專(zhuān)利名稱(chēng)：一種野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗鹽蛋白激酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
低溫、干旱和鹽堿等非生物脅迫嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量與質(zhì)量，是制約我國(guó)農(nóng)業(yè)生 產(chǎn)和亟待解決的重要問(wèn)題。在對(duì)植物逆境信號(hào)傳導(dǎo)的研究中發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶發(fā)揮著至關(guān)重 要的作用，在脅迫刺激下它們不斷合成，并通過(guò)蛋白的磷酸化并將信號(hào)傳遞和放大，調(diào)控下 游基因的表達(dá)，從而引起植物生理生化的改變(Zhao-Shi Xu, Li Liu，Zhi-Yong Ni Pei Liu, Ming Chen, Lian-Cheng Li, Yao-Feng Chen and You-Zhi Ma(2009)W55a Encodes a Novel Protein KinaseThat Is Involved in Multiple Stress Responses. Journal of Integrative Plant Biology, 51 (1) =58-66) 0其中，鈣依賴(lài)的鈣調(diào)素調(diào)控的受體類(lèi)的蛋白 激酶是一類(lèi)參與脅迫反應(yīng)的重要的蛋白激酶，在脅迫信號(hào)感受、放大和傳導(dǎo)過(guò)程中起著至 關(guān)重要的作用。之前的研究表明，低溫和高鹽誘導(dǎo)梨PsCCaMK和煙草NtCaMKl基因的上調(diào) 表達(dá)(Pandey S, Tiwari SB, Tyagi W, Reddy MK, Upadhyaya KC, Sopory SK (2002) A Ca2+/ CaM-dependent kinase from pea is stressregulated and in vitro phosphorylates a protein that binds to AtCaM5 promoter. FEBSJournal(formerly European Journal of Biochemistry) 269, 3193-3204 ；Zhang L, Lu YT (2003)Calmodulin-binding protein kinases in plants. Trends in Plant Science 8,123—127)。CRCKl mRNA 的表達(dá)水平和 蛋白總量都受高鹽、H2O2、低溫和ABA處理的正調(diào)控，表明CCaMK類(lèi)蛋白激酶參與低溫、高鹽、 滲透脅迫甚至是氧化脅迫的信號(hào)傳導(dǎo)(Yang Τ, Chaudhuri S，Yang L，Chen Y，Poovaiah Bff. 2004.Calcium/calmodulin up-regulates acytoplasmic receptor-like kinase in plants. Journal of Biological Chemistry 279,42552—42559)。此夕卜，紅光會(huì)導(dǎo)致 ZmCCaMK基因的下調(diào)表達(dá)，表明CCaMK類(lèi)蛋白激酶還參與光依賴(lài)的信號(hào)傳導(dǎo)通路(Pandey S，Sopory SK(2001)Zea mays CCaMK :autophosphoryIation-dependent substrate phosphorylation and downregulation by redlight. Journal of Experimental Botany 52，691-700)。超量表達(dá)AtCBK3基因使得轉(zhuǎn)基因植株的耐熱性提高，表明AtCBK3基因是 熱休克信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要組分(Liu HT，Gao F，Li GL，Han幾，Liu DL，Sun DY，Zhou RG(2008)The calmodulin-binding protein kinase3 is part of heat-shock signal transduction in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal55，760—773)。 Ι 巨 ltf)(寸 于蛋白激酶的研究已經(jīng)有很多了，但是關(guān)于CCaMK的基因功能以及該激酶相互作用的底物 還沒(méi)有科學(xué)的論斷，且利用現(xiàn)有的蛋白激酶導(dǎo)入到植物細(xì)胞中，所獲得轉(zhuǎn)基因植株的高鹽 脅迫耐受能力較弱。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有的蛋白激酶導(dǎo)入到植物細(xì)胞中，所獲得轉(zhuǎn)基因植株 的高鹽脅迫耐受能力弱的問(wèn)題，而提供了一種野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK及其編碼基因與應(yīng)用。野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)①、序列表中的SEQ ID No ②、在①限定的氨基酸殘基序列中經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取 代、缺失或添加且具有與GsCaM蛋白(鈣調(diào)素蛋白)相互作用提高植物抗鹽性能的蛋白質(zhì)。 本發(fā)明中自氨基酸殘基序列①的氨基端第135至405位氨基酸殘基序列為蛋白激酶催化結(jié) 構(gòu)域，蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域包含激酶的11個(gè)催化亞基，屬于絲蘇氨酸蛋白激酶亞家族；蛋 白激酶催化結(jié)構(gòu)域中自氨基酸殘基序列①的氨基端第147至169位氨基酸殘基序列為CaM 結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明野生大豆抗鹽蛋白激酶基因GsCBRLK的編碼基因是下述核苷酸序列之一 (i)、序列表中的SEQ ID No :2;編碼具有氨基酸殘基序列①的蛋白質(zhì)的多核苷酸；在高嚴(yán) 謹(jǐn)條件下可與核苷酸序列(i)限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；核苷酸序列(i)中5’端 第83位到第1444位的堿基序列為開(kāi)放閱讀框架。本發(fā)明野生大豆抗鹽蛋白激酶基因GsCBRLK在提高植物對(duì)鹽脅迫的抵抗能力中應(yīng)用。本發(fā)明的蛋白激酶GsCBRLK含有一個(gè)蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域，包含激酶的11個(gè)催化 亞基，屬于絲蘇氨酸蛋白激酶亞家族，同時(shí)在該結(jié)構(gòu)域有一個(gè)CaM結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的 GsCBRLK蛋白激酶能夠與GsCaM特異性結(jié)合，增強(qiáng)其激酶活性，并調(diào)控下游基因的表達(dá)。通 過(guò)生物脅迫實(shí)驗(yàn)可以看出，本發(fā)明的蛋白激酶受多種非生物脅迫誘導(dǎo)，該本發(fā)明的基因超 表達(dá)的擬南芥較野生型表現(xiàn)出較高的鹽和ABA脅迫抗性，該基因通過(guò)ABA依賴(lài)途徑提高了 植物對(duì)高鹽脅迫的抵抗能力。本發(fā)明的野生大豆抗鹽蛋白激酶基因GsCBRLK所表達(dá)得到的 植物對(duì)高鹽脅迫的抵抗能力強(qiáng)。利用植物表達(dá)載體，將本發(fā)明的GsCBRLK的編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得對(duì)高 鹽脅迫耐受能力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。使用GsCBRLK構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)， 在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因 植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定和篩選，還可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中 表達(dá)的選擇性標(biāo)記基因(GUS基因，熒光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉 素標(biāo)記物，卡那霉素標(biāo)記物等)。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因， 直接以高鹽脅迫篩選轉(zhuǎn)化植株。攜帶有本發(fā)明GsCBRLK的植物表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì) 粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法 轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。


圖1為具體實(shí)施方式
十二中野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK獲得方法中的PCR產(chǎn) 物的電泳圖，圖中M標(biāo)示DL2000 Marker, 1表示陰性對(duì)照(ddH20)，2表示GsCBRLK基因擴(kuò) 增產(chǎn)物；圖2為GsCBRLK在非生物脅迫條件下(幼苗在4°C冷藏柜中處理后取葉作為待測(cè) 樣品)的表達(dá)特性分析結(jié)果圖；圖3為GsCBRLK在非生物脅迫條件下(幼苗在4°C冷藏柜 中處理后取根作為待測(cè)樣品)的表達(dá)特性分析結(jié)果圖；圖4為GsCBRLK在非生物脅迫條件 下(幼苗用100 μ MABA處理后取葉作為待測(cè)樣品)的表達(dá)特性分析結(jié)果圖；圖5為GsCBRLK 在非生物脅迫條件下(幼苗用100 μ MABA處理后取葉作為待測(cè)樣品)的表達(dá)特性分析結(jié)果圖；圖6為GsCBRLK在非生物脅迫條件下(幼苗用200mM的NaCl溶液處理后取葉作為待 測(cè)樣品)的表達(dá)特性分析結(jié)果圖；圖7為GsCBRLK在非生物脅迫條件下(幼苗用200mM的 NaCl溶液處理后取根作為待測(cè)樣品)的表達(dá)特性分析結(jié)果圖；圖8為GsCBRLK在非生物脅 迫條件下(幼苗用200mM的NaCl溶液處理后取葉作為待測(cè)樣品)的表達(dá)特性分析結(jié)果圖； 圖9為GsCBRLK在非生物脅迫條件下(幼苗用200mM的NaCl溶液處理后取根作為待測(cè)樣 品)的表達(dá)特性分析結(jié)果圖；圖10為具體實(shí)施方式
十二中野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK 中CaMBD的預(yù)測(cè)結(jié)果圖；圖11為具體實(shí)施方式
十二中野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK全長(zhǎng) 及缺失突變示意圖；圖12為具體實(shí)施方式
十二中野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK全長(zhǎng)及缺 失突變?cè)吮磉_(dá)分析結(jié)果圖；圖13為具體實(shí)施方式
十二中野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRL 全長(zhǎng)及缺失突變的western blot分析結(jié)果圖；圖14為具體實(shí)施方式
十二中野生大豆抗鹽 蛋白激酶GsCBRL與GsCaM蛋白的體外結(jié)合特異性及結(jié)合的Ca2+依賴(lài)性的分析結(jié)果圖；圖 15為具體實(shí)施方式
十二中野生大豆抗鹽蛋白 激酶GsCBRLK與GsCaM蛋白的體外結(jié)合特異性 及結(jié)合的EGTA的分析結(jié)果圖；圖16為CaMBD與GsCaM蛋白的凝膠(添加有CaCl2的緩沖 液)遷移分析圖，其中1泳道表示合成肽與CaM的分子比為0，2泳道表示合成肽與CaM的分 子比為0. 25，3泳道表示合成肽與CaM的分子比為0. 5，4泳道表示合成肽與CaM的分子比 為0. 75，5泳道表示合成肽與CaM的分子比為1，6泳道表示合成肽與CaM的分子比為1. 5 ； 圖17為CaMBD與GsCaM蛋白的凝膠(添加有EGTA的緩沖液)遷移分析圖，其中1泳道表 示合成肽與CaM的分子比為0，2泳道表示合成肽與CaM的分子比為0. 25，3泳道表示合成 肽與CaM的分子比為0. 5，4泳道表示合成肽與CaM的分子比為0. 75，5泳道表示合成肽與 CaM的分子比為1，6泳道表示合成肽與CaM的分子比為1. 5 ；圖18為具體實(shí)施方式
十二中 野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK與GsCaM蛋白的體內(nèi)結(jié)合特異性分析結(jié)果圖，圖中a表示 將pGBKT7-GsCBRLK/GKl/GK2/GK3與pGADT7_GsCaM共轉(zhuǎn)化酵母Y187 ；b表示待菌落長(zhǎng)出后 用接種環(huán)重新劃線在SD/-LeU/-Trp固體培養(yǎng)基；c表示菌體影印列濾紙上；圖19為具體實(shí) 施方式十二中野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK蛋白的亞細(xì)胞定位分析結(jié)果圖；圖20為不同 二價(jià)陽(yáng)離子對(duì)GsCBRLK磷酸化活性影響的電泳圖；圖21為Ca2+/CaM對(duì)GSCBRLK磷酸化活性 影響的電泳圖，圖中A表示自磷酸化；S表示底物磷酸化，1和2泳道表示添加EDTA進(jìn)行反 應(yīng)的結(jié)果，3和4泳道表示添加CaCl2進(jìn)行反應(yīng)的結(jié)果，5和6泳道表示添加CaCl2/CaM進(jìn)行 反應(yīng)的結(jié)果；圖22為合成肽對(duì)具體實(shí)施方式
十二中野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK磷酸化 活性的影響的電泳圖，圖中1泳道為不加合成肽的電泳圖，2泳道為加入1 μ M合成肽的電泳 圖，3泳道為加入2 μ M合成肽的電泳圖，4泳道為加入3 μ M合成肽的電泳圖；圖23表示轉(zhuǎn)具體實(shí)施方式
十二中野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK基因抗性植株的PCR檢測(cè)電泳圖，圖 中M表示DL2000Marker，1表示陽(yáng)性對(duì)照(質(zhì)粒DNA)，2表示陰性對(duì)照I (ddH20)，3表示陰 性對(duì)照II (野生型)，4 20表示抗性植株；圖24表示轉(zhuǎn)具體實(shí)施方式
十二中野生大豆抗 鹽蛋白激酶GsCBRLK基因植株的Southern雜交檢測(cè)結(jié)果電泳圖，圖中WT泳道為野生型植 株，#6泳道為GSCBRLK基因的轉(zhuǎn)化株系#6，#8泳道為GSCBRLK基因的轉(zhuǎn)化株系#8，#9表示 GsCBRLK基因的轉(zhuǎn)化株系#9 ；圖25為對(duì)照組中GSCBRLK在種子萌發(fā)期對(duì)脅迫耐受的效應(yīng)結(jié) 果圖，圖中*表示GsCBRLK基因的轉(zhuǎn)化株系#6，.表示GSCBRLK基因的轉(zhuǎn)化株系#9，, 表示野生型植株；圖26為含有125mMNaCl的固體培養(yǎng)基中GsCBRLK在種子萌發(fā)期對(duì)脅迫耐 受的效應(yīng)結(jié)果圖，圖中^^表示GSCBRLK基因的轉(zhuǎn)化株系#6，..『表示GSCBRLK基因的轉(zhuǎn)化株系#9，表示野生型植株；圖27為含有0. 8 μ MABA的固體培養(yǎng)基中GsCBRLK在種子萌 發(fā)期對(duì)脅迫耐受的效應(yīng)結(jié)果圖，圖中*表示GsCBRLK基因的轉(zhuǎn)化株系#6，.…表示GSCBRLK 基因的轉(zhuǎn)化株系#9， 表示野生型植株；圖28為GsCBRLK在種子萌發(fā)期對(duì)脅迫耐受的效 應(yīng)結(jié)果圖，圖中WT表示野生型植株，#6表示GsCBRLK基因的轉(zhuǎn)化株系#6，#9表示GSCBRLK 基因的轉(zhuǎn)化株系#9 ；圖29為GsCBRLK在幼苗期對(duì)脅迫耐受的效應(yīng)的結(jié)果圖，圖中WT表示野 生型植株，#6表示GsCBRLK基因的轉(zhuǎn)化株系#6，#9表示GSCBRLK基因的轉(zhuǎn)化株系#9 ；圖30 為GsCBRLK在幼苗期對(duì)脅迫耐受的效應(yīng)的柱形圖，圖中■表示野生型植株門(mén)表示GSCBRLK 基因的轉(zhuǎn)化株系#6，0表示GSCBRLK基因的轉(zhuǎn)化株系#9 ；圖31為GSCBRLK在成苗期對(duì)脅迫 耐受的效應(yīng)的結(jié)果圖，圖中—P表示GsCBRLK基因的轉(zhuǎn)化株系#6，._表示GSCBRLK基因的 轉(zhuǎn)化株系#9，·表示野生型植株。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的 任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK具有下述氨基酸殘 基序 列之一的蛋白質(zhì)①、序列表中的SEQ ID No ②、在①限定的氨基酸殘基序列中經(jīng) 過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與GsCaM蛋白(鈣調(diào)素蛋白)相互作用 提高植物抗鹽性能的蛋白質(zhì)。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK具有以下氨基酸殘 基序列①、序列表中的SEQ ID No =I0具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK具有下述氨基酸殘 基序列①限定的氨基酸殘基序列中經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與 GsCaM蛋白(鈣調(diào)素蛋白)相互作用提高植物抗鹽性能的蛋白質(zhì)。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至三之一不同的是自氨基酸殘 基序列①的氨基端第135至405位氨基酸殘基序列為蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域，蛋白激酶催化 結(jié)構(gòu)域包含激酶的11個(gè)催化亞基，屬于絲蘇氨酸蛋白激酶亞家族。其他步驟及參數(shù)與具體 實(shí)施方式一至三之一相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至四之一不同的是蛋白激酶催化 結(jié)構(gòu)域中自氨基酸殘基序列①的氨基端第147至169位氨基酸殘基序列為CaM結(jié)合結(jié)構(gòu) 域。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至四之一相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK的編碼基因是下述 核苷酸序列之一 (i)、序列表中的SEQ ID No 2 ； (ii)、編碼具有氨基酸殘基序列①的蛋白 質(zhì)的多核苷酸；(iii)、在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與核苷酸序列(i)限定的DNA序列雜交的核苷酸 序列。本實(shí)施方式中的高嚴(yán)謹(jǐn)條件是用0. IX SSPE (或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液，在 65°C下雜交并洗膜。本實(shí)施方式中野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK基因的獲得方法如下一、野生大豆?jié)B透脅迫早期應(yīng)答蛋白激酶ESTs的篩選1、野生大豆ESTs數(shù)據(jù)的收集
在 NCBI(National Center for Biotechnology Information)的 Expressed SequenceTags database中以Glycine soja作為檢索詞，獲得Genbank中所有野生大豆的 ESTs序列；利用Linux序列分析平臺(tái)中的Cross-match/PHRAP軟件包去除ESTs中的載體 序列，并進(jìn)行序列的自動(dòng)拼接以去除冗余數(shù)據(jù)，將得到的Contigs整理為數(shù)據(jù)庫(kù)。2、滲透脅迫早期應(yīng)答蛋白激酶ESTs的篩選1)利用Blastall軟件包將野生大豆ESTs數(shù)據(jù)庫(kù)與大豆芯片(Affymetrix)的探針組序列進(jìn)行相似性搜索以注釋野生大豆ESTs的功能；2)利用本研究室構(gòu)建的野生大豆 低溫、干旱和高鹽脅迫基因表達(dá)譜預(yù)測(cè)相應(yīng)Contigs在低溫、干旱和高鹽脅迫早期(Ih)表 達(dá)量的變化情況；3)選取注釋信息中含有“kinase”字樣，同時(shí)至少在一種脅迫處理下表達(dá) 量上調(diào)的ESTs ；4)利用蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)UniProt (http //beta, uniprot. org/)和Go注釋數(shù)據(jù) 庫(kù)(http://ReneontoloRy. org)并查閱相關(guān)的文獻(xiàn)，進(jìn)一步預(yù)測(cè)蛋白激酶ESTs的功能，選 取在脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起關(guān)鍵作用的蛋白激酶進(jìn)行下步的研究。二、野生大豆cDNA文庫(kù)的構(gòu)建1、野生大豆總RNA的提取和基因組DNA的去除選取飽滿的野生大豆種子(50109)，濃硫酸處理IOmin后播種于1/2MS固 體培養(yǎng)基上，待幼苗生長(zhǎng)至21天時(shí)，分別對(duì)幼苗進(jìn)行低溫(4°C)，鹽(200mM NaCl), ΑΒΑ(100μΜ(士)一cis，trans-ΑΒΑ)和干旱(30% (ff/V)PEG6000)處理。用 RNApr印 pure Plant Kit(TIANGEN)試劑盒提取上述擬南芥幼苗的總RNA，然后用RNase-free DNase I (TIANGEN)將上述的總RNA中的基因組DNA消化干凈。2、野生大豆cDNA文庫(kù)的構(gòu)建以步驟1獲得的野生大豆幼苗mRNA為模板，用BDSMART cDNA synthesis kit (Clontech)試劑盒并嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作構(gòu)建野生大豆cDNA文庫(kù)。三、用RACE法從野生大豆cDNA文庫(kù)中分離GsCBRLK基因1.通用模板的制備采用長(zhǎng)距離PCR(Long distance PCR, LD-PCR)技術(shù)擴(kuò)增野生大豆cDNA文庫(kù)。PCR 產(chǎn)物涵蓋了野生大豆的所有基因，可作為通用模板進(jìn)行全長(zhǎng)基因克隆。PCR反應(yīng)的引物序列中5，PCR Primer為序列表中的SEQ ID No:3，CDS 111/3'PCR Primer 為 SEQ ID No :4 ;PCR 反應(yīng)的體系為2. 5μ L IOXAdvantage 2 PCR Buffer，?！?5μ L 50XdNTPmix，0. 5μ L 5，PCR Primer, 0. 5μ L CDS 111/3，PCR Primer,2y L cDNA 第一鏈， 0. 5 μ L50 X Advantage 2 Polymerase Mix, PCR-Grade H2O 補(bǔ)足體積(總體積 25 μ L) ；PCR 反應(yīng)的條件為95°C Imin — (95°C 30s — 68°C 6min) X25 — 4°C。2、全長(zhǎng)基因的克降(RACE技術(shù))1)根據(jù) Clontech 的模板轉(zhuǎn)換引物(SMART IV Oligonucleotide)和 CDS 111/3，PCR Primer 設(shè)計(jì)用于 RACE 延伸的 5，-錨定引物(5，-Anchor Primers, 5' -AP) 和 3，-錨定引物(3，-AnchorPrimers, 3' -AP)，其中 5，-APl 為 SEQ ID No :5，5，-AP2 為 SEQ ID No :6，3’-AP為SEQ IDNo :7 ;2)根據(jù)靶基因的已知序列設(shè)計(jì)2 4條可用于巢 式 PCR 基因特異引物(Gene SpecificPrimers，GSPs)。設(shè)計(jì)原則為T(mén)m 值 60°C 士3°C， 引物長(zhǎng)度17 30nt (為了匹配SMART的5’ -和3’ -錨定引物)，此外，引物匹配的位置 應(yīng)盡量靠近序列的未知部分，但要保證有足夠長(zhǎng)的已知序列可用于檢驗(yàn)序列拼接的正確性，引物序列中 GSP1-151 為 SEQ ID No :8，GSP1-83 為 SEQ ID No :9，GSP1-26 為 SEQ ID No :10， GSP2-231 為 SEQ ID No :11， GSP2-181 為 SEQ IDNo :12， GSP2-114 為 SEQ ID No 13 ；3)利用巢式PCR延伸靶基因的未知序列，PCR反應(yīng)的體系為2.5μ L IOXLA Taq PCR Buffer (Mg2+free) ,2. 5μ L MgCl2 (25mM)，2 μ L dNTP mix (2. 5mM each) ,0. 5μ L 5，PCR Primer(10y Μ)，0·5μ L 3，PCR Primer (10 μ Μ)，1 μ L 稀釋 100 倍的通用模板或 PCR 產(chǎn)物， 0. 2μ L LA Taq Polymerase, PCR-Grade H2O 補(bǔ)足體積(總體積 25 μ L)，PCR 反應(yīng)的條件為 940C 7min — [94°C 30s — 65°C 30s (-0. 5°C /circle) — 72°C 2min] X 30 — 72°C IOmin — 4°C。
上一輪PCR的產(chǎn)物稀釋100倍后作為下一輪巢式PCR的模板，2 3次擴(kuò)增后進(jìn)行 電泳分離，若得到明顯的條帶，回收后與pGEM ‘ -T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109并挑取陽(yáng) 性克隆送交測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行ORF預(yù)測(cè)和BlastX同源性搜索，判斷編碼區(qū)完整性。若 并未到達(dá)靶基因cDNA的末端，則再根據(jù)延伸序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。4) GsCBRLK 全長(zhǎng)基因的 RT-PCR 擴(kuò)增。用DNAMAN軟件將RACE延伸的結(jié)果拼接成完整的序列，根據(jù)拼接好的GsCBRLK全 長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)擴(kuò)增引物，引物序列中GsCBRLK-S為SEQ ID No :14，GsCBRLK-A為SEQ ID No: 15。用高保真酶對(duì)通用模板cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖1所示。回 收PCR產(chǎn)物，送交測(cè)序，即得到了本實(shí)施方式的野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK基因。本實(shí)施方式中野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK基因的生物信息學(xué)分析利用 Clustalff多重序列比對(duì)程序和MEGA對(duì)GsCBRLK所編碼的氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域和 進(jìn)化樹(shù)的分析。GsCBRLK蛋白含有Ser/Thr蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域的11個(gè)亞基和1個(gè)CaM binding domain，可以和CaM結(jié)合，參與脅迫信號(hào)的傳導(dǎo)。本實(shí)施方式中野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK基因在非生物脅迫條件下的表達(dá) 特性分析一、野生大豆幼苗的處理選取飽滿的野生大豆種子(50109)，用濃硫酸處理IOmin去除泥膜后，用5%次氯 酸鈉消毒液消毒lOmin，播種于1/2MS固體培養(yǎng)基上，待幼苗生長(zhǎng)至21天時(shí)，進(jìn)行下述不同 條件的處理1)鹽處理用200mM NaCl溶液處理幼苗，分別處理0h，0. 5h，lh，3h，6h分別 取處理后的幼苗的葉和根，在液氮中迅速固定，放在-80°C保存待用或者直接提取RNA ；2) 干旱處理用30% (ff/V)PEG6000溶液處理幼苗，分別處理0h，0. 5h，lh，3h，6h分別取處理 后的幼苗的葉和根，在液氮中迅速固定，放在-80°C保存待用或者直接提取RNA;3)低溫處 理將幼苗置于4°C冷藏柜中進(jìn)行低溫處理，分別處理0h，0. 5h，lh，3h，6h分別取處理后的 幼苗的葉和根，在液氮中迅速固定，放在-80°C保存待用或者直接提取RNA ；4)ABA處理用 100 μ M ABA溶液處理幼苗，分別處理0h，0. 5h，lh, 3h，6h分別取處理后的幼苗的葉和根，在 液氮中迅速固定，放在-80°C保存待用或者直接提取RNA0二、野生大豆幼苗的RNA提取及基因組DNA的去除1.取經(jīng)上述不同方法處理后的野生大豆幼苗材料各約lOOmg，液氮研磨，用 RNAprep purePlant Kit (TIANGEN)試劑盒并參照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA ;2.采用TaKaRa公 司的DNase I于37°C反應(yīng)20_30min，去除RNA中的基因組DNA。反應(yīng)體系如下RNA 40 μ L， IOXDNase I Buffer5 μ L, DNase I 2 μ L, RNAase Inhibitor 0. 5 μ L, RNase-free ddH202. 5 μ L ;3.加入50 μ L的酚氯仿抽提一次，取上清，用等體積的異丙醇沉淀RNA，用70 %乙 醇洗沉淀2次，將RNA溶于40 μ L無(wú)菌RNase-free ddH20 ；4.通過(guò)電泳和紫外分光光度計(jì) 檢測(cè)RNA的濃度和完整度。三、RT-PCR法統(tǒng)一模板DNA濃度1. mRNA的反轉(zhuǎn)錄以步驟2提取的經(jīng)不同處理的野生大豆幼苗的RNA為模板，采用Reverse TranscriptaseM-MLV RNase !T(TaKaRa)試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。取 RNA 5 μ L, Oligo dT lyL，混勻后70°C變性lOmin，迅速置于冰上冷卻，然后加入5XM-MLV Buffer 2 μ L， dNTP(IOmM) 0. 5 μ L, M-MLVReverse Transcriptase 0. 25 μ L, RNAase Inhibitor 0.25 μ L, RNAase-free ddH20 lyL，混勻后 42°C lh，70°C 15min，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.模板cDNA的含量調(diào)平根據(jù)野生大豆肌動(dòng)蛋白基因(Actin)設(shè)計(jì)的引物Forward為SEQ ID No :16， Reverse為SEQ ID No :17 ；以步驟1)獲得的經(jīng)不同處理的擬南芥幼苗的cDNA為模板，PCR 擴(kuò)增擬南芥內(nèi)參基因，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。然后根據(jù)PGR產(chǎn)物的電泳結(jié)果對(duì)模板 cDNA進(jìn)行稀釋?zhuān){(diào)整模板cDNA的用量，直至內(nèi)參基因擴(kuò)增出的DNA條帶的量基本一致，使每 微升溶液中模板cDNA的含量基本一致。四、GsCBRLK基因的擴(kuò)增根據(jù)GsCBRLK基因序列設(shè)計(jì)引物，引物序列中Forward為SEQ ID No 18, Reverse 為SEQ ID No :19 ；以步驟三統(tǒng)一濃度后的經(jīng)不同處理的野生大豆幼苗的cDNA為模板，PCR 擴(kuò)增野生大豆GsCBRLK基因，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。電泳結(jié)果用ImageJ分析，結(jié)果 如圖2 圖9所示，表明本實(shí)施方式中野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK基因的表達(dá)受鹽，干 旱、ABA和低溫的誘導(dǎo)。本實(shí)施方式中野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK基因與GsCaM的結(jié)合特異性分析一、GsCBRLK與GsCaM的體外結(jié)合的功能性分析1. GsCBRLK中CaM結(jié)合結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)采用在線的A helical wheel projection程序?qū)sCBRLK中的鈣調(diào)素結(jié)合結(jié)構(gòu) 域(CaM-Binding Domain, CaMBD)進(jìn)行預(yù)測(cè)(見(jiàn)圖 10)。結(jié)果顯示 GsCBRLK 蛋白 147_169aa 處富含堿性和疏水氨基酸殘基，可以形成兩性的α -螺旋(amphiphilic，α -helix)。另外， 在這段肽鏈中，疏水殘基Val159后緊跟著兩個(gè)堿性殘基Lys16°和Arg161，這些都符合典型的 CaMBDs的結(jié)構(gòu)特征。2. GsCBRLK缺失突變及GsCaM原核表達(dá)載體的構(gòu)建為了確定GSCBRLK蛋白的鈣調(diào)素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CaMBD)，根據(jù)A helicalwheel projection程序的預(yù)測(cè)結(jié)果，構(gòu)建3個(gè)GSCBRLK缺失突變?cè)吮磉_(dá)載體(見(jiàn)圖11)，1個(gè) GsCaM原核表達(dá)載體。缺失突變GKl (氨基酸1 146，GSCBRLK的N端，不包含CaMBD)、 GK2 (氨基酸 1 169，GSCBRLK 的 N 端，包含 CaMBD)、GK3 (氨基酸 1 146，GSCBRLK 的 C 端，不包含CaMBD)及GsCaM的PCR擴(kuò)增引物序列GKl-S為SEQ ID No 20, GKl-A為SEQ ID No :21,GK2-S 為 SEQ ID No :22，GK2_A 為 SEQ ID No :23，GK3_S 為 SEQ ID No :24，GK3_A 為 SEQ ID No 25, GsCaM-S 為 SEQ ID No 26, GsCaM-A 為 SEQ ID No :27。擴(kuò)增片段用 Kpn I 和Sal I酶切后，與經(jīng)過(guò)相同酶消化的pET_32b (Novagen)載體大片段連接，構(gòu)建原核表達(dá)載體。3、GsCBRLK全長(zhǎng)及缺失突變蛋白的誘導(dǎo)及驗(yàn)證將GK1/2/3原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主菌BL21 (DE3)pLysS。用液體LB 培養(yǎng)基，在37°C條件下活化，當(dāng)菌液濃度達(dá)到OD6tltl = 0. 5 1. 0時(shí)加入終濃度ImM IPTG，在 160C 150rpm誘導(dǎo)6小時(shí)后將菌體進(jìn)行超聲波破碎、離心。重懸后進(jìn)行SDS-PAGE分析(見(jiàn) 圖12)和Westernblot驗(yàn)證(采用His標(biāo)簽抗體進(jìn)行雜交，見(jiàn)圖13)。通過(guò)圖12和圖13的 結(jié)果可知，IPTG誘導(dǎo)后大腸桿菌BL21(DE3)pLysS總蛋白提取物中出現(xiàn)了與預(yù)期的融合蛋 白分子量相符的條帶。Western blot雜交表明插入的外源基因片段已經(jīng)成功地在大腸桿菌 中表達(dá)，純化后可以用于后續(xù)的結(jié)合特異性分析。4、GsCBRLK與GsCaM蛋白的體外結(jié)合特異性分析采用12%的SDS-PAGE分離GsCBRLK全長(zhǎng)和3個(gè)缺失突變蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉后用含 有終濃度為0. 2 μ g/mL GsCaM :HRP、ImM CaCl2 (或者5mM EGTA)的PBS-T緩沖液，室溫條 雜交3小時(shí)，檢測(cè)GsCBRLK與GsCaM蛋白的體外結(jié)合特異性及結(jié)合的Ca2+依賴(lài)性(見(jiàn)圖14 和圖15)。從圖14和圖15可以看出，含有預(yù)測(cè)CaMBD (147-169aa)的重組蛋白GsCBRLK和 GK2均可以和GsCaM: :HRP結(jié)合，而不含CaMBD的GKl和GK3均末觀察到與GsCaM: :HRP的相 互作用。將結(jié)合緩沖液中的ImM CaCl2替換成5mM EGTA(Ca2+的螯合物)后，所有的相互作 用都消失了。綜上所述，GsCBRLK蛋白的CaM結(jié)合特異性是Ca2+依賴(lài)的，并且CaM的結(jié)合位 點(diǎn)定位在147-169殘基處。 5、CaMBD與GsCaM蛋白的結(jié)合的凝膠遷移分析根據(jù)4中結(jié)合特異性分析結(jié)果，將GsCBRLK的CaMBD區(qū)(即147_169aa)合成出 來(lái)，并與純化的GsCaM(合成肽與CaM的分子比為0,0. 25,0. 5,0. 75,1. 0,1. 5)在IOOmM Tris-HCl, pH = 7. 2,0. ImM CaCl2或2mM EGTA的反應(yīng)緩沖液中反應(yīng)1小時(shí)后，進(jìn)行非變性 凝膠電泳(見(jiàn)圖16和圖17)。從圖16和圖17可以看出，合成肽可以在Ca2+存在的條件下 和CaM形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然而這種結(jié)合作用在EGTA存在時(shí)不能出現(xiàn)。隨著合成肽與CaM 的分子比逐漸增大，肽段-CaM復(fù)合物的量逐漸增加，當(dāng)分子比為1 1時(shí)，所有的CaM都與 肽段形成了復(fù)合物。因此，CaMBD與CaM的化學(xué)計(jì)最為1 1。二具體實(shí)施方式
六中GsCBRLK在酵母細(xì)胞內(nèi)與GsCaM的結(jié)合特異性分析將GsCBRLK全長(zhǎng)、缺失突變克隆到酵母表達(dá)載體pGBKT7 (Trp+)中，同時(shí)將GsCaM 全長(zhǎng)⑶S區(qū)克隆到酵母表達(dá)載體pGADT7 (Leu1)。根據(jù)靶基因序列及pGBKT7、pGADT7載體 序列所含的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)5’ -端帶有酶切位點(diǎn)的PCR引物，引物序列GsCBRLK-Y-S為SEQ ID No :28，GsCBRLK-Y-A 為 SEQ ID No :29，GKl-Y-S 為 SEQ ID No :30，GKl-Y-A 為 SEQ ID No :31，GK2-Y-S 為 SEQ ID No :32，GK2-Y-A 為 SEQ ID No :33，GK3-Y-S 為 SEQ ID No :34， GK3-Y-A 為 SEQID No :35，GsCaM-Y-S 為 SEQ ID No :36，GsCaM-Y-A 為 SEQ ID No :37。GsCBRLK, GKl、GK2 和 GK3 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用 EcoR I 和 Sal I 消化后與 pGBKT7 連接；GsCaM的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Nde I和BamH I消化后與pGADT7連接。然后采用小量 LiAc/PEG 法將 pGBKT7-GsCBRLK/GKl/GK2/GK3 與 pGADT7_GsCaM 共轉(zhuǎn)化酵母 Y187 (圖 9 中的 a所示)，待菌落長(zhǎng)出后用接種環(huán)重新劃線在SD/-LeU/-Trp固體培養(yǎng)基上(圖9中的b所 示)；3天后，將菌體影印到Whatman濾紙上，并將濾紙放入液氮中15s，然后恢復(fù)到室溫使 細(xì)胞裂解，然后將濾紙浸潤(rùn)在2. 5mL Z-buffer/X-GAL溶液中，30°C培養(yǎng)觀察β -半乳糖苷酶活性；其中，Z-buffer(pH7. 0)主要成分為 Na2HPCM · 7H20 16. lg/L, NaH2P04 ·Η20 5. 50g/ L，KC1 0. 75g/L,MgSO4 ·7Η200· 246g/L ；Z-buffer/X-GAL 溶液的主要成分為 20mL Z-buffer, 0. 054mL β-巰基乙醇，67μ L20mg/mL X-GAL stock solution (圖 9 中的 c 所示)。從圖 9 可以看出，pGBKT7-GsCBRLK/pGADT7-GsCaM 組、pGBKT7_GK2/pGADT7_GsCaM 組及陽(yáng)性對(duì)照組 (pGBKT7-AtDREB/pGADT7)均能使底物變藍(lán)；而對(duì)照組(pGBKT7_GsCBRLK/pGADT7、pGBKT7/ pGADT7-GsCaM、pGBKT7/pGADT7)、pGBKT7_GK 1 /pGADT7_GsCaM 組、pGBKT7_GK3/pGADT7_GsCaM 組均未觀察到藍(lán)斑。結(jié)果表明，只有含有CaMBD區(qū)的GsCBRLK蛋白能夠與GsCaM特異結(jié)合。本實(shí)施方式中GsCBRLK在植物細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位分析根據(jù)靶基因序列及pCAMBIA-1302載體序列所含的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)上游帶有Bgl II 的酶切位點(diǎn)的PCR引物，下游帶有Spe I的酶切位點(diǎn)的PCR引物，引物序列GsCBRLK_GFP_S 為 SEQ ID No :38，GsCBRLK-GFP-A 為 SEQ ID No :39。將 GsCBRLK 全長(zhǎng) CDS 區(qū)克隆到亞細(xì)胞 定位載體PCAMBIA1302，得到GsCBRLK亞細(xì)胞定位載體pCAMBIA1302_GsCBRLK :GFP。采用 凍融法將pCAMBIA1302-GsCBRLK :GFP, pCAMBIA1302 (陰性對(duì)照)分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105， PCR鑒定得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。用重組農(nóng)桿菌浸潤(rùn)煙草葉片，過(guò)渡培養(yǎng)3天后，用激光共聚焦顯 微鏡(SP5 ；Leica, Germany)觀察488nm下熒光信號(hào)，結(jié)果如圖19所示，從圖19可以看出， GsCBRLK蛋白定位于細(xì)胞膜，而陰性對(duì)照pCAMBIA1302則無(wú)定位傾向。本實(shí)施方式中GsCBRLK蛋白的酶學(xué)特性分析一、不同陽(yáng)離子對(duì)激酶GsCBRLK磷酸化活性的影響為了檢測(cè)不同二價(jià)陽(yáng)離子對(duì)激酶自磷酸化活性的影響，在激酶活性分析的反應(yīng)液 [500nM 純化的細(xì)菌重組蛋白 GsCBRLK，25mM HEPES (pH7. 5), 0. 5mM DTT,20yM ATP, 5 μ Ci of [ y-32PlATP (5000Ci/mmol)]中，再分別添加 IOmM MgCl2UOmM CaCljP IOmM MnCl20 30 °C 反應(yīng)60min后用12% SDS-PAGE分離反應(yīng)產(chǎn)物并進(jìn)行放射自顯影(見(jiàn)圖20)。從圖20可以 看出，GsCBRLK蛋白的自磷酸化活性不受Mn2+激活，Mg2+有微弱的激活作用，而Ca2+的存在 可以強(qiáng)烈的激活其自磷酸化活性。 二、Ca2+/CaM對(duì)激酶GsCBRLK磷酸化活性的正調(diào)作用根據(jù)結(jié)合特異性分析，GsCBRLK蛋白具有鈣依賴(lài)的鈣調(diào)素結(jié)合特征。故Ca2+/CaM 結(jié)果可能會(huì)對(duì)GsCBRLK蛋白的激酶活性產(chǎn)生一定的調(diào)控作用。為了研究這個(gè)可能性，在 GsCBRLK 的酶活檢測(cè)時(shí)分別添加 ImM CaCl2UmM CaCl2/10 μ mol/L CaM禾P5mM EGTA 于 30°C 反應(yīng)60min后通過(guò)放射自顯影檢測(cè)GsCBRLK激酶活性的變化(見(jiàn)圖21)。從圖21可以看 出，GsCBRLK在Ca2+存在的情況下表現(xiàn)出自磷酸化和底物磷酸化的活性。一旦EGTA螯合掉 Ca2+之后，所有的自磷酸化和底物磷酸化活性都消失。這就說(shuō)明GsCBRLK的激酶活性是依 賴(lài)于Ca2+的。在添加10 μ mol/L CaM之后，GsCBRLK自磷酸化和底物磷酸化活性都出現(xiàn)明 顯的提高。為了進(jìn)一步確定CaM是否通過(guò)與激酶GsCBRLK的直接相互作用來(lái)調(diào)控激酶的酶 活。又在酶活反應(yīng)液中加入2 μ M合成肽(即GsCBRLK的CaMBD區(qū)，147_169aa)?？梢杂^察 到激酶GsCBRLK的酶活降低，這就證明CaM是通過(guò)與147-169氨基酸殘基的直接結(jié)合來(lái)調(diào) 控GsCBRLK的酶活(見(jiàn)圖22)。本實(shí)施方式中GsCBRLK基因的擬南芥轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的生理分析實(shí)驗(yàn)一 . GsCBRLK基因的擬南芥轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)1. GsCBRLK基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化
通過(guò)PCR擴(kuò)增在GsCBRLK基因的全長(zhǎng)⑶S區(qū)兩側(cè)分別引入Sfi I酶切位點(diǎn)，與酶 切后的PBHT載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，經(jīng)PCR檢測(cè)與酶切鑒定，得到植物表達(dá)載體 pBHT-GsCBRLK,并送交測(cè)序。將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌LBA4404，并PCR鑒定得 到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，用于侵染擬南芥植株。2. GsCBRLK基因的擬南芥轉(zhuǎn)化1)擬南芥的培養(yǎng)將擬南芥種子(哥倫比亞生態(tài)型)4°C春化3-7d后，播種于營(yíng)養(yǎng)缽中(營(yíng)養(yǎng)土，君 子蘭土，蛭石按1 1 1混合)，置于溫室中培養(yǎng)(22°c，光照16h/天)，待擬南芥抽出出 生苔后，剪去出生苔，待其抽出更多的次生苔且花開(kāi)較盛時(shí)，可用于下述轉(zhuǎn)化。2)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)
挑取轉(zhuǎn)化有pBHT-GsCBRLK的重組農(nóng)桿菌單菌落接種于5mL YEB (利福平50mg/L， 鏈霉素50mg/L，卡那霉素100mg/L)液體培養(yǎng)基中，28°C 220rpm培養(yǎng)30h，按1 100轉(zhuǎn)接 入500mL新鮮的YEB (利福平50mg/L，鏈霉素50mg/L，卡那霉素100mg/L)液體培養(yǎng)基中， 280C 230rpm 培養(yǎng) 16_24h，測(cè)得 0D600 ^ 1. 5 ；4°C 5000rpm 離心 IOmin 收集菌體，然后重懸 于 500mL5%蔗糖溶液(含 0. 02% silwet-77)中。3)轉(zhuǎn)化擬南芥將已經(jīng)結(jié)莢的花蕾剪掉，把花序倒置浸入步驟2)所得的含有重組農(nóng)桿菌的蔗糖 溶液中30S，轉(zhuǎn)化完畢后，將植株套上塑料袋保濕，水平放置于低光強(qiáng)度下生長(zhǎng)24h，即可正 常培養(yǎng)。一周后，重復(fù)侵染一次，可提高轉(zhuǎn)化效率。4)收集種子進(jìn)行篩選將侵染后所收集的種子進(jìn)行消毒春化后，播種于含有50mg/L卡那霉素的V2MS固 體培養(yǎng)基上。待種子萌發(fā)后，將綠色的陽(yáng)性植株(TO代)移栽至營(yíng)養(yǎng)缽(營(yíng)養(yǎng)上，君子蘭土， 蛭石按1 1 1混合)中培養(yǎng)，并收集種子進(jìn)行Tl代篩選。3.轉(zhuǎn)基因擬南芥的分子檢測(cè)采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的基因組DNA，并根據(jù)GsCBRLK基因序列設(shè)計(jì) 引物，引物序列 sense 為 SEQ ID No :40，antisense 為 SEQ ID No :41。以轉(zhuǎn)基因擬南芥的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果如 圖23所示，轉(zhuǎn)基因植株同陽(yáng)性對(duì)照一樣，都擴(kuò)增出了目的條帶。選取轉(zhuǎn)GsCBRLK基因擬南芥PCR陽(yáng)性植株，進(jìn)行Southern雜交檢測(cè)?；蚪MDNA 采用EcoR I消化。結(jié)果如圖24所示，GsCBRLK基因的轉(zhuǎn)化株系#6和#9，出現(xiàn)了特異性雜 信號(hào)，表明它們是Southern陽(yáng)性植株，激酶基因GsCBRLK已整合到這2株轉(zhuǎn)基因擬南芥的
基因組中。二 .轉(zhuǎn)基因擬南芥的生理分析實(shí)驗(yàn)1.種子萌發(fā)期實(shí)驗(yàn)選取飽滿的野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)和GsCBRLK超量表達(dá)擬南芥種子， 用5%次氯酸鈉消毒液消毒IOmin后，于4°C春化3_7d，分別播種于含有125mM NaCl和 0.8μΜ ABA的1/2MS固體培養(yǎng)基上，每天觀察表型并統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。結(jié)果如圖25、圖26、圖 27和圖28所示，GsCBRLK超量表達(dá)擬南芥兩個(gè)株系的萌發(fā)率均比野生型高，并且轉(zhuǎn)基因株 系的生長(zhǎng)狀態(tài)也要顯著好于野生型植株。說(shuō)明GsCBRLK超量表達(dá)擬南芥植株具有更強(qiáng)的鹽和ABA脅迫耐受能力。2.幼苗期實(shí)驗(yàn)選取飽滿的野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)和GsCBRLK超量表達(dá)擬南芥種子， 用5%次氯酸鈉消毒液消毒IOmin后，于4°C春化3-7d，播種于1/2MS固體培養(yǎng)基上，播種于 1/2MS固體培養(yǎng)基上。1周后，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥幼苗水平擺放于鋪有 基本培養(yǎng)基或添加NaCl/ABA脅迫培養(yǎng)基的帶刻度方皿中，豎直生長(zhǎng)。12d后觀察各處理組 和非處理組的擬南芥長(zhǎng)勢(shì)，結(jié)果如圖29和圖30，從圖29和圖30可以看出，在正常條件下 (未處理)，轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥的生長(zhǎng)狀態(tài)大致相同，表明導(dǎo)入的激酶基因并未 對(duì)擬南芥的生長(zhǎng)、發(fā)育造成影響。在NaCl和ABA脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南 芥的生長(zhǎng)都收到了抑制，但轉(zhuǎn)基因擬南芥受抑制的程度比對(duì)照的小，表現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因植株的 根長(zhǎng)明顯長(zhǎng)于對(duì)照。表明在脅迫條件下，GsCBRLK基因提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐受性。3.成苗期實(shí)驗(yàn)選取飽滿的野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)和GsCBRLK超量表達(dá)擬南芥種子， 4°C春化3-7d后，播種于營(yíng)養(yǎng)缽中(營(yíng)養(yǎng)土，君子蘭土，蛭石按1 1 1混合)，置于溫室 中培養(yǎng)(22°C，光照16h/天)。3周后，澆灌300mM NaCl溶液，每3天一次，持續(xù)2周，并監(jiān) 測(cè)脅迫表型及葉綠素含量。結(jié)果如圖31所示，GsCBRLK超量表達(dá)擬南芥幼苗的生長(zhǎng)狀態(tài)要 比野生型植株好，具有綠色的葉子，而野生型擬南芥的葉子已經(jīng)死亡，說(shuō)明GsCBRLKl能夠 提高成苗的抗鹽能力。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK的編碼基因具有以 下核苷酸序列(i)、序列表中的SEQ ID No :2。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式野生大豆抗鹽蛋白激酶GSCBRLK的編碼基因編碼具 有氨基酸殘基序列①的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式野生大豆抗鹽蛋白激酶GSCBRLK的編碼基因在高嚴(yán) 謹(jǐn)條件下可與核苷酸序列(i)限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本實(shí)施方式中的高嚴(yán)謹(jǐn)條件是用0. IX SSPE (或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液，在 65°C下雜交并洗膜。
具體實(shí)施方式
十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
六至九之一不同的是野生大豆抗鹽 蛋白激酶基因GsCBRLK的編碼基因核苷酸序列(i)中5’端第83位到第1444位的堿基序 列為開(kāi)放閱讀框架。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
六至九之一相同。
具體實(shí)施方式
十一本實(shí)施方式野生大豆抗鹽蛋白激酶基因GsCBRLK利用植物表 達(dá)載體，將GsCBRLK的編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞，以獲得對(duì)高鹽脅迫耐受能力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因 細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。
權(quán)利要求
一種野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK，其特征在于野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)①、序列表中的SEQ ID No1；②、在①限定的氨基酸殘基序列中經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與GsCaM蛋白相互作用提高植物抗鹽性能的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK，其特征在于自氨基酸 殘基序列①的氨基端第135至405位氨基酸殘基序列為蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域，蛋白激酶催 化結(jié)構(gòu)域包含激酶的11個(gè)催化亞基，屬于絲蘇氨酸蛋白激酶亞家族。
3.據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK，其特征在于蛋白激 酶催化結(jié)構(gòu)域中自氨基酸殘基序列①的氨基端第147至169位氨基酸殘基序列為CaM結(jié)合 結(jié)構(gòu)域。
4.一種野生大豆抗鹽蛋白激酶基因GsCBRLK的編碼基因，其特征在于野生大豆抗鹽蛋 白激酶GsCBRLK的編碼基因是下述核苷酸序列之一(i)、序列表中的SEQ ID No 2 ；( )、編碼具有氨基酸殘基序列①的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(iii)、在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與核苷酸序列(i)限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種野生大豆抗鹽蛋白激酶基因GsCBRLK的編碼基因，其特 征在于核苷酸序列(i)中5’端第83位到第1444位的堿基序列為開(kāi)放閱讀框架。
6.一種野生大豆抗鹽蛋白激酶基因GsCBRLK的應(yīng)用，其特征在于野生大豆抗鹽蛋白激 酶基因GsCBRLK利用植物表達(dá)載體，將GsCBRLK的編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞，以獲得對(duì)高鹽脅 迫耐受能力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。
全文摘要
一種野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK及其編碼基因與應(yīng)用，它涉及一種抗鹽蛋白激酶及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明解決了現(xiàn)有的蛋白激酶導(dǎo)入到植物細(xì)胞中，所獲得轉(zhuǎn)基因植株的高鹽脅迫耐受能力弱的問(wèn)題。野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK的氨基酸殘基序?yàn)樾蛄斜碇械腟EQ ID No1；野生大豆抗鹽蛋白激酶GsCBRLK編碼基因序列表中的SEQ ID No2；野生大豆抗鹽蛋白激酶基因GsCBRLK利用植物表達(dá)載體，將GsCBRLK的編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞，以獲得對(duì)高鹽脅迫耐受能力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的野生大豆抗鹽蛋白激酶導(dǎo)入到植物細(xì)胞中，所獲得轉(zhuǎn)基因植株的高鹽脅迫耐受能力強(qiáng)。
文檔編號(hào)C12N5/10GK101845421SQ201010183129
公開(kāi)日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2010年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月26日
發(fā)明者季佐軍, 才華, 朱延明, 李勇, 楊靚, 柏錫, 紀(jì)巍 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)