專利名稱：乳腺癌干細(xì)胞分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥干細(xì)胞的分離純化方法，具體涉及一種采用免疫磁珠將乳腺癌干細(xì)胞從乳腺癌腫瘤組織中分離純化的方法，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乳腺癌是婦女最常見(jiàn)的惡性腫瘤。在其治療過(guò)程中，復(fù)發(fā)是影響療效的重要因素， 而造成復(fù)發(fā)的原因，目前普遍認(rèn)為是手術(shù)治療中乳腺癌細(xì)胞的殘留，化療耐藥和放療、內(nèi)分泌等治療不敏感的乳腺癌細(xì)胞殘存。近年提出的癌干細(xì)胞(cancer stem cells, CSC)學(xué)說(shuō)又為乳腺癌轉(zhuǎn)移提供了新的理論依據(jù)。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為在腫瘤組織中只有少部分細(xì)胞不斷地增殖，而大部分腫瘤細(xì)胞處于不增殖或有限增殖的狀態(tài)，只有CSC才是腫瘤產(chǎn)生和發(fā)展的主要因素。進(jìn)一步研究認(rèn)為， CSC是來(lái)自正常干細(xì)胞，也可能來(lái)自于分化了的后代細(xì)胞，CSC應(yīng)當(dāng)擁有自我更新能力和維持惡性生長(zhǎng)的特性。最近的研究證實(shí)，在白血病、腦瘤、肺瘤和乳腺癌中只有極少一部分細(xì)胞具有發(fā)生腫瘤和維持腫瘤能力的CSC。最新白血病CSC研究顯示，CSC比它們產(chǎn)生出來(lái)的快速生長(zhǎng)后代細(xì)胞具有休眠性和更強(qiáng)的自我復(fù)制能力。因此，如能干預(yù)、阻止CSC的分化、 增殖等病理生理過(guò)程，從而清除CSC，對(duì)提高惡性腫瘤的治療效果和降低腫瘤的復(fù)發(fā)意義重大。乳腺癌是由許多形態(tài)上和功能上相當(dāng)不同的細(xì)胞組成，Michael Clarke實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)證明9個(gè)病人中有8個(gè)病人擁有ESA+⑶44+⑶M-Iin-腫瘤干細(xì)胞，這些細(xì)胞可以在小鼠中產(chǎn)生腫瘤，而注射100倍的不表達(dá)同樣抗原的其他乳腺癌細(xì)胞亞群并不能形成腫瘤，更為令人信服的是這些在小鼠上產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞可以在別的小鼠上繼續(xù)傳代產(chǎn)生腫瘤，這些腫瘤同他們的原發(fā)腫瘤一樣，包含腫瘤干細(xì)胞和由他們產(chǎn)生的惡性乳腺癌細(xì)胞.這個(gè)研究從根本上證實(shí)了 CSC在乳腺癌中存在并可發(fā)展成乳腺癌。2002年，Clarke等首次從乳腺癌組織中分離CSC，他們把乳腺癌乳房切除手術(shù)后的標(biāo)本制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)流式細(xì)胞儀篩選出表達(dá)⑶44、B38. 1、ESA的細(xì)胞，擴(kuò)增后注入N0D/SCID小鼠體內(nèi)，小鼠長(zhǎng)出了腫瘤，證明這部分細(xì)胞具有腫瘤源性；隨后AL-Hajj等從乳腺癌患者體內(nèi)分離出表達(dá)的細(xì)胞，這部分細(xì)胞具有正常干細(xì)胞的特征，能夠無(wú)限增殖，并能分化成為多種組織類型的細(xì)胞，后者增殖能力有限，由此證實(shí)了乳腺癌干細(xì)胞存在的證據(jù)。乳腺癌干細(xì)胞是一群⑶44+、⑶24_的特異細(xì)胞群，經(jīng)過(guò)研究表明乳腺癌干細(xì)胞大多存在于乳腺腫瘤組織及乳腺相關(guān)的癌細(xì)胞中。如何獲取一定數(shù)量的乳腺癌干細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)是研究者面臨的另一個(gè)技術(shù)瓶頸。乳腺癌干細(xì)胞在腫瘤組織中的比例只有約2-5%，不經(jīng)過(guò)富集難以滿足需要，因此CSC檢測(cè)的臨床應(yīng)用主要存在以下問(wèn)題首先，目前尚未發(fā)現(xiàn)乳腺癌CSC特異標(biāo)志物，現(xiàn)在運(yùn)用的檢測(cè)標(biāo)志尚存在某些缺陷，目前還難以在臨床運(yùn)用，尋找特異敏感的檢測(cè)標(biāo)志對(duì)于其臨床應(yīng)用至關(guān)重要；其二，乳腺癌癌癥干細(xì)胞的現(xiàn)有分離方法，非常復(fù)雜，需要昂貴的流式細(xì)胞儀和非常有經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)技術(shù)人員，且要經(jīng)過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后，才能確定，而且需耗時(shí)1-2年以上，約花費(fèi)數(shù)十萬(wàn)元才能完成?，F(xiàn)有技術(shù)中，應(yīng)用密度梯度離心法或流式細(xì)胞儀等方法富集腫瘤細(xì)胞均存在純度不高、儀器設(shè)備昂貴、影響細(xì)胞活力等去缺陷，因此在實(shí)際工作中難以廣泛應(yīng)用。免疫磁珠分選系統(tǒng)(Magnetic Cell Sorting，MACS)是一種新興的細(xì)胞分離技術(shù)， 被廣泛用于細(xì)胞分離，蛋白質(zhì)，核酸純化等諸多領(lǐng)域，目前MACS已用于干細(xì)胞研究，免疫磁性分離法是基于細(xì)胞表面抗原以及某種蛋白與連有免疫磁珠的特異性單抗相結(jié)，在外加磁場(chǎng)的條件下，通過(guò)抗體與免疫磁珠相連的細(xì)胞和某種蛋白被吸附而滯留在磁場(chǎng)中，由于免疫磁珠表面的單抗只結(jié)合含有特異性抗原的細(xì)胞和蛋白，從而達(dá)到與其他種類的細(xì)胞和蛋白相分離的目的。應(yīng)用免疫磁性分離技術(shù)分離細(xì)胞的方法有兩種直接從細(xì)胞混合液中分離出靶細(xì)胞的方法，稱為陽(yáng)性分離法；利用免疫磁珠去除無(wú)關(guān)細(xì)胞，使靶細(xì)胞得以純化的方法，稱為陰性分離法。應(yīng)用陰性分離法只能對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行3 4倍的富集，而陽(yáng)性分離法對(duì)腫瘤細(xì)胞的富集率則高的多，可對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行IO3 1.5X IO4倍的富集。目前尚未有如何分離特異的乳腺癌癌癥干細(xì)胞的專有技術(shù)報(bào)道。本發(fā)明中，我們嘗試?yán)妹庖叽胖榉诌x系統(tǒng)(MACS)快速分離出腫瘤組織中的癌癥干細(xì)胞，并經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)其準(zhǔn)確率，以及經(jīng)SCID鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證分選的細(xì)胞為癌癥干細(xì)胞，以從方法學(xué)上探討純化分離乳腺癌癥干細(xì)胞，為進(jìn)一步研究乳腺癌癥干細(xì)胞建立標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)乳腺癌惡性度診斷、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的監(jiān)控、指導(dǎo)術(shù)后輔助治療等具有重大意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種操作簡(jiǎn)便、成本低、特異性強(qiáng)的乳腺癌干細(xì)胞分離純化方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出用免疫磁珠分選系統(tǒng)(MACS)分離純化乳腺腫瘤中的癌癥干細(xì)胞的方法，包括以下三個(gè)步驟a.制備單細(xì)胞懸液；b.免疫磁珠陰性分選，分離去除乳腺癌細(xì)胞中的正常細(xì)胞；c.免疫磁珠陽(yáng)性分選，純化乳腺癌干細(xì)胞。上述a步驟為將腫瘤樣品切成小塊，移送到酶溶液中，37°C水浴培養(yǎng)30 40分鐘，顯微鏡下檢測(cè)，若成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，即加血清終止消化，無(wú)血清培養(yǎng)液(SFM)清洗， 離心除去上清，用MACS緩沖液重懸細(xì)胞，過(guò)45 μ m濾網(wǎng)得到懸浮單細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至 107/ml。上述b步驟為將LINEAGE陽(yáng)性抗體加入步驟a得到的細(xì)胞懸液，3 5°C孵育 20 30分鐘后，加入包被兔抗鼠的免疫磁珠，混勻，放置20分鐘，用MACS緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，離心去除多余的免疫磁珠，再用MACS緩沖液重懸細(xì)胞；用MACS緩沖液預(yù)洗LD磁性分選柱，將細(xì)胞懸液過(guò)柱，收集通過(guò)分選柱的細(xì)胞液，收集到的洗液為去除癌癥組織中正常細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞。上述LINEAGE 陽(yáng)性抗體包括 CD2，CD3，CD10，CD16, CD18, CD24, CD31 中的一種或幾種。上述加入LINEAGE陽(yáng)性抗體的比例按每5 μ 1抗體相對(duì)于2 X IO7個(gè)細(xì)胞/200 μ 1 細(xì)胞懸液。
上述c步驟為將步驟b得到的細(xì)胞懸液離心，洗滌后重懸在MACS緩沖液中，將抗⑶44抗體加入細(xì)胞懸液中，3 5°C孵育20 30分鐘，用MACS緩沖液洗滌細(xì)胞，離心去除多余的抗體，用MACS緩沖液重懸細(xì)胞，加入包被兔抗鼠的免疫磁珠，4°C放置20分鐘，加 MACS緩沖液沖洗，離心去除游離的兔抗鼠免疫磁珠，棄除上清，再以MACS緩沖液重懸細(xì)胞； 用MACS緩沖液預(yù)洗LD磁性分選柱，將細(xì)胞懸液過(guò)柱，用MACS緩沖液洗柱兩次，去除非標(biāo)記細(xì)胞，移柱出磁場(chǎng)，用MACS緩沖液洗柱，收集洗液，此為CD44陽(yáng)性CDM陰性或弱陽(yáng)性的乳腺癌腫瘤干細(xì)胞。上述加入抗⑶44抗體的比例按1. 5 μ 1抗體相對(duì)于2Χ 106/100 μ 1細(xì)胞懸液。上述免疫磁珠分離純化乳腺癌干細(xì)胞成功的前提，是標(biāo)記抗體與細(xì)胞表面標(biāo)志物的作用濃度、作用溫度以及作用時(shí)間，以保證獲得最佳的篩選效果。出于有效性和保留細(xì)胞活性兩點(diǎn)考慮，經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)篩選，最終按以1.5μ1的抗CD44抗體對(duì)應(yīng)2Χ106個(gè)腫瘤細(xì)胞/100UL的作用濃度，4°C作用時(shí)間30分鐘為最佳篩選方式。本發(fā)明具有以下特點(diǎn)(1)本發(fā)明首次將MACS陰性分選法和陽(yáng)性分選法結(jié)合運(yùn)用于乳腺癌腫瘤干細(xì)胞的純化中，篩除LINEAGE+的抗體結(jié)合陽(yáng)性的細(xì)胞，去除干擾，保留純化后的陰性腫瘤細(xì)胞， 為MACS用于腫瘤細(xì)胞的研究提供了新的領(lǐng)域。該磁珠是與高度特異性單克隆抗體相偶聯(lián)的超順化微粒，載體微球與抗體結(jié)合不影響抗體原有生物學(xué)特性，并且由于抗體本身具有特異性強(qiáng)，敏感度高的特點(diǎn)，保證了分離純化的功能和效果。(2)本發(fā)明提供的方法替代了以往用流式細(xì)胞儀來(lái)進(jìn)行分離，明顯縮短了時(shí)間，降低了費(fèi)用，而且流式細(xì)胞儀需要專業(yè)分選人士操作，納米免疫磁珠的分選方法對(duì)操作人員的專業(yè)要求低。(3)本方法操作簡(jiǎn)便快速、無(wú)須細(xì)胞流式儀等昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，純度較高，分篩后的細(xì)胞存活率高，CD44++CD24-/+特異性高，分離效果可得到細(xì)胞培養(yǎng)、流式細(xì)胞儀以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的確認(rèn)。因此，本發(fā)明在乳腺癌癥干細(xì)胞研究中將有廣闊的應(yīng)用前景，可用于開(kāi)發(fā)針對(duì)乳腺癌癥干細(xì)胞的單克隆抗體等。由該方法得到的啟示，本發(fā)明不僅僅限于應(yīng)用在乳腺癌治療，還可以擴(kuò)展到其他癌癥干細(xì)胞的篩選，配合以抗癌藥物的使用，對(duì)于癌癥干細(xì)胞的特異診斷和生物靶向治療的生物新藥，具有重要意義。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)例中使用的材料及來(lái)源1.乳腺腫瘤組織來(lái)源病例均為病理診斷乳腺癌，接受乳腺癌根治手術(shù)。所有病例未接受術(shù)前放療化療等輔助治療，術(shù)后病理判斷腫瘤分期分型，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。術(shù)后腫瘤標(biāo)本常規(guī)行免疫組化檢測(cè)ER等乳腺癌相關(guān)受體表達(dá)情況。MACS和流式細(xì)胞儀分選標(biāo)本均取自術(shù)中切除的乳腺癌病灶，無(wú)菌條件下切取腫瘤靠邊緣的組織。2.主要試劑及儀器流式細(xì)胞儀flow cytometer，F(xiàn)CM 美國(guó) FACSAnalysis45微米孔徑細(xì)胞篩網(wǎng)長(zhǎng)沙博優(yōu)生物公司細(xì)胞計(jì)數(shù)板長(zhǎng)沙博優(yōu)生物公司
LINEAGE 陽(yáng)性抗體CD44 抗體免疫磁珠分選系統(tǒng)(MACS)包被兔抗鼠的免疫磁珠Matrigal 疑膠FITC結(jié)合抗小鼠IgM熒光二抗
INVITR0GEN 公司 INVITR0GEN 公司 Militiney 公司 Militiney 公司 Biolegend 公司 Militiney 公司RPMI-1640無(wú)血清培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司，4°C保存，有效4周。HBSS (Hank，s balanced salt solution)含體積分?jǐn)?shù) 2 % 胎牛血清，10mmol/L HEPE，保存4周。本實(shí)施例中，用免疫磁珠分離純化癌癥干細(xì)胞，包括如下步驟a.制備單細(xì)胞懸液將得到的腫瘤樣本，共計(jì)5例，術(shù)后病理檢測(cè)，惡性度為 II-III級(jí)。取術(shù)中切下的組織，切取未受血液污染的組織核心，置于盛有無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基的平皿中，用手術(shù)剪剪成中等大小的小塊，后用刀片切成小塊或盡可能小，操作應(yīng)在無(wú)菌條件下并在冰上進(jìn)行。然后用25ml的一次性移液管，移送到酶溶液中，擰緊管帽，將試管放在 37°C水浴箱中，培育30 40分鐘。然后，顯微鏡下檢測(cè)，若成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，為消化完成，加血清終止消化。SFM清洗，IOOOrpm離心5分鐘去除上清，用MACS緩沖液重懸細(xì)胞，過(guò) 45 μ m濾網(wǎng)，得到懸浮單細(xì)胞，去除死亡細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至107ml。b.MACS陰性分選分離，去除癌癥細(xì)胞中的正常細(xì)胞將包括抗⑶2，⑶3，⑶10， ⑶16，⑶18，⑶24，CD31的LINIEASE陽(yáng)性抗體，除2. 5 μ 1抗CDM抗體外，其他抗體按每 5 μ 1抗體相對(duì)于2 X IO7個(gè)細(xì)胞/200 μ 1體積的比例，加入步驟a得到的細(xì)胞懸液中，4°C孵育20分鐘，然后加入50 μ 1包被兔抗鼠的免疫磁珠，混勻，放置20分鐘，用500 μ 1的MACS 緩沖液，洗滌細(xì)胞兩次，IOOOrpm離心5分鐘，去除多余的抗體磁珠。500 μ 1緩沖液重懸細(xì)胞；2ml緩沖液預(yù)洗LD磁性分選柱，將500 μ 1細(xì)胞懸液過(guò)柱，收集通過(guò)分選柱的細(xì)胞液，此為MACS法磁珠去除癌癥組織中正常細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞。c. MACS陽(yáng)性分選分離純化癌癥干細(xì)胞將b得到的細(xì)胞懸液，離心，洗滌一次，重懸在100 μ 1的MACS緩沖液中，將抗⑶44抗體，按1. 5 μ 1相對(duì)于2Χ 106/100微升體積的比例，加入細(xì)胞懸液中，4°C孵育30分鐘，用500 μ 1的MACS緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，離心去除多余的抗體，加入10 μ 1包被兔抗鼠的免疫磁珠，4°C放置20分鐘，500 μ 1緩沖液重懸細(xì)胞；IOOOrpm離心5分鐘，去除上清。2ml緩沖液預(yù)洗LD磁性分選柱，將500 μ 1細(xì)胞懸液過(guò)柱，Iml緩沖液洗柱兩次，去除非標(biāo)記細(xì)胞；移柱出磁場(chǎng)，用MACS緩沖液洗柱，收集洗液，此為MACS法得到⑶44陽(yáng)性⑶對(duì)陰性或弱陽(yáng)性的乳腺癌腫瘤干細(xì)胞。檢測(cè)方法1、細(xì)胞分選后的流式細(xì)胞儀檢測(cè)(1)將洗脫的分選出的⑶44陽(yáng)性⑶對(duì)陰性或弱陽(yáng)性的細(xì)胞用1 100稀釋的 FITC結(jié)合抗小鼠IgM熒光二抗室溫孵育1小時(shí)，PBS洗兩遍，重懸在100 μ 1的PBS緩沖液中，然后再加抗⑶M-AEC的抗體孵育、沖洗，重懸在100微升的PBS中；(2)將a步驟中分選前的細(xì)胞群離心，加CD44孵育30分鐘，沖洗兩次，再加 1 100稀釋的FITC結(jié)合抗小鼠IgM熒光二抗室溫孵育1小時(shí)，PBS洗兩遍，重懸在100 μ 1 的PBS緩沖液中，然后再加抗⑶M-AEC的抗體孵育，沖洗，重懸在100 μ 1的PBS中。將(1)和O)的細(xì)胞分別上流式細(xì)胞儀分析。2、細(xì)胞活性檢測(cè)純化前后分別取10 μ 1細(xì)胞懸液與10 μ 1 0. 4%胎盤藍(lán)溶液混合后，滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡下觀察。不著色，發(fā)亮的為活細(xì)胞；著色，胞體膨大者為死細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)及活細(xì)胞百分比。3、采用SPSS10. 0軟件對(duì)流式細(xì)胞儀分析結(jié)果進(jìn)行兩樣本的t檢驗(yàn)，分析純化前后 CD44陽(yáng)性CDM陰性或弱陽(yáng)性的乳腺癌腫瘤干細(xì)胞純度及細(xì)胞活力的差別。檢測(cè)步驟1、2、3的檢測(cè)結(jié)果為MACS純化前細(xì)胞的存活率為(89. 0+/-3) %，純化后為(88. 0+/-2. 5) % , (ρ大于
0. 05)，無(wú)顯著性差異。純化前CD44陽(yáng)性CD24陰性的細(xì)胞為(10. 0+/-1) %，純化后為(92. 0+/-2) %，(小于0.01)，差異顯著。4、動(dòng)物模型的建立取4-8周齡的N0D/SCID免疫缺陷小鼠，局部用碘酊消毒，經(jīng)分選得到的CDM+/CD44-乳腺癌細(xì)胞和陰性對(duì)照細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)要求取一定數(shù)量溶于500 μ 1 無(wú)菌HBSS培養(yǎng)基中，同時(shí)加入等體積的Matrigal凝膠，維持體系的溫度在4°C，用1毫升注射器分別注入小鼠右側(cè)，左側(cè)腋下脂肪組織，注射后Matrigal凝膠自然凝結(jié)，防止細(xì)胞從注射部位流出。再次給小鼠消毒，回籠飼養(yǎng)。每周觀察兩次，檢查成瘤情況。5.體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)將MACS和檢測(cè)步驟1流式分選的癌癥干細(xì)胞(1)，(2)各自稀釋，取5000個(gè)細(xì)胞，溶于500 μ 1培養(yǎng)基中，加入4°C，500 μ 1馬氏凝膠，共0. Iml (500個(gè)細(xì)胞)，注入SCID/N0D鼠右側(cè)腋下。同時(shí)將IO5個(gè)其他表型的腫瘤細(xì)胞與凝膠的混合物注入左側(cè)腋下脂肪墊下，SPF條件下飼養(yǎng)，8-10周后，小鼠右側(cè)腋下可觸及較明顯的新生物腫瘤，左側(cè)腋下無(wú)腫物生成，說(shuō)明乳腺癌中CD44+/CD24-細(xì)胞亞群與其他細(xì)胞相比，有更強(qiáng)大的成瘤能力，驗(yàn)證了分離出的細(xì)胞為癌癥干細(xì)胞，同時(shí)說(shuō)明MACS分選的乳腺癌癥干細(xì)胞和流式分選的乳腺癌癥干細(xì)胞相同。
權(quán)利要求
1.一種乳腺癌干細(xì)胞分離純化方法，其特征在于所述分離純化方法用免疫磁珠分選系統(tǒng)分離乳腺腫瘤中的癌癥干細(xì)胞，包括以下三個(gè)步驟a.制備單細(xì)胞懸液；b.免疫磁珠陰性分選，分離去除乳腺癌細(xì)胞中的正常細(xì)胞；c.免疫磁珠陽(yáng)性分選，純化乳腺癌干細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乳腺癌干細(xì)胞分離純化方法，其特征在于a步驟為將腫瘤樣品切成小塊，移送到酶溶液中，37°C水浴培養(yǎng)30 40分鐘，顯微鏡下檢測(cè)，若成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，即加血清終止消化，無(wú)血清培養(yǎng)液清洗，離心除去上清，用MACS緩沖液重懸細(xì)胞，過(guò)45 μ m濾網(wǎng)得到懸浮單細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至107/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乳腺癌干細(xì)胞分離純化方法，其特征在于b步驟為將 LINEAGE陽(yáng)性抗體加入步驟a得到的細(xì)胞懸液，3 5°C孵育20 30分鐘后，加入包被兔抗鼠的免疫磁珠，混勻，放置20分鐘，用MACS緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，離心去除多余的免疫磁珠，再用MACS緩沖液重懸細(xì)胞；用MACS緩沖液預(yù)洗LD磁性分選柱，將細(xì)胞懸液過(guò)柱，收集通過(guò)分選柱的細(xì)胞液，收集到的洗液為去除癌癥組織中正常細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種乳腺癌干細(xì)胞分離純化方法，其特征在于所述LINEAGE 陽(yáng)性抗體包括CD2, CD3,⑶10，⑶16，⑶18，CD24, CD31中的一種或幾種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種乳腺癌干細(xì)胞分離純化方法，其特征在于加入LINEAGE 陽(yáng)性抗體的比例按每5 μ 1抗體相對(duì)于2 X IO7個(gè)細(xì)胞/200 μ 1細(xì)胞懸液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乳腺癌干細(xì)胞分離純化方法，其特征在于c步驟為將步驟b得到的細(xì)胞懸液離心，洗滌后重懸在MACS緩沖液中，將抗⑶44抗體加入細(xì)胞懸液中，3 5°C孵育20 30分鐘，用MACS緩沖液洗滌細(xì)胞，離心去除多余的抗體，用MACS緩沖液重懸細(xì)胞，加入包被兔抗鼠的免疫磁珠，4°C放置20分鐘，加MACS緩沖液沖洗，離心去除游離的兔抗鼠免疫磁珠，棄除上清，再以MACS緩沖液重懸細(xì)胞；用MACS緩沖液預(yù)洗LD磁性分選柱，將細(xì)胞懸液過(guò)柱，用MACS緩沖液洗柱兩次，去除非標(biāo)記細(xì)胞，移柱出磁場(chǎng)，用MACS 緩沖液洗柱，收集洗液，此為CD44陽(yáng)性CDM陰性或弱陽(yáng)性的乳腺癌腫瘤干細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種乳腺癌干細(xì)胞分離純化方法，其特征在于加入抗CD44 抗體的比例按1. 5 μ 1抗體相對(duì)于2Χ 106/100 μ 1細(xì)胞懸液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種應(yīng)用免疫磁珠分選系統(tǒng)分離純化乳腺癌干細(xì)胞的方法，其步驟包括首先置備單細(xì)胞懸液，其次進(jìn)行免疫磁珠陰性分選，分離去除乳腺癌細(xì)胞中的正常細(xì)胞，最后進(jìn)行免疫磁珠陽(yáng)性分選，純化乳腺癌干細(xì)胞。本方法操作簡(jiǎn)便快速、無(wú)須昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，分篩后的細(xì)胞存活率高，CD44++CD24-/+特異性高，在乳腺癌癥干細(xì)胞研究中將有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N5/095GK102260647SQ20101018312
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2010年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月26日
發(fā)明者盧英 申請(qǐng)人:盧英