專利名稱：一種驗(yàn)證順式作用基因表達(dá)數(shù)量性狀基因座真實(shí)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及遺傳基因組學(xué)、生物信息學(xué)、分子生物學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域，是一種順式作用基因表達(dá)數(shù)量性狀基因座真實(shí)性驗(yàn)證的方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，隨著人類及一系列模式生物全基因組測(cè)序工作相繼完成，闡明基因互作 網(wǎng)絡(luò)、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及代謝網(wǎng)絡(luò)的生物學(xué)功能，成為后基因組時(shí)代(post genome era)的生物 學(xué)研究的重點(diǎn)及熱點(diǎn)。一直以來(lái)，基因組學(xué)研究和經(jīng)典數(shù)量遺傳學(xué)的研究互不滲透，獨(dú)立 進(jìn)行，使用各自的研究設(shè)計(jì)方案、試驗(yàn)材料及分析工具。最近，有學(xué)者提出遺傳基因組學(xué) (genetical genomics)的概念，將數(shù)量性狀基因座(quantitative trait loci，QTL)定位 和基因表達(dá)(expression)分析聯(lián)合運(yùn)用，即基因表達(dá)數(shù)量性狀基因座(Expression QTL, eQTL)分析技術(shù)。通過(guò)定位基因組中控制某基因表達(dá)的基因座，尋找出控制某基因表達(dá)的 上游調(diào)控位點(diǎn)，挖掘受該基因調(diào)節(jié)的下游基因以及與該基因協(xié)同作用的其他基因，建立基 因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而深入地揭示復(fù)雜性狀的分子機(jī)理和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。eQTL分析綜合運(yùn)用了 多門(mén)學(xué)科的研究方法，如分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、生物統(tǒng)計(jì)學(xué)、基因組學(xué)與遺傳學(xué)等。借 助eQTL分析，我們既可以通過(guò)基因芯片技術(shù)了解大多數(shù)基因表達(dá)的差異，同時(shí)又可以借助 于QTL定位技術(shù)找到控制這些基因表達(dá)差異的上游基因位點(diǎn)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于能同時(shí) 在某一時(shí)間、某一部位的兩個(gè)層次上分析基因表達(dá)和控制基因表達(dá)的情況，達(dá)到系統(tǒng)了解 基因轉(zhuǎn)錄的上游調(diào)控機(jī)制，最終構(gòu)架基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)模型的目的。因此這一技術(shù)比以往研究 單個(gè)基因表達(dá)調(diào)控的效率高得多，能系統(tǒng)的反映基因表達(dá)及表達(dá)所受調(diào)控兩個(gè)水平上的變 化。通過(guò)基因表達(dá)數(shù)量性狀基因座定位的方法能對(duì)基因組的幾萬(wàn)個(gè)轉(zhuǎn)錄子同時(shí)進(jìn)行 eQTL分析，轉(zhuǎn)錄子與傳統(tǒng)意義上的表型不同，每個(gè)轉(zhuǎn)錄子在基因組上的相應(yīng)位置是已知的， 因此，可根據(jù)eQTL定位到的區(qū)間與轉(zhuǎn)錄子在染色體上的相對(duì)位置，將eQTL分為順式作用 eQTL(cis-eQTL)和反式作用eQTL(trans_eQTL)若eQTL被定位到基因自身所在的區(qū)域 則為順式作用，一般我們將定位在自身基因所在位置士 5Mb以內(nèi)的eQTL稱為cis-eQTL， cis-eQTL的候選基因即為基因自身，也就是說(shuō)往往認(rèn)為引起該表達(dá)變異的基因就是其本 身；反之，若被定位到基因自身所在基因組位置以外的其他區(qū)域，即不同染色體或相同染色 體的不同區(qū)間(通常大于20Mb)，反式作用一般是通過(guò)改變基因的編碼序列，從而引起蛋白 結(jié)構(gòu)的改變，最終影響定位轉(zhuǎn)錄子的基因表達(dá)差異，反式作用也可能是轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)其它 某種途徑發(fā)揮的作用?；蛐酒夹g(shù)是目前獲得大批量基因表達(dá)資料的主要手段，是遺傳基因組學(xué)分析 中不可獲缺的工具。探針與靶序列的特異性結(jié)合是基因芯片技術(shù)的核心，因而任何改變探 針雜交親和力的因素都會(huì)對(duì)芯片檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生較大的影響。有關(guān)探針靶序列的多態(tài)性改變 探針親和力，降低檢測(cè)信號(hào)的靈敏度和準(zhǔn)確性，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生的現(xiàn)象已引起 研究者的高度重視。Benovoy等人提出‘masking’ probes的方案，即剔除所有目的區(qū)含有已知多態(tài)性位點(diǎn)(HapMap phase II SNPs)的探針，應(yīng)用其余探針進(jìn)行表達(dá)量的檢測(cè)。但這種做法在降低假陽(yáng)性檢出率的同時(shí)，以犧牲信息量為代價(jià)，‘masking’ probes后，會(huì)有部分 序列根本得不到檢測(cè)。SNP在基因組中廣泛存在，目前利用多種手段發(fā)現(xiàn)小鼠C57BL/6J和DBA/2J兩個(gè)品 系之間存在1400多萬(wàn)個(gè)SNPs。在基因組DNA中，位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP (coding SNP, cSNP) 比較少，因?yàn)橥怙@子的變異率僅為其它序列的1/5，SNP更可能出現(xiàn)在非編碼序列中，包括 啟動(dòng)子、內(nèi)含子和基因間的序列。調(diào)控序列主要分布在非編碼區(qū)域，因此這部分序列的變異 可能會(huì)造成表達(dá)的改變。但是如果序列的多態(tài)性(如SNP，INDEL)發(fā)生在探針序列上，則會(huì) 導(dǎo)致假陽(yáng)性cis-eQTL的產(chǎn)生。為了研究SNP對(duì)eQTL分析，尤其是對(duì)cis-eQTL定位結(jié)果的 影響，我們對(duì)探針不同位置上的SNP引起的假陽(yáng)性率進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果表明在探針中心位 置的SNP對(duì)eQTL的定位影響遠(yuǎn)大于位于探針未端的SNP。有關(guān)如何大批量分析cis-eQTL 的真實(shí)性的方法，目前國(guó)內(nèi)外還無(wú)相關(guān)報(bào)道，如何高效而準(zhǔn)確地判斷cis-eQTL的真假是本 發(fā)明的關(guān)鍵所在。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高效而又準(zhǔn)確地驗(yàn)證順式作用基因表達(dá)數(shù)量性狀基 因座真實(shí)性的方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種驗(yàn)證順式作用基因表達(dá)數(shù)量性狀基因座真實(shí)性的方法，其特征是包括下列 步驟(1)結(jié)合基因表達(dá)資料和基因型數(shù)據(jù)，借助BXD的基因重組近交系小鼠進(jìn)行基因 表達(dá)數(shù)量性狀基因座定位的初步的分析，篩選出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的上游調(diào)控位點(diǎn)，并根據(jù) 所定位到的eQTL的位置進(jìn)行初步判斷，eQTL所在位置與基因自身所在位置相距5Mb范圍 以內(nèi)的被初步認(rèn)定為順式作用基因表達(dá)數(shù)量性狀基因座；(2)通過(guò)RT-PCR實(shí)驗(yàn)或ABA原位雜交分析，驗(yàn)證基因芯片資料的準(zhǔn)確性；(3)分析兩親本C57BL/6J(B6)和DBA/2J(D2)間的基因表達(dá)差異，剔除差異表達(dá)無(wú) 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因；(4)借助于Celera、Perlegen以及田納西州大學(xué)SNP數(shù)據(jù)庫(kù)，分析探針靶序列的 多態(tài)性，剔除靶序列上存在B6和D2間的多態(tài)性序列的基因；(5)進(jìn)行等位基因特異性表達(dá)分析，檢測(cè)Fl代小鼠(B6D2F1或D2B6F1)中兩等位 基因(B和D)的表達(dá)差異，若兩等位基因B和D表達(dá)具有顯著差異則為真性cis-eQTL。步驟(2)的具體方法是應(yīng)用基因芯片技術(shù)獲取BXD基因重組近交系小鼠各部 分組織(如海馬、中腦、前腦、眼、肝、肺等組織)的基因表達(dá)資料，并通過(guò)ABA原位雜交或者 RT-PCR的方法驗(yàn)證基因芯片資料的準(zhǔn)確性。步驟⑴中基因型數(shù)據(jù)的獲得方法是使用Mit(MicrosateIlites)及SNP(Single Nucleotide Polymorphism)分子遺傳標(biāo)志(geneticalmarkers)對(duì)BXD的基因重組近交系 小鼠進(jìn)行全基因組掃描，獲得BXD的基因重組近交系小鼠的基因型數(shù)據(jù)。本發(fā)明可以高效而又準(zhǔn)確的驗(yàn)證cis-eQTL真實(shí)性。我們可借助于B6、D2互交系Fl代小鼠進(jìn)行等位基因特異性表達(dá)(allelespecific expression difference, ASE)分析，即結(jié)合 RT-PCR 和 SNaPshot (Applied Biosystems)技術(shù)，分析B、D等位基因在B6D2F1 (或D2B6F1)中的表達(dá)差異，以判斷所定 位到的cis-eQTL的真實(shí)性。我們知道，兩親本B6、D2小鼠都為近交系小鼠，因此檢測(cè)等位 基因在Fl代中的表達(dá)就等同于同時(shí)檢測(cè)其在兩親本中的表達(dá)量。理論上，如果某基因的 cis-eQTL為真性cis-eQTL，那么在相同遺傳背景和環(huán)境因素影響下，其Fl代等位基因的表 達(dá)量的比值則應(yīng)該偏離1 1 ；相應(yīng)的，若某基因的eQTL為trans-eQTL，其Fl代等位基因 的表達(dá)量的比值則應(yīng)該為1 1，因?yàn)樵谙嗤倪z傳背景條件下，一個(gè)反式作用因子對(duì)兩個(gè) 等位基因的作用應(yīng)該是等同的。SNapshot是一種單堿基延伸技術(shù)，其開(kāi)發(fā)的初衷主要是針 對(duì)中等通量的SNP分型的研究。在一個(gè)含有測(cè)序酶，四種熒光標(biāo)記的ddNTP，緊挨多態(tài)位點(diǎn) 5’端 的不同長(zhǎng)度延伸引物和PCR產(chǎn)物模板的反應(yīng)體系中，引物延伸一個(gè)堿基即終止，經(jīng)ABI 測(cè)序儀分析后，根據(jù)峰的顏色可知摻入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型。cis-eQTL真 實(shí)性的確定對(duì)后續(xù)研究如候選基因的挖掘、下游調(diào)控基因的篩選等工作具有很重要的意 義。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
具體實(shí)施例方式一種驗(yàn)證順式作用基因表達(dá)數(shù)量性狀基因座真實(shí)性的方法，其特征是包括下列 步驟(1)結(jié)合基因表達(dá)資料和基因型數(shù)據(jù)，借助BXD的基因重組近交系小鼠 (Recombinant Inbred, RI)進(jìn)行基因表達(dá)數(shù)量性狀基因座定位的初步的分析，篩選出具有 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的上游調(diào)控位點(diǎn)，并根據(jù)所定位到的eQTL的位置進(jìn)行初步判斷，eQTL所在位置 與基因自身所在位置相距5Mb范圍以內(nèi)的被初步認(rèn)定為順式作用基因表達(dá)數(shù)量性狀基因 座；(2)通過(guò)RT-PCR實(shí)驗(yàn)或ABA原位雜交分析，驗(yàn)證基因芯片資料的準(zhǔn)確性；(3)分析兩親本C57BL/6J(B6)和DBA/2J(D2)間的基因表達(dá)差異，剔除差異表達(dá)無(wú) 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因；(4)借助于Celera、Perlegen以及田納西州大學(xué)SNP數(shù)據(jù)庫(kù)，分析探針靶序列的 多態(tài)性，剔除靶序列上存在B6和D2間的多態(tài)性序列的基因；(5)進(jìn)行等位基因特異性表達(dá)分析，檢測(cè)Fl代小鼠(B6D2F1或D2B6F1)中兩等位 基因(B和D)的表達(dá)差異，若兩等位基因B和D表達(dá)具有顯著差異則為真性cis-eQTL。步驟(2)的具體方法是應(yīng)用基因芯片技術(shù)獲取BXD基因重組近交系小鼠各部 分組織(如海馬、中腦、前腦、眼、肝、肺等組織)的基因表達(dá)資料，并通過(guò)ABA原位雜交或者 RT-PCR的方法驗(yàn)證基因芯片資料的準(zhǔn)確性。步驟(1)中基因型數(shù)據(jù)的獲得方法是使用Mit(MicrosateIlites)及SNP(Single Nucleotide Polymorphism)分子遺傳標(biāo)志(geneticalmarkers)對(duì)BXD的基因重組近交系 小鼠進(jìn)行全基因組掃描，獲得BXD的基因重組近交系小鼠的基因型數(shù)據(jù)。
權(quán)利要求
一種驗(yàn)證順式作用基因表達(dá)數(shù)量性狀基因座真實(shí)性的方法，其特征是包括下列步驟(1)結(jié)合基因表達(dá)資料和基因型數(shù)據(jù)，借助B×D的基因重組近交系小鼠進(jìn)行基因表達(dá)數(shù)量性狀基因座定位的初步的分析，篩選出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的上游調(diào)控位點(diǎn)，并根據(jù)所定位到的eQTL的位置進(jìn)行初步判斷，eQTL所在位置與基因自身所在位置相距5Mb范圍以內(nèi)的被初步認(rèn)定為順式作用基因表達(dá)數(shù)量性狀基因座；(2)通過(guò)RT-PCR實(shí)驗(yàn)或ABA原位雜交分析，驗(yàn)證基因芯片資料的準(zhǔn)確性；(3)分析兩親本間的表達(dá)差異，剔除差異表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因；(4)分析探針靶序列的多態(tài)性，剔除靶序列上存在B6和D2間的多態(tài)性序列的基因；(5)進(jìn)行等位基因特異性表達(dá)分析，若兩等位基因B和D表達(dá)具有顯著差異則為真性cis-eQTL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的驗(yàn)證順式作用基因表達(dá)數(shù)量性狀基因座真實(shí)性的方法，其特 征是步驟(2)的具體方法是應(yīng)用基因芯片技術(shù)獲取BXD基因重組近交系小鼠各部分組 織的基因表達(dá)資料，并通過(guò)ABA原位雜交或者RT-PCR的方法驗(yàn)證基因芯片資料的準(zhǔn)確性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的驗(yàn)證順式作用基因表達(dá)數(shù)量性狀基因座真實(shí)性的方法， 其特征是步驟(1)中基因型數(shù)據(jù)的獲得方法是使用Mit及SNP分子遺傳標(biāo)志對(duì)BXD的 基因重組近交系小鼠進(jìn)行全基因組掃描，獲得BXD的基因重組近交系小鼠的基因型數(shù)據(jù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的驗(yàn)證順式作用基因表達(dá)數(shù)量性狀基因座真實(shí)性的方法， 其特征是分析探針靶序列的多態(tài)性，是借助于CelenPerlegen以及田納西州大學(xué)SNP數(shù) 據(jù)庫(kù)，分析探針靶序列的多態(tài)性，剔除靶序列上存在B6和D2間的多態(tài)性序列的基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的驗(yàn)證順式作用基因表達(dá)數(shù)量性狀基因座真實(shí)性的方法， 其特征是進(jìn)行等位基因特異性表達(dá)分析是檢測(cè)Fl代小鼠B6D2F1或D2B6F1中兩等位基因 B和D的表達(dá)差異，若兩等位基因B和D表達(dá)具有顯著差異則為真性cis-eQTL。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種高效而準(zhǔn)確地驗(yàn)證順式作用基因表達(dá)數(shù)量性狀基因座真實(shí)性的方法。綜合生物信息學(xué)分析和分子生物學(xué)技術(shù)，逐步剔除假陽(yáng)性cis-eQTL剔除兩親本間表達(dá)差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)基因的基因；剔除探針靶序列在B6和D2間存在多態(tài)性的基因；運(yùn)用RT-PCR技術(shù)或ABA原位雜交分析的方法驗(yàn)證基因芯片資料的準(zhǔn)確性；進(jìn)行等位基因特異性表達(dá)分析，若兩等位基因表達(dá)具有顯著差異則認(rèn)為是真性cis-eQTL。本發(fā)明可以高效而又準(zhǔn)確的驗(yàn)證cis-eQTL真實(shí)性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101818201SQ20101015014
公開(kāi)日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2010年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月9日
發(fā)明者陸璐, 陳穎 申請(qǐng)人:南通大學(xué)