專利名稱：系列鎮(zhèn)痛活性肽dkk及其類似物的獲得方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術領域，涉及系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其類似物的獲得方法 和作為鎮(zhèn)痛藥物在醫(yī)藥領域中的應用，具體地說，本發(fā)明涉及系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍 生物或類似物或活性片段結構及其獲得方法和作為鎮(zhèn)痛藥物在醫(yī)藥領域中的應用。
背景技術：
疼痛是人類共有而又有較大個體差異性的一種不愉快的主觀感覺，它在軀體受到 威脅時提供警報信號，是生命不可缺少的一種保護機制。專利名稱為蝎抗神經(jīng)興奮肽(發(fā) 明專利號ZL 00112016.6)的發(fā)明提供了一種蝎抗神經(jīng)興奮肽及其基因序列和作用為預 防、治療神經(jīng)興奮性疾病(如癲癇、驚厥等)的藥物。Ch皿-Guang Wang等在文章中報道 了抗癲癇肽結構(Chun_Guang Wang， Xiao_Lin He， Feng Shao， Wei Liu， Min-Hua Ling， Da-Cheng W肌g and Cheng-WuChi. Molecular characterization of 肌肌ti一印il印sy peptide from thescorpion Buthus martensi Karsch. Eur. J. Biochem. 268，2480—2485， 2001)。上述專利和論文所涉及的多肽是否具有鎮(zhèn)痛生物活性并沒有報道，因此，有必要針 對其鎮(zhèn)痛生物活性進行系統(tǒng)研究。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是利用基因工程技術表達系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK，針對純化的系 列鎮(zhèn)痛活性肽DKK，進行其體內鎮(zhèn)痛生物活性研究。 本發(fā)明的第二個目的是在證明系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK具有鎮(zhèn)痛生物活性的基礎上， 利用基因工程技術獲得系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK的衍生物或類似物或活性片段，所獲得的系列 鎮(zhèn)痛活性肽DKK的衍生物或類似物或活性片段仍具有鎮(zhèn)痛生物活性。 本發(fā)明的第三個目的是提供獲得系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活 性片段的方法，該方法包括 1.分別構建系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活性片段所編碼DNA的重 組表達載體； 2.用步驟1的重組載體分別轉化適當?shù)乃拗骷毎?3.在適合于表達系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活性片段的條件下 培養(yǎng)步驟2的被轉化的宿主細胞； 4.收獲并純化所得到的系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活性片段。 本發(fā)明的第四個目的是提供含有如上限定的系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或
類似物或活性片段和一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。 本發(fā)明的另一個目的是提供如上限定的系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似
物或活性片段在生產(chǎn)鎮(zhèn)痛藥物中的應用。 本發(fā)明提供了一種上述載體轉化的宿主細胞。 本發(fā)明提供的上述表達產(chǎn)物分離純化可使用鹽析沉淀、超濾、離子交換層析、疏水作用層析和凝膠過濾等方法，從細胞的溶胞產(chǎn)物及培養(yǎng)液中分離并純化所需的表達 產(chǎn)物。在產(chǎn)物的分離和純化過程中，可使用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法 (SDS-PAGE)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印跡法(WESTERN)檢測產(chǎn)物的存在及相 應分子大小。 本發(fā)明還提供了系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活性片段在生物制 藥領域的應用，具體地說包括鎮(zhèn)痛生物活性的應用。 本發(fā)明首次進行系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活性片段的小鼠體 內鎮(zhèn)痛生物學活性實驗。 本發(fā)明進一步涉及含有上述系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活性片 段和至少一種醫(yī)藥上可接受的惰性載體或賦形劑的藥物組合物?？砂凑罩扑幑I(yè)領域已 知的基本原則和方法制備適于胃腸道外途徑給藥的藥物組合物(如參見Remington' s Pharmaceutical Science, 15th. ，Mack PublishingCompany， 1980)?？赏ㄟ^各禾中給藥途徑， 特別是靜脈內、肌肉內、關節(jié)內、腹腔內、鼻內、皮內、皮下等胃腸道外途徑投用本發(fā)明的藥 物組合物。 可使用本發(fā)明的系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活性片段或含有該 系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活性片段的藥物組合物作為治療劑，用于治療 特定類型人體的各種疼痛相關疾病。本發(fā)明的藥物組合物的治療有效劑量一般應根據(jù)疾病 的性質、嚴重程度及對藥物的敏感適應性，以及給藥途徑等諸多因素由臨床醫(yī)生按照個體 化原則來確定。 在本發(fā)明中，術語"宿主細胞"包括原核細胞和真核細胞，常用的原核宿主細胞的 例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物 細胞等。 本發(fā)明的系列鎮(zhèn)痛活性肽及DKK及其衍生物或類似物或活性片段獲得方法簡單， 獲得的產(chǎn)物具有較好的鎮(zhèn)痛活性。
具體實施例方式
下面的實施例可以使本專業(yè)技術人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限
制本發(fā)明特批權利要求的范圍。
實施例1 : 鎮(zhèn)痛活性肽DKK-1的獲得 1.鎮(zhèn)痛活性肽DKK-1表達質粒的構建 本實施例列舉描述用于表達本發(fā)明鎮(zhèn)痛活性肽DKK-1的重組表達質粒的構建策 略和基本方法。 根據(jù)鎮(zhèn)痛活性肽DKK-1 ( —級結構DGYIRGSNGCKISCLWGNEGCNKECKGFGAYYGYCWTWG LACWCEGLPDDKTWKSESNTCGGKK)的氨基酸序列，設計相應寡核苷酸引物1和引物2，同時在上 述兩個寡核苷酸引物的5'端，分別加上限制性核酸內切酶Nde I和BamHI水解位點序列。 以已經(jīng)構建含有DKK-1基因的質粒為模板，利用上述引物1和引物2進行PCR擴增，瓊脂糖 凝膠電泳檢測產(chǎn)物并進行核酸片段的凝膠回收，經(jīng)過限制性核酸內切酶Nde I和BamHI雙 酶切后，與同樣進行雙酶切的表達質粒在T4 DNA ligase的作用下進行重組連接，熱轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH 5a ，經(jīng)過菌落PCR和限制性核酸內切酶酶切驗證篩選獲得陽性轉化 子后進行DNA序列測定。結果表明，通過上述基因工程的方法構建獲得鎮(zhèn)痛活性肽DKK-1 表達質粒。 2.鎮(zhèn)痛活性肽DKK-1的獲得 將上述鎮(zhèn)痛活性肽DKK-1表達質粒熱轉化大腸桿菌BL21 ( A DE3)，然后從該LB固 體平板上挑取單菌落后接種至3ml LB (含卡那抗生素，50 y g/ml)，于37°C ， 200r/min振蕩 過夜培養(yǎng)。按照1%接種量將過夜培養(yǎng)物接種至400ml含相應抗生素的新鮮LB培養(yǎng)基的三 角瓶中，于37°C ， 200r/min振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0. 6-0. 8，加入終濃度為0. 166mmol/L的誘導 物異丙基P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，培養(yǎng)4h。結束發(fā)酵，3000g，4。C離心20min，收集菌 體。用40ml裂解緩沖液(0. 1M PBS，O. 15M NaCl，50mM咪唑)重懸菌體，進行超聲破碎，超 聲結束后于12， OOOg， 4t:離心20min，得上清液，所得沉淀按照上述步驟重復破碎一次，合 并兩次上清液，上樣于O. 1M PBS(pH 8.0)預先平衡好的金屬離子螯合層析柱，經(jīng)過兩個不 同階段的pH緩沖液分別充分洗滌5個柱床體積后，使用0. 5M咪唑(pH 9. 0)進行洗脫并收 獲洗脫液。所得產(chǎn)物經(jīng)過15% SDS-PAGE驗證純度。該重組表達質粒編碼表達產(chǎn)物的結構
KK;、上、述獲得的表達產(chǎn)物，利用化學法在M處斷裂肽鏈，從而獲得鎮(zhèn)痛活性肽DKK-1，結構特 實施例2 : 鎮(zhèn)痛活性肽DKK-2的獲得 本實施例獲得鎮(zhèn)痛活性肽DKK-2的策略和基本方法，類同實施例1的策略和基本 方法。鎮(zhèn)痛活性肽DKK-2的結構特征為DGYIRGSNGCKVSCLWGNDGCNKECRAYGASYGYCWTWGL
ACWCEGLPDDKTWKSESNTCGGKK 。 實施例3 : 鎮(zhèn)痛活性肽DKK-3的獲得 本實施例獲得鎮(zhèn)痛活性肽DKK-3的策略和基本方法，類同實施例1的策略和基本 方法。鎮(zhèn)痛活性肽DKK-3的結構特征為DGYIRGSNGCKISCLWGNEGCNKECIGFGAYYGYCWTWGL
ACWCEGLPDDKTWKSESNTCGGKK 。 實施例4 : 鎮(zhèn)痛活性肽DKK-4的獲得 本實施例獲得鎮(zhèn)痛活性肽DKK-4的策略和基本方法，類同實施例1的策略和基本 方法。鎮(zhèn)痛活性肽DKK-4的結構特征為DGYIRGSNGCKVSCLLGNEGCNKECRAYGASYGYCWTWKL ACWCQGLPDDKTWKSESNTCGGKK 。
實施例5 : 系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK類似物的獲得 本實施例獲得系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK類似物的策略和基本方法，類同實施例1的策 略和基本方法。系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK的類似物結構包括DKK-1 :
DKK-2 :
DKK-3 :
DKK-4 :KK。 實施例6 : 系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其類似物體內鎮(zhèn)痛活性檢測一小鼠醋酸扭體法 本實施例通過小鼠體內鎮(zhèn)痛模型旨在驗證系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其類似物的鎮(zhèn)
痛活性。蛋白濃度采用Lowry方法進行測定。 小鼠醋酸扭體法鎮(zhèn)痛模型將冰醋酸作為化學剌激物注入昆明種小鼠腹腔內，繼 而引起深部的、大面積而較持久的疼痛剌激，致使小鼠產(chǎn)生"扭體"反應(腹部內凹、軀干與 后腿伸張、臀部高起)。 18-22g昆明種小鼠，雌雄各半，隨機分組，每組IO只，樣品實驗組分別腹腔注射系 列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其類似物樣品1. 23mg/kg體重，20min后按0. 2ml/20g腹腔注射0. 6% (v/V)醋酸引起內臟痛，5min后記錄小鼠10min內的扭體次數(shù)。以嗎啡為陽性對照，生理鹽
水為空白對照，按照下述公式計算各個給藥組的扭體反應抑制率。
鎮(zhèn)痛生物活性實驗結果表明 生理鹽水空白組實驗動物扭體次數(shù)(Mean士SEM)為45. 80 ±2. 99 ; 陽性對照組(嗎啡，1. OOmg/kg體重)實驗動物扭體次數(shù)(Mean士SEM)為
28. 95±1. 85，扭體抑制率為36. 79% ; 鎮(zhèn)痛活性肽DKK-1組(1. 23mg/kg體重)的實驗動物扭體抑制率為37. 16% ;鎮(zhèn)痛 活性肽DKK-2組(1. 23mg/kg體重)的實驗動物扭體抑制率為36. 23% ;鎮(zhèn)痛活性肽DKK-3 組(1. 23mg/kg體重)的實驗動物扭體抑制率為38. 06% ;鎮(zhèn)痛活性肽DKK-4組(1. 23mg/kg 體重)的實驗動物扭體抑制率為36. 86% ; 系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK類似物各組(1. 23mg/kg體重)的實驗動物扭體抑制率均在 33. 25%以上。
抑制率
空白組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù) 空白組扭體次數(shù) ~
xl00o/o
權利要求
系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活性片段在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應用。
2. 根據(jù)權利要求l所述的應用，其特征在于，所述的鎮(zhèn)痛活性肽DKK分別含有如下氨基 酸序列
3.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所述的鎮(zhèn)痛活性肽DKK的類似物是通過 鎮(zhèn)痛活性肽DKK的N末端前加一個甲硫氨酸殘基而獲得，其包括如下氨基酸序列
4. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK的衍生物或活 性片段，包含權利要求2或3所述的氨基酸序列全序或片段。
5. 根據(jù)權利要求l所述的應用，其特征在于，所述的系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或 類似物或活性片段，可利用基因工程技術表達獲得，其表達宿主細胞為原核細胞或真核細 胞，其方法包括(1) 分別構建系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活性片段所編碼DNA的重組 表達載體；(2) 用步驟1的重組載體分別轉化適當?shù)乃拗骷毎?3) 在適合于表達系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活性片段的條件下培養(yǎng) 步驟2的被轉化的宿主細胞；(4) 收獲并純化所得到的系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活性片段。
6. 根據(jù)權利要求l所述的應用，其特征在于，所述的系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或 類似物或活性片段，可以利用化學合成技術獲得，化學合成為人工合成或合成儀合成。
7. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所述的系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物 或類似物或活性片段可以與藥學上可接受的載體混合制備臨床上可接受的注射劑、口服制 劑、透皮吸收制劑、粘膜吸收制劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術領域，涉及系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其類似物與其獲得方法和作為鎮(zhèn)痛藥物在醫(yī)藥領域中的應用。所述鎮(zhèn)痛活性肽分別含有如下氨基酸序列DGYIRGSNGCKISCLWGNEGCNKECKGFGAYYGYCWTWGLACWCEGLPDDKTWKSESNTCGGKK；DGYIRGSNGCKVSCLWGNDGCNKECRAYGASYGYCWTWGLACWCEGLPDDKTWKSESNTCGGKK；DGYIRGSNGCKISCLWGNEGCNKECIGFGAYYGYCWTWGLACWCEGLPDDKTWKSESNTCGGKK；DGYIRGSNGCKVSCLLGNEGCNKECRAYGASYGYCWTWKLACWCQGLPDDKTWKSESNTCGGKK。所述系列鎮(zhèn)痛活性肽DKK及其衍生物或類似物或活性片段，可利用基因工程技術表達獲得，獲得方法簡單，獲得的產(chǎn)物具有很好的鎮(zhèn)痛活性。
文檔編號C12N15/79GK101766808SQ201010120159
公開日2010年7月7日 申請日期2010年3月9日 優(yōu)先權日2010年3月9日
發(fā)明者吳春福, 宋永波, 張景海 申請人:沈陽藥科大學