專(zhuān)利名稱(chēng)：多生物素信號(hào)放大方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生命物質(zhì)的檢測(cè)，尤其涉及對(duì)生命特征物質(zhì)的檢測(cè)。
背景技術(shù)：
生命特征物質(zhì)包括DNA和RNA兩大類(lèi)。 以DNA物質(zhì)為例，乙型肝炎是一種由乙肝病毒引起的肝臟感染，對(duì)機(jī)體潛在威脅 較大，是世界上一種主要的健康問(wèn)題和最嚴(yán)重的病毒性肝炎類(lèi)型。乙肝在中國(guó)和其它亞洲 地區(qū)流行，估計(jì)有20億人受到乙肝病毒感染。盡管流行地區(qū)采取了計(jì)劃疫苗成功地使乙肝 表面抗原(HBsAg，慢性感染的血清學(xué)標(biāo)志)流行程度下降，仍有3.5億的病毒攜帶者，其中 25%將會(huì)發(fā)展為肝病、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)，每年估計(jì)有60萬(wàn)人死于乙肝引發(fā) 的急慢性疾病。中國(guó)每年HBV直接的醫(yī)療開(kāi)支大約在260億人民幣以上。
血液中的標(biāo)志物可用于乙肝感染的診斷和急慢性感染的鑒別診斷，這些標(biāo)志物包 括乙肝病毒的抗原和抗體。乙肝病毒有三種常用的抗原 一-表面抗原(HBsAg)，現(xiàn)行的HBV 感染診斷基于對(duì)表面抗原的免疫學(xué)檢測(cè)，核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)及其相應(yīng)的 抗體。盡管這些檢測(cè)可以用于攜帶者初篩，但不能用于血清中感染性病毒的檢測(cè)。
HBV-DNA是病毒復(fù)制的最直接標(biāo)志。HBV是小DNA病毒，核外殼含有一條3. 2Kb的 部分雙鏈的基因組，其復(fù)制通過(guò)RNA介導(dǎo)。測(cè)定血清中HBV-DNA是鑒別病毒是否復(fù)制的重 要工具，檢測(cè)到血標(biāo)本中的HBV DNA標(biāo)志者病毒活躍復(fù)制。在急性肝炎，HBV-DNA感染后不 久即出現(xiàn)，清除感染后則消失。在慢性乙肝，HBV DNA水平常常持續(xù)增高多年，免疫系統(tǒng)控 制病毒時(shí)則下降。對(duì)于慢性乙肝，一些HBsAg陽(yáng)性、抗HBe陽(yáng)性而HBV活躍復(fù)制的患者，應(yīng) 用PCR檢測(cè)特別有用。 有5_10%進(jìn)行肝移植的病人患上HBV相關(guān)的慢性和暴發(fā)性肝病。HBV再感染可能 是由于來(lái)源于循環(huán)血、肝外部位或二者的HBV病毒顆粒移植的直接再感染。沒(méi)有預(yù)防性檢 測(cè)，HBV再感染的風(fēng)險(xiǎn)幾乎是80X。再發(fā)性感染可導(dǎo)致移植物衰竭、再移植或死亡。因此肝 移植隨訪(fǎng)HBV感染，對(duì)長(zhǎng)期生存至關(guān)重要。這就需要更加敏感的HBV-DNA檢測(cè)。
抗病毒治療是控制和防治慢性乙肝疾病進(jìn)展的唯一選擇。已經(jīng)證明核苷類(lèi)似物 在控制疾病進(jìn)程是有效的，不過(guò)耐藥性的發(fā)生限制了遠(yuǎn)期效果。拉米夫定是第一個(gè)批準(zhǔn)用 于該病治療的核苷類(lèi)似物。拉米夫定耐藥性每年的發(fā)生率是14-24%，4_5年的發(fā)生率是 70 % 。由于耐藥毒株的發(fā)生，完整地監(jiān)測(cè)病人顯得越來(lái)越重要，多種突變主要發(fā)生在HBV聚 合酶反轉(zhuǎn)錄酶區(qū)的活性位點(diǎn)，YMDD。有二個(gè)主要的突變與拉米夫定耐藥性有關(guān)rtM204V和 rtM204I，其它的突變有rtL80V、 rtl 169T、rtV173L、rtL180M、rtl81T、rtT184S、rtM240V/1/ S和rtQ215S。 目前HBV耐藥性檢測(cè)基于PCR方法，不過(guò)這有二個(gè)潛在的問(wèn)題，首先由于DNA污染 可能導(dǎo)致假陽(yáng)性，再者用PCR同時(shí)檢測(cè)多種突變是非常有限的。 PCR是一種直接高敏檢測(cè)病毒基因組的方法，但由于污染所致假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)以及 發(fā)展定量檢測(cè)方法上的困難可能阻止其應(yīng)用。此外，由于次優(yōu)反應(yīng)條件和DNA的不完全變
3性可導(dǎo)致假陰性，標(biāo)本收集和/或處理方面的錯(cuò)誤也可能引起問(wèn)題。 以RNA物質(zhì)為例，丙型肝炎病毒(HCV)是肝臟相關(guān)發(fā)病和死亡的另一種主要原因， 全球有1. 7億HCV引起的慢性感染，占世界人口的3%。其長(zhǎng)期嚴(yán)重的臨床疾病風(fēng)險(xiǎn)是肝 硬化和肝癌。中國(guó)每年有30萬(wàn)人死于急慢性乙肝和丙肝，與HBV相同，HCV感染可引起急 慢性丙肝、肝硬化和原發(fā)性的肝細(xì)胞癌(HCC)。研究顯示與HBV相比，HCV與HCC關(guān)系更密 切，80% HCC由HCV引起，由HBV引起則是15% 。 HCV感染與HBV明顯不同的是HCV感染與 脂肪肝、肝臟介導(dǎo)的糖尿病、B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)。中國(guó)每年HCV直接的醫(yī)療開(kāi)支大約在117 億到216億人民幣。 HCV是單鏈的RNA病毒，有快速自發(fā)的突變，其頻率估計(jì)是每年每個(gè)核苷酸是1022 次突變，致使世界上許多分離的病毒序列相異較大，這使得疫苗開(kāi)發(fā)很困難，因此有效診斷 HCV對(duì)防止丙肝的傳播至關(guān)重要，長(zhǎng)期來(lái)看這將節(jié)省醫(yī)療資源，降低HCV的醫(yī)療開(kāi)支?；?一定的基因差異及相似性，HCV可以分成6個(gè)主要的基因型，1、2、3、4、5和6，其分布在不同 的國(guó)家，2型是中國(guó)最常見(jiàn)的類(lèi)型，歐洲和美國(guó)是1型。基因型信息對(duì)HCV治療是非常重要 的，其可預(yù)測(cè)治療效果，例如用聚乙二醇化干擾素加利巴韋林對(duì)2型或3型要治療24周，1 型是48周。 30X輸血后肝炎在中國(guó)是由于丙型肝炎，因此輸血是HCV感染的主要來(lái)源，目前 大多數(shù)醫(yī)院沒(méi)有在篩查前防HCV侵入的檢查。許多國(guó)家引入了 HCV治療的"指南"，中國(guó)也 將推行"中國(guó)丙型肝炎預(yù)防指南"，這將改善現(xiàn)行丙型肝炎診斷中發(fā)揮積極的作用。丙型肝 炎的早期診斷對(duì)阻止在高危人群中間的進(jìn)一步傳播以及臨床醫(yī)生做出快速的治療決定是 至關(guān)重要的，因?yàn)橐呀?jīng)證明快速的治療對(duì)急性丙肝是非常有效的。 丙型肝炎病毒的感染可以通過(guò)檢測(cè)血液中HCV抗體來(lái)確定。抗HCV C-100抗 體的放免檢測(cè)方法和ELISA檢測(cè)方法是丙型肝炎的主要診斷方法，這有許多缺點(diǎn)，首先， 抗-C100抗體出現(xiàn)較晚，在急性感染后8周的窗口期不能被檢測(cè)到。輸血后丙肝患者有一 半是在輸血后4-6月首次出現(xiàn)抗C-100的血清轉(zhuǎn)換，因此用于急性肝炎的常規(guī)實(shí)驗(yàn)診斷就 不合適，第二不敏感，少量的丙肝病人檢測(cè)不到C-100抗體，第三不特異， 一些慢性肝病的 病人由于自身的免疫因素導(dǎo)致假陽(yáng)性，由于抗-HCV核心抗體出現(xiàn)較早，二代檢測(cè)抗HCV抗 體檢測(cè)試劑基于HCV C區(qū)的C-22-C蛋白和非結(jié)構(gòu)區(qū)NS3編碼蛋白C-33-3和C-100-3，這使 得檢測(cè)效率提高了 25 30%，使初次檢測(cè)期提前16-42天。 由于多種因素，包括抗原突變，較多的基因型，較長(zhǎng)的窗口期等，單獨(dú)的抗體檢測(cè) 或抗原檢測(cè)在獻(xiàn)血篩查的安全方面不是可靠的方法，在早期的HCV感染診斷上效率不高。 現(xiàn)在HCV-RNA檢測(cè)是診斷病毒本身及其復(fù)制的一種更直接更可靠的方法。由于HCV感染者 血中HCV量有限，這就很難進(jìn)行不擴(kuò)增直接雜交來(lái)檢測(cè)HCV-RNA。 HCV是RNA病毒，在PCR 擴(kuò)增前，其需要將RNA先轉(zhuǎn)換成cDNA，用5'非編碼區(qū)的保守區(qū)設(shè)計(jì)的引物來(lái)反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增， 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳觀(guān)察，方法很敏感。HCV-RNA/PCR可用來(lái)測(cè)定肝和血清中的HCV-RNA，可在少 至1-2周內(nèi)(感染后)檢測(cè)到HCV。由于肝和血清HCV-RNA較抗體出現(xiàn)的早，許多HCV感染 者還未出現(xiàn)抗HCV血清轉(zhuǎn)換時(shí)，HCV-RNA就可以在肝和血清中檢測(cè)到。HCV-RNA陽(yáng)性時(shí)，表 明病毒復(fù)制；HCV-RNA陰性時(shí)，表明病毒清除。因此RT-PCR可用于HCV的早期診斷、篩選供 血和預(yù)示丙肝預(yù)后。不過(guò)HCV的RT-PCR檢測(cè)的主要缺點(diǎn)是需要制備RNA以及反轉(zhuǎn)錄cDNA， 此外還需要有一定的技術(shù)，重現(xiàn)性有限，需要特定的儀器設(shè)備，有受污染的危險(xiǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足而提出一種高敏感的檢 測(cè)技術(shù)。本發(fā)明的技術(shù)通過(guò)信號(hào)放大而不是基于PCR的模板擴(kuò)增技術(shù)實(shí)現(xiàn)核酸的敏感檢 測(cè)。因?yàn)槲痦毮０鍞U(kuò)增，從而避免PCR固有的污染問(wèn)題。更重要的是PCR僅用于DNA擴(kuò)增。 對(duì)于RNA分子例如HCV RNA病毒以及許多的mRNA標(biāo)記物，PCR就需要擴(kuò)增之前將RNA轉(zhuǎn)換 成cDNA。因?yàn)楸景l(fā)明的技術(shù)可以直接檢測(cè)RNA分子，勿須反轉(zhuǎn)錄以及為了轉(zhuǎn)錄而進(jìn)行的RNA 預(yù)分離，因此極大的簡(jiǎn)化了操作步驟。此外，與PCR不同的是本發(fā)明的技術(shù)有更寬的線(xiàn)性檢 測(cè)范圍和更好的精密性，檢測(cè)時(shí)不需要特殊的儀器設(shè)備，定量測(cè)定時(shí)不需要昂貴的預(yù)標(biāo)記 染料，檢測(cè)既簡(jiǎn)單又高效。 本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題采用的技術(shù)方案是，設(shè)計(jì)制造一種多生物素信號(hào)放大方 法，通過(guò)一多生物素分子的連接對(duì)待檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行放大以提升核酸檢測(cè)的靈敏度，該多生 物素分子包括通過(guò)雜交識(shí)別連接物分子的單鏈DNA分子和用于生物素標(biāo)記的載體分子。
該載體分子為DNA、 RNA、寡核苷酸、多核苷酸或聚合物。
該載體分子為單鏈或雙鏈。 該載體分子上的生物素為通過(guò)酶反應(yīng)或化學(xué)反應(yīng)雜交標(biāo)記的生物素。
該生物素標(biāo)記使至少兩個(gè)生物素共價(jià)或非共價(jià)連接到該載體分子。
該連接物分子為DNA、 RNA或寡核苷酸。 該連接物分子為與靶分子雜交的一個(gè)或多個(gè)合成分子的一部分。
該靶分子為捕獲到微孔板上或其它固相上。
在一個(gè)實(shí)施例中，該耙分子為HBV-DNA。
在另一個(gè)實(shí)施例中，該耙分子為HCV-RNA。 同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的多生物素信號(hào)放大方法，可以大大提高檢測(cè)的信號(hào)的 檢測(cè)靈敏度，并免除PCR所存在各種技術(shù)缺陷。


圖1為本發(fā)明的多生物素信號(hào)放大方法的基礎(chǔ)原理。
圖2為本發(fā)明的多生物素信號(hào)放大方法的工作原理。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合各附圖所示之最佳實(shí)施例作進(jìn)一步詳述。 如圖l所示，本發(fā)明的多生物素信號(hào)放大方法的基礎(chǔ)原理為，該靶分子l可以捕獲 到微孔板6上或其它固相上，該靶分子1可以與一個(gè)連接分子2、一個(gè)多生物素分子4以及 相應(yīng)的標(biāo)記物5連接，以實(shí)現(xiàn)該靶分子1的檢測(cè)。 如圖2所示，本發(fā)明的多生物素信號(hào)放大方法的工作原理為，該靶分子1可以捕獲 到微孔板6上或其它固相上，該靶分子1可以與連接分子2、載體分子3、承載在每個(gè)載體分 子3上的生物素分子4以及相應(yīng)的標(biāo)記物5連接，以實(shí)現(xiàn)該靶分子1的信號(hào)放大的檢測(cè)。需 要說(shuō)明的是，該圖示中的數(shù)字，僅為說(shuō)明本發(fā)明的工作原理用，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明方法的限 定，其中，
該連接物分子2可以為DNA、 RNA或寡核苷酸，其為與靶分子1雜交的一個(gè)或多個(gè) 合成分子的一部分。 該載體分子3為DNA、RNA、寡核苷酸、多核苷酸或聚合物，其可以是單鏈或雙鏈，其 可以是通過(guò)酶反應(yīng)或化學(xué)反應(yīng)雜交標(biāo)記上生物素4，該生物素標(biāo)記使至少兩個(gè)生物素4共 價(jià)或非共價(jià)連接到該載體3。 從而一個(gè)靶分子1可以與多個(gè)連接分子2、多個(gè)載體分子3和多個(gè)生物素4以 及相應(yīng)的標(biāo)記物5連接而使檢測(cè)的信號(hào)得到放大.這項(xiàng)技術(shù)稱(chēng)為多生物素信號(hào)放大方法 (MBSA)。 以HBV-DNA的檢測(cè)為例，本發(fā)明的多生物素信號(hào)放大方法通過(guò)放大報(bào)告信號(hào)，而 不是擴(kuò)增靶序列，因此避免了在抽提和擴(kuò)增靶序列過(guò)程中所帶來(lái)的難以擺脫的誤差，此外， 所有已知HBV藥物的耐藥性突變位點(diǎn)，基于MBSA耙探針序列都可以同等的測(cè)定，MBSA的技 術(shù)和實(shí)用性特征有助于在臨床上的常規(guī)使用。對(duì)于血清和血漿標(biāo)本勿需標(biāo)本制備過(guò)程，對(duì) 于有潛在污染標(biāo)本，勿須特別處理過(guò)程。應(yīng)用MBSA技術(shù)可以準(zhǔn)確測(cè)定病毒載量，省略核酸 抽提的繁瑣步驟，減少了交叉污染的可能性。 本發(fā)明的多生物素信號(hào)放大方法類(lèi)似夾心ELISA方法，該方法中，來(lái)自病人的血 清在DNA變性后可直接加至檢測(cè)載體，比如96孔微孔板中，HBV-DNA被微孔板中預(yù)包被的 寡核苷酸特異捕獲，捕獲之后，HBV-DNA分子與檢測(cè)標(biāo)本中的寡核苷酸孵育，之后與多生物 素分子孵育，從而多個(gè)而不是單個(gè)鏈霉素和素_辣根酶可以與捕獲的HBVDNA分子結(jié)合，形 成檢測(cè)信號(hào)的放大，因此可以高敏檢測(cè)HBV-DNA。 以HCV-RNA的檢測(cè)為例，本發(fā)明的多生物素信號(hào)放大方法通過(guò)放大報(bào)告信號(hào)來(lái)測(cè) 定HCV-RNA水平，而不是擴(kuò)增耙序列，因此避免了在抽提和擴(kuò)增耙序列過(guò)程中所帶來(lái)的難 以擺脫的誤差。MBSA技術(shù)設(shè)計(jì)的靶探針，可以同等定量所有已知的HCV基因型，因此該方法 可以同等的定量包括6個(gè)主要HCV基因型序列的所有的RNA轉(zhuǎn)錄體。MBSA的技術(shù)和實(shí)用性 特征有助于在臨床上的常規(guī)使用。對(duì)于血清和血漿標(biāo)本勿需標(biāo)本制備過(guò)程，對(duì)于有潛在污 染標(biāo)本，勿須特別處理過(guò)程。應(yīng)用MBSA技術(shù)可以準(zhǔn)確測(cè)定病毒載量，省略核酸抽提的繁瑣 步驟，減少了交叉污染的可能性。 本發(fā)明的多生物素信號(hào)放大方法類(lèi)似夾心ELISA方法，來(lái)自病人的血清在核酸變 性后可直接加至96孔板中，HCV-RNA被微孔板中預(yù)包被的寡核苷酸特異捕獲，捕獲之后， HCV-RNA分子與檢測(cè)標(biāo)本中的寡核苷酸孵育，之后與多生物素分子孵育，多個(gè)而不是單個(gè)鏈 霉素和素_辣根酶與捕獲的HCV-RNA分子結(jié)合，因此可以高敏檢測(cè)HCV-RNA。
綜上，本發(fā)明的多生物素信號(hào)放大方法方法，大致包括三個(gè)溫育步驟
1、標(biāo)本和檢測(cè)寡核苷酸溫育；
2、與多生物素分子孵育；
3、與鏈霉素和素_辣根酶溫育。 可見(jiàn)，本發(fā)明的多生物素信號(hào)放大方法，如ELISA法一樣簡(jiǎn)單，但可高敏進(jìn)行核酸 分子檢測(cè)，其有益之處包括，但不限于首先沒(méi)有標(biāo)本預(yù)處理，標(biāo)本是直接加到板孔內(nèi)的，這 不僅簡(jiǎn)化步驟，也避免了實(shí)驗(yàn)誤差；其次，勿需特殊儀器，每一個(gè)常規(guī)診斷實(shí)驗(yàn)室都可進(jìn)行； 第三檢測(cè)成本較低。 以上，僅為本發(fā)明之較佳實(shí)施例，意在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而非對(duì)其進(jìn)行限定。凡根據(jù)上述之文字和附圖所公開(kāi)的內(nèi)容進(jìn)行的簡(jiǎn)單的替換，都在本專(zhuān)利的權(quán)利要求保護(hù)范圍 之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種多生物素信號(hào)放大方法，其特征在于，通過(guò)一多生物素分子的連接對(duì)待檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行放大以提升核酸檢測(cè)的靈敏度，該多生物素分子包括通過(guò)雜交識(shí)別連接物分子的單鏈DNA分子和用于生物素標(biāo)記的載體分子。
2. 如權(quán)利要求1所述的多生物素信號(hào)放大方法，其特征在于，該載體分子為DNA、 RNA、 寡核苷酸、多核苷酸或聚合物。
3. 如權(quán)利要求2所述的多生物素信號(hào)放大方法，其特征在于，該載體分子為單鏈或雙鏈。
4. 如權(quán)利要求3所述的多生物素信號(hào)放大方法，其特征在于，該載體分子上的生物素 為通過(guò)酶反應(yīng)或化學(xué)反應(yīng)雜交標(biāo)記的生物素。
5. 如權(quán)利要求4所述的多生物素信號(hào)放大方法，其特征在于，該生物素標(biāo)記使至少兩 個(gè)生物素共價(jià)或非共價(jià)連接到該載體。
6. 如權(quán)利要求1所述的多生物素信號(hào)放大方法，其特征在于，該連接物分子為DNA、RNA 或寡核苷酸。
7. 如權(quán)利要求6所述的多生物素信號(hào)放大方法，其特征在于，該連接物分子為與靶雜 交的一個(gè)或多個(gè)合成分子的一部分。
8. 如權(quán)利要求7所述的多生物素信號(hào)放大方法，其特征在于，該靶分子為捕獲到微孔 板上或其它固相上。
9. 如權(quán)利要求8所述的多生物素信號(hào)放大方法，其特征在于，該靶分子為HBV-DNA。
10. 如權(quán)利要求8所述的多生物素信號(hào)放大方法，其特征在于，該靶分子為HCV-RNA。
全文摘要
一種多生物素信號(hào)放大方法，通過(guò)一多生物素分子的連接對(duì)待檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行放大以提升核酸檢測(cè)的靈敏度，該多生物素分子包括通過(guò)雜交識(shí)別連接物分子的單鏈核酸分子和用于生物素標(biāo)記的載體分子。從而一個(gè)靶分子可以與連接分子、載體分子和多個(gè)生物素以及相應(yīng)的標(biāo)記物連接而使檢測(cè)的信號(hào)得到放大。在靶分子的不同區(qū)域連接上多個(gè)連接物分子，可獲得更大的放大效果。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101792800SQ20101004281
公開(kāi)日2010年8月4日 申請(qǐng)日期2010年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月19日
發(fā)明者姜昕, 李先強(qiáng) 申請(qǐng)人:深圳市宏信生物技術(shù)有限公司