸體解剖顯示了非常少的皮下脂肪，肺中中度顱骨-腹側(cè)實變(cranioventral consolidation)、空的胃和小腸。該豬發(fā)展了 PCV-相關(guān)疾病，這被以下發(fā)現(xiàn)所支持PCV2病 毒血癥(極強的PCR陽性)、重度淋巴耗盡、以及淋巴組織內(nèi)的高PCV2抗原負載(通過IHC 染色)。發(fā)現(xiàn)小豬#0162在14DPC變瘦，左后腿變跛。在17DPC發(fā)現(xiàn)該豬再次變瘦，不能移 動，后腿的跗骨關(guān)節(jié)變腫。由于不良狀況，在18DPC對小豬實施安樂死。尸體解剖顯示有中 度至重度的肺實變，伴隨纖維性粘連。對肺組織進行鏡檢評估顯示了重度的急性支氣管肺 炎和慢性病灶間質(zhì)性纖維化。該豬發(fā)展了 PCV-相關(guān)疾病，這被以下發(fā)現(xiàn)所支持PCV2病毒 血癥(極強的PCR陽性)、重度淋巴耗盡、以及淋巴組織內(nèi)的高PCV2抗原負載(通過IHC染 色)。
表1. PCV2 (#40895)攻擊材料滴定 *Log10 FAID50 每 mLAve 士 SD =平均滴度士標準偏差表2.由PCV2抗體ELISA測量的免疫接種豬和對照豬的血清中對PCV2的血清轉(zhuǎn)
換* *結(jié)果表示為樣品/陽性對照(S/P)比率；Ave (S/P比率)士SD =平均S/P比率士 標準偏差NA =未確定；V =免疫接種組；C =對照組表3A.通過在免疫接種和對照豬的血清的PCV2-特異性PCR檢測PCV2病毒血癥
總體比較 V =免疫接種組；C =對照組；NA =未確定；11或12房間小豬在整個研究過程中 (免疫接種和攻擊期)圈養(yǎng)；11-13和12-13房間在免疫接種期將小豬圈養(yǎng)在11或12房 間或在0DPC(攻擊期)重新安置于13房間。PCV2 攻擊株:A =實驗攻擊-PCV2 #40895 ；A+ (B)=除實驗攻擊-PCV2 #40895 之外，在免疫接種或攻擊期過程中由于與豬#108混合的潛在環(huán)境接觸攻擊。然而，這些 豬受到保護抵抗PCV2攻擊，并且沒有PCR產(chǎn)物可以測序到PCV2B ；A+B =實驗攻擊-PCV2 #40895，由于豬#108的環(huán)境接觸攻擊，并且PCR產(chǎn)物進行測序并被鑒定為來自相同來源 (豬 #108)的 PCV2B。PCR條帶強度得分_陰性；士非常微弱極少可見的PCR條帶；+陽性；++強陽性； +++非常強的陽性；++++極強陽性；PCV2病毒血癥-=陰性；P =陽性；P* =不確定(不確 定PCR條帶單次或兩次發(fā)生)。表3B.免疫接種和對照豬的血清中通過PCV2-特異性PCR檢測PCV2病毒血癥實 驗 PCV2 (#40895)攻擊 V =免疫接種組；C =對照組；NA =未確定；11或12房間小豬在整個研究過程中(免疫接種和攻擊期)圈養(yǎng)；11-13和12-13 房間在免疫接種期將小豬安置于11或12房間或在0DPC(攻擊期)重新安置于13號房 間。PCV2 攻擊株:A =實驗攻擊-PCV2 #40895PCR條帶強度得分_陰性；士非常微弱極少可見的PCR條帶；+陽性；++強陽性； +++非常強的陽性；++++極強陽性；PCV2病毒血癥_ =陰性；P =陽性；P* =不確定(不確定PCR條帶單次或兩次發(fā) 生)表3C.免疫接種和對照豬血清中進行PCV2-特異性PCR檢測PCV2病毒血癥實驗 PCV2 (#40895)及環(huán)境接觸攻擊 V =免疫接種組；C =對照組；NA =未確定；11或12房間小豬在整個研究過程中(免疫接種和攻擊期)被安置其中；11-13 和12-13房間在免疫接種期將小豬圈養(yǎng)在11或12房間或在0DPC(攻擊期)重新安置于 13房間。PCV2攻擊株A+ (B)=除實驗攻擊-PCV2 #40895之外，在免疫接種或攻擊期過程 中由于與豬#108混合的潛在環(huán)境接觸攻擊。然而，這些豬受到保護抵抗PCV2攻擊，并且沒 有PCR產(chǎn)物可以測序到PCV2B ；A+B =實驗攻擊-PCV2 #40895，由于豬#108的環(huán)境接觸攻 擊，并且PCR產(chǎn)物進行測序并被鑒定為來自相同來源(豬#108)的PCV2B。PCR條帶強度得分_陰性；士非常微弱極少可見的PCR條帶；+陽性；++強陽性； +++非常強的陽性；++++極強陽性；PCV2病毒血癥_ =陰性；P =陽性；P* =不確定(不確定PCR條帶單次或兩次發(fā) 生)表4A.淋巴結(jié)、脾和扁桃體中的淋巴耗盡總體比較*
36 *淋巴耗盡得分0 =正常，1 =輕度，2 =中度，3 =重度表4B.淋巴結(jié)、脾和扁桃體中的淋巴耗盡實驗PCV2 (#40895)攻擊 *淋巴耗盡得分0 =正常，1 =輕度，2 =中度，3 =重度
表4C.淋巴結(jié)、脾和扁桃體中的淋巴耗盡實驗PCV2 (#40895)和環(huán)境接觸攻擊 *淋巴耗盡得分0 =正常，1 =輕度，2 =中度，3 =重度表5.淋巴結(jié)、脾和扁桃體中伴隨囊泡置換的組織細胞-至-肉芽腫炎癥總體比 較 *組織細胞置換得分0 =正常，1 =輕度，2 =中度，3 =重度表6.淋巴結(jié)，脾和扁桃體中通過免疫組化(IHC)證實的PCV2-特異性抗原的量 總體比較* *IHC染色得分0 =無，1 =低水平，2 =中等水平，3 =高水平表7.攻擊后臨床觀察* =正常；E =咳嗽；I =其他(見6. 8節(jié)的解釋)V =免疫接種組；C =對照組. = NA
權(quán)利要求
分離的豬圓環(huán)病毒，其基因組包含SEQ ID NO1或2中任何一個的核酸分子，或其基因組包含與SEQ ID NO1或2中任何一個具有至少95％序列同源性的核酸分子。
2.權(quán)利要求1的分離的豬圓環(huán)病毒，其基因組包含SEQID NO :1或2中任何一個的核 酸分子。
3.權(quán)利要求1或2的分離的豬圓環(huán)病毒，其為2B型豬圓環(huán)病毒。
4.權(quán)利要求3的分離的豬圓環(huán)病毒，其具有與SEQID NO :3或4中任何一個具有至少 92%序列同一性的0RF2蛋白質(zhì)。
5.權(quán)利要求2的分離的豬圓環(huán)病毒，其中編碼0RF2蛋白質(zhì)的核酸包含SEQID N0:5或 6 的殘基 1033-1734。
6.分離的編碼病原性2B型豬圓環(huán)病毒，或編碼來自所述圓環(huán)病毒的至少一種蛋白質(zhì) 的核酸分子，其中核酸分子包含SEQ ID NO :1、2、5或6中任何一個的核苷酸序列或與SEQ ID NO :1、2、5或6中任何一個具有至少95%序列同源性的核苷酸序列。
7.權(quán)利要求6的分離的核酸分子，其包含SEQID N0:l、2、5或6中任何一個的核苷酸 序列。
8.權(quán)利要求6或7的分離的核酸分子，其中發(fā)現(xiàn)編碼0RF2蛋白質(zhì)的核酸在SEQID NO 5或6的殘基1033-1734處。
9.權(quán)利要求8的分離的核酸分子，其編碼具有如SEQID NO :3或4中所示的氨基酸序 列的0RF2蛋白質(zhì)。
10.免疫原性組合物，其包含權(quán)利要求1-5中任一項的分離的豬圓環(huán)病毒，以及藥學(xué)可 接受佐劑。
11.權(quán)利要求10的免疫原性組合物，其中分離的豬圓環(huán)病毒為減毒或失活的。
12.權(quán)利要求11的免疫原性組合物，其進一步包含至少一種其他的微生物體，或獲自 所述微生物體的需要針對其產(chǎn)生免疫應(yīng)答的抗原。
13.權(quán)利要求12的免疫原性組合物，其中其他微生物體選自豬生殖和呼吸綜合征病 毒(PRRS)、豬細小病毒(PPV)、豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌、多殺巴斯德氏菌、鏈球菌、胸 膜肺炎放線桿菌、支氣管炎博德特菌、豬霍亂沙門氏菌、豬紅斑丹毒絲菌、鉤端螺旋體細菌， 豬流感病毒、大腸埃希氏菌抗原、豬呼吸冠狀病毒、輪狀病毒、引起偽狂犬病的病原體、引起 豬傳染性腸胃炎的病原體以及第二種不同的豬圓環(huán)病毒株。
14.權(quán)利要求13的免疫原性組合物，其中第二種不同的豬圓環(huán)病毒株是2A型或2B型 圓環(huán)病毒。
15.免疫原性組合物，其包含權(quán)利要求6-9中任何一項的至少一種分離的核酸分子，以 及藥學(xué)可接受佐劑。
16.權(quán)利要求15的免疫原性組合物，其進一步包含編碼來自至少一種其他微生物體的 需要針對其產(chǎn)生免疫應(yīng)答的至少一種抗原的核酸分子。
17.權(quán)利要求16的免疫原性組合物，其中其他微生物體選自豬生殖和呼吸綜合征病 毒(PRRS)、豬細小病毒(PPV)、豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌、多殺巴斯德氏菌、鏈球菌、胸 膜肺炎放線桿菌、支氣管炎博德特菌、豬霍亂沙門氏菌、豬紅斑丹毒絲菌、鉤端螺旋體細菌， 豬流感病毒、大腸埃希氏菌抗原、豬呼吸冠狀病毒、輪狀病毒、引起偽狂犬病的病原體、引起 豬傳染性腸胃炎的病原體以及第二種不同的豬圓環(huán)病毒株。
18.權(quán)利要求17的免疫原性組合物，其中第二種不同的豬圓環(huán)病毒株是2A型或2B型圓環(huán)病毒。
19.權(quán)利要求10或15的組合物，其中組合物以單劑量或多劑量通過皮下、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、 透皮、肝內(nèi)或通過淋巴內(nèi)途徑施用。
20.對豬進行抵抗病毒感染或斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的免疫，或用于預(yù)防由 PCV2株引起的豬的斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的方法，包括對豬施用免疫原性有效 量的組合物，所述組合物包括以下的一種或多種a)免疫原性有效量的權(quán)利要求1-5中任何一項的2型豬圓環(huán)病毒；b)編碼a)的2型豬圓環(huán)病毒的核酸分子；c)免疫有效量的分離自權(quán)利要求1-5中任何一項的2型豬圓環(huán)病毒的至少一種蛋白 質(zhì)；或d)編碼c)的至少一種蛋白質(zhì)的核酸分子。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述方法進一步包括在施用2型豬圓環(huán)病毒免疫原性組 合物之前、與之聯(lián)合或之后施用免疫原性有效量的第二種不同的免疫原性組合物。
22.權(quán)利要求21的方法，其中第二種不同的免疫原性組合物包含免疫原性有效量的對 豬有病原性的至少一種其他微生物體，或獲自所述微生物體的至少一種抗原或編碼所述抗 原的核酸分子，其中微生物體選自豬生殖和呼吸綜合征病毒(PRRS)、豬細小病毒(PPV)、 豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌，多殺巴斯德氏菌、鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌、支氣管炎博 德特菌、豬霍亂沙門氏菌、豬紅斑丹毒絲菌、鉤端螺旋體細菌，豬流感病毒、大腸埃希氏菌抗 原、豬呼吸冠狀病毒、輪狀病毒、引起偽狂犬病的病原體、引起豬傳染性腸胃炎的病原體以 及第二種不同的豬圓環(huán)病毒株。
23.權(quán)利要求22的方法，其中第二種不同的豬圓環(huán)病毒株是2A型或2B型圓環(huán)病毒。
24.包含編碼2A型或2B型豬圓環(huán)病毒蛋白質(zhì)的至少一種外源核酸分子的載體，其中豬 圓環(huán)病毒蛋白質(zhì)是0RF2蛋白質(zhì)，并且其中編碼所述蛋白質(zhì)的外源核酸分子如SEQ ID NO 5 或6的殘基1033-1734所示。
25.權(quán)利要求24的載體，其中載體是浣熊痘病毒載體。
26.權(quán)利要求24或25的載體，其進一步包含編碼來自對豬有病原性的微生物體的抗原 的一種或多種外源核酸分子，其中微生物體選自豬生殖和呼吸綜合征病毒(PRRS)、豬細 小病毒(PPV)、豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌、多殺巴斯德氏菌、鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌、 支氣管炎博德特菌、豬霍亂沙門氏菌、豬紅斑丹毒絲菌、鉤端螺旋體細菌、豬流感病毒、大腸 埃希氏菌抗原、豬呼吸冠狀病毒、輪狀病毒、引起偽狂犬病的病原體、引起豬傳染性腸胃炎 的病原體以及第二種不同的豬圓環(huán)病毒株。
27.確定豬哺乳動物是否患有斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)，或處于發(fā)展斷奶后多 系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)風險的方法，所述方法包括(I)測量衍生自哺乳動物組織樣品中PCV2核酸或由所述核酸編碼的蛋白質(zhì)的量，其中 所述PCV2核酸或蛋白質(zhì)是a)對應(yīng)于SEQID NO :1、2、5或6中任何一個的核酸，或由其衍生的核酸；b)包含SEQID NO :3或4中任何一個的蛋白質(zhì)；c)包含與SEQID NO :1、2、5或6中任何一個或其互補物在高度嚴格條件下可雜交的序列的核酸，或包含由所述可雜交序列編碼的序列的蛋白質(zhì)；d)與SEQ ID NO :1、2、5或6中任何一個或其互補物具有用NBLAST算法確定的至少 95%同源性的核酸；或由其編碼的蛋白質(zhì)；以及(II)將來自懷疑患有PMWS，或處于發(fā)展PMWS的風險的哺乳動物組織樣品中所述核酸 或蛋白質(zhì)的量與來自正常哺乳動物組織樣品中存在的核酸或蛋白質(zhì)的量，或與對正常組織 樣品預(yù)先確定的標準進行比較，其中相比于正常組織樣品中的量或?qū)φ＝M織樣品預(yù)先確 定的標準，來自患有或懷疑患有PMWS的豬哺乳動物組織樣品中所述核酸或蛋白質(zhì)的升高 的量表示哺乳動物患有PMWS或處于發(fā)展PMWS的風險。
28.權(quán)利要求27的方法，其中組織樣品選自腹股溝淺淋巴結(jié)、氣管支氣管淋巴結(jié)、頌下 淋巴結(jié)、肺、扁桃體、脾、肝、腎、全血和血細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及兩種新型2B型豬圓環(huán)病毒株的分離和鑒定。這兩種新型豬圓環(huán)病毒株可用于制備疫苗或免疫原性組合物以對豬進行抗斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)免疫。因此，本發(fā)明提供誘發(fā)針對病原性豬圓環(huán)病毒的保護性免疫應(yīng)答的方法，通過對豬施用免疫原性有效量的2B型豬圓環(huán)病毒疫苗或免疫原性組合物，所述2B型豬圓環(huán)病毒疫苗或免疫原性組合物含有至少一種具有如SEQ ID NO1或2中所示的核酸序列的豬圓環(huán)病毒，或至少一種來自如本文描述的這兩種新型2B型豬圓環(huán)病毒株中的至少一種的蛋白質(zhì)。本發(fā)明進一步涉及保護豬不產(chǎn)生任何一種或多種與PMWS相關(guān)的癥狀或后遺癥。
文檔編號C12N7/00GK101932700SQ200880125584
公開日2010年12月29日 申請日期2008年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月21日
發(fā)明者S·Q·吳 申請人:惠氏有限責任公司