專利名稱：雞fshr基因5′調(diào)控區(qū)兩個(gè)突變位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法及其在雞育種中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及了一種雞FSHR基因5'調(diào)控區(qū)的兩個(gè)突變 位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法及其育種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
促卵泡素(FSH)是調(diào)控動(dòng)物繁殖活動(dòng)的重要激素之一，對(duì)動(dòng)物卵巢卵泡的生長(zhǎng)、 發(fā)育、分化、成熟和排卵起著必不可少的作用，其生物學(xué)功能的發(fā)揮通過位于靶細(xì)胞膜上的 促卵泡素受體(FSHR)介導(dǎo)。有研究表明，F(xiàn)SHR基因5'端多態(tài)位點(diǎn)的基因頻率，在產(chǎn)雙胎 和產(chǎn)單胎的中國(guó)西門塔爾牛群體中差異顯著。研究發(fā)現(xiàn)，多胎羅曼諾夫羊發(fā)育卵泡顆粒細(xì) 胞中的FSHR mRNA水平均顯著高于單胎法蘭西島羊，且顆粒細(xì)胞對(duì)促性腺激素反應(yīng)的敏感 性，前者也高于后者。雷雪芹等用FSHR基因5'端側(cè)翼序列的PCR-RFLP標(biāo)記對(duì)牛進(jìn)行了研 究，結(jié)果在秦川牛和黑白花奶牛兩個(gè)品種中出現(xiàn)優(yōu)勢(shì)等位基因不一致的現(xiàn)象，即在秦川牛 中雙胎母牛的A基因頻率和AA基因型頻率分別高于單胎母牛的A基因頻率和AA基因型頻 率。魏伍川等發(fā)現(xiàn)小尾寒羊表現(xiàn)為無Taq I酶切序列的B等位基因類型，所有個(gè)體均為BB 型，F(xiàn)SHR基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)調(diào)控區(qū)的B型DNA序列對(duì)提高雙胎率有正效應(yīng)。目前，有關(guān)FSHR基 因5'端的研究主要集中在哺乳動(dòng)物，如小鼠、牛、羊等，在禽類僅有報(bào)道產(chǎn)蛋雞FSHR在成 熟卵巢不同等級(jí)卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞上的表達(dá)，而有關(guān)FSHR 5'調(diào)控區(qū)序列多態(tài)性及其 與產(chǎn)蛋性狀關(guān)系的研究尚未見報(bào)道。基因表達(dá)是DNA上的遺傳信息轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程，轉(zhuǎn)錄受基因5'端序列的調(diào)控， 堿基突變通常會(huì)影響基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，因此5'端的序列結(jié)構(gòu)變異直接關(guān)系到基因的表達(dá)。對(duì) 不同突變位點(diǎn)進(jìn)行整體研究，即由這些不同位點(diǎn)構(gòu)成的單倍型，更有利于發(fā)現(xiàn)基因與某種 表型的相關(guān)性。如藥物代謝酶P450 2D6 (CYP2D6)基因中存在3個(gè)SNPs，這3個(gè)SNPs中的 任何一個(gè)對(duì)酶功能幾乎沒有影響，但是由它們構(gòu)成的單倍型可使酶活性喪失80%左右，可 見單倍型分析的重要性，張森等研究也表明單倍型相關(guān)性分析方法在QTL檢測(cè)中要明顯的 優(yōu)于單標(biāo)記分析。而對(duì)于禽類，特別是雞的FSHR基因5'調(diào)控區(qū)研究現(xiàn)在還相對(duì)較少，無法 將其應(yīng)用于雞的育種等工作中。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，發(fā)明人進(jìn)行了進(jìn)一步的研究和實(shí)驗(yàn)，最終發(fā)現(xiàn)雞FSHR 5'調(diào)控 區(qū)-237和-868位點(diǎn)進(jìn)行單個(gè)位點(diǎn)標(biāo)記分析時(shí)，兩位點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)與性狀相關(guān)，但用兩位點(diǎn)單 倍型構(gòu)建雙倍型進(jìn)行多重比較時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TTG+G-型對(duì)應(yīng)較小的開產(chǎn)日齡(123d)，TTG+G+ 型對(duì)應(yīng)較大的開產(chǎn)日齡(134d)，兩者差異顯著(P = 0.016)，可見檢測(cè)這兩個(gè)與產(chǎn)蛋性狀相 關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，不僅方法簡(jiǎn)便快速，而且不受環(huán)境影響，并可實(shí)現(xiàn)早期選種。本發(fā)明的具體標(biāo)記方法是采用標(biāo)記引物P-868，包括
P-868F 5' -TGAGTCAACATCAGCAGAG-3‘其序列如 Seq ID No 1 所示；P-868R 5' -GGAAGGAGTGTGAAGACC-3‘其序列如 Seq ID No :2 所示；擴(kuò)增雞育種材料的基因組DNA，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物得到大小相差200bp的兩個(gè)片段分別 為1119bp的片段和919bp的片段(其序列如Seq ID No 3和Seq ID No 4所示)，PCR產(chǎn) 物在1. 2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)直接分出三種帶型，200bp插入的記為G+G+型，200bp缺 失的記為G-G-型，雜合子記為G+G-型；采用標(biāo)記引物P-237，包括P-237F 5' -GGATCTATGAAGGGGAGCAT-3‘其序列如 Seq ID No :5 所示；P-237R 5' -AAGCTGAGATGGAACACGTG-3‘其序列如 Seq ID No :6 所示；擴(kuò)增雞育種材料的基因組DNA，得到371bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(其序列如Seq ID No 7所示)，其中包含Ssp I限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列“AAT/ATT”，當(dāng)-237 “T”突變?yōu)椤癆”即 “AAT/AAT”類型記做“AA”，擴(kuò)增片段Ssp I內(nèi)切酶切不開；“T”不發(fā)生突變類型記做“TT”， 可以被Ssp I內(nèi)切酶切作235bp和136bp的兩條短片段；PCR產(chǎn)物被Ssp I限制性內(nèi)切酶 消化后用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，即得到AA、TT、AT三種帶型；選擇兩位點(diǎn)單倍型組合為TTG+G-的個(gè)體用于留種，其可提高總體產(chǎn)蛋量。通過這種標(biāo)記方法選擇的TTG+G-基因型種雞能兼顧開產(chǎn)日齡和產(chǎn)蛋數(shù)，在產(chǎn)蛋 性能低的地方品種中有意增加TTG+G-的頻率對(duì)提高產(chǎn)蛋量是一個(gè)有效措施，而對(duì)于開產(chǎn) 較晚的群體，這樣的措施會(huì)使其開產(chǎn)適當(dāng)提前，從而實(shí)現(xiàn)早期選種。


圖1為FRPl和FRP2引物PCR擴(kuò)增的片段電泳圖，其中I為FRPl引物擴(kuò)增的片段的電泳圖，II為FRP2引物擴(kuò)增的片段的電泳圖；圖2為雞FSHR 5'調(diào)控區(qū)-237位點(diǎn)的多態(tài)性檢測(cè)電泳圖；圖3為雞FSHR 5'調(diào)控區(qū)-868位點(diǎn)的多態(tài)性檢測(cè)電泳圖；圖4為定點(diǎn)突變后序列比對(duì)結(jié)果，圖中第1038位點(diǎn)為定點(diǎn)突變位點(diǎn)；圖5為重組載體質(zhì)粒用Bgl II和Kpn I雙酶切鑒定結(jié)果電泳圖，圖中1-4、6為AG+和TG+單倍型，5、7—12為TG-禾口 AG-單倍型；圖6為培養(yǎng)72h的雞卵泡顆粒細(xì)胞圖片，為采用100倍鏡觀察獲得；圖7為四種單倍型對(duì)熒光素酶報(bào)告基因啟動(dòng)活性檢測(cè)結(jié)果示意圖；圖8為三種基因型FSHR mRNA在新楊褐白卵泡中的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示含不同字母 間差異顯著(P < 0. 05)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1雞FSHR 5'調(diào)控區(qū)序列的克隆測(cè)序、序列比對(duì)及突變位點(diǎn)分析根據(jù)已發(fā)表紅色原雞序列(GenBank Accession No. NW_060321)設(shè)計(jì)兩組引物 FRPl (其序列如Seq ID No 8和Seq ID No 9所示)和FRP2 (其序列如Seq ID No 10和 Seq ID No 11所示)，這兩種引物是為研究雞FSHR 5’調(diào)控區(qū)的突變而根據(jù)數(shù)據(jù)庫中登錄 的紅色原雞的序列特意設(shè)計(jì)的，并且重疊19bp以利于序列的組裝。兩對(duì)引物分別擴(kuò)增了四個(gè)地方品種濟(jì)寧百日雞，文昌雞，仙居雞，藏雞和一個(gè)商品代蛋雞海蘭褐FSHR 5’調(diào)控區(qū) 相互重疊的上游(_1824bp -940bp)和下游(_960bp _40bp)兩段序列。FRPl引物擴(kuò)增 的片段1約885bp (圖II)，F(xiàn)RP2引物擴(kuò)增的片段2有2個(gè)，大小約為919bp和1120bp上游 和下游序列(片段1和片段2，圖III)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 2%瓊脂糖電泳分離后切取目的 帶，使用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒(Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver. 2. 0， TaKaRa)純化PCR產(chǎn)物，純化產(chǎn)物連接到pMD18_T載體(TaKaRa)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感 受態(tài)細(xì)胞，包含目的片段的重組質(zhì)粒純化后測(cè)序。表1引物的序列、位置和退火溫度
權(quán)利要求
1.雞FSHR基因5'調(diào)控區(qū)兩個(gè)突變位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法，具體標(biāo)記方法是 采用標(biāo)記引物P-868，包括P-868F，其序列如kq ID No 1所示； P-868R，其序列如Seq ID No 2所示；擴(kuò)增雞育種材料的基因組DNA，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物得到大小相差200bp的兩個(gè)片段分別為 1119bp的片段和919bp的片段，其序列分別如kq ID No 3和kq ID No 4所示，PCR產(chǎn) 物在1. 2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)直接分出三種帶型，200bp插入的記為G+G+型，200bp缺 失的記為G-G-型，雜合子記為G+G-型； 采用標(biāo)記引物P-237，包括 P-237F，其序列如kq ID No 5所示； P-237R，其序列如Seq ID No 6所示；擴(kuò)增雞育種材料的基因組DNA，得到371bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其序列如kq ID No 7所 示，其中包含I限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列“AAT/ATT”，當(dāng)237 “T”突變?yōu)椤癆”即“AAT/ AAT”類型記做“AA”，擴(kuò)增片I內(nèi)切酶切不開；“T”不發(fā)生突變類型記做“TT”，可以被 Ssp I內(nèi)切酶切作235bp和136bp的兩條短片段；PCR產(chǎn)物被kp I限制性內(nèi)切酶消化后用 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，即得到AA、TT, AT三種帶型。
2.如權(quán)利要求1所述標(biāo)記方法，其在雞育種中的應(yīng)用方法是在產(chǎn)蛋數(shù)低或開產(chǎn)較晚 的群體中，選擇兩位點(diǎn)單倍型組合為TTG+G-基因型的個(gè)體留種，用于提高該群體的產(chǎn)蛋數(shù) 及適當(dāng)提早開產(chǎn)日齡。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及了一種雞FSHR基因5′調(diào)控區(qū)突變位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法及其育種中的應(yīng)用，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)雞FSHR 5′調(diào)控區(qū)-237和-868位點(diǎn)進(jìn)行單個(gè)位點(diǎn)標(biāo)記分析時(shí)，兩位點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)與性狀相關(guān)，但用兩位點(diǎn)單倍型構(gòu)建雙倍型進(jìn)行多重比較時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TTG+G-型對(duì)應(yīng)較小的開產(chǎn)日齡(123d)，TTG+G+型對(duì)應(yīng)較大的開產(chǎn)日齡(134d)，兩者差異顯著(P＝0.016)，可見檢測(cè)這兩個(gè)與產(chǎn)蛋性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，不僅方法簡(jiǎn)便快速，而且不受環(huán)境影響，并可實(shí)現(xiàn)早期選種。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102080126SQ20101019788
公開日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2010年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月1日
發(fā)明者劉東君, 唐輝, 姜運(yùn)良, 康麗, 張寧波, 張渝潔, 李標(biāo), 梁森, 王慧, 藏麗 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)