專利名稱：梓醇的制備新方法和含它的藥物組合物及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及梓醇的制備新方法以及它和含它的藥物組合物在抗帕金森病和老年性癡呆病 方面的應(yīng)用。
技術(shù)背景地黃(yfe力/ a/7/7ia ^7w"/7osa ^'力osc/ .)為玄參科植物，主要分布在河南省，遼寧、河 北、山東、浙江亦產(chǎn)。用地黃的新鮮或干燥塊根入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，現(xiàn)代諸多典籍 也有記載。鮮地黃性大寒，味甘、苦，具有清熱涼血，潤燥生津的功能；干地黃性寒，味甘、 苦，具有清熱養(yǎng)陰，涼血止血的功能。關(guān)于地黃化學成分的主要含有環(huán)烯醚萜類、水蘇糖、 e-谷甾醇、甘露醇、油菜甾醇及精氨酸等。近年來，國內(nèi)外學者對地黃中含有的梓醇的制備 方法亦有多種報道，但采用以80%乙醇溶液為溶劑進行平轉(zhuǎn)式連續(xù)逆流提取與H103大孔吸附 樹脂進行分離的方法未見報道。對該化合物和含它的藥物組合物用于抗帕金森病和老年性癡 呆病方面的應(yīng)用和機理研究未見報道。對地黃中梓醇提取制備方法的研究報道，主要有兩種 其一為加60%乙醇溶液8倍量，回流提取2次，每次1.5小時；其二為加70%乙醇溶液12倍 量，回流提取4次，每次1.5小時。但因在加熱提取過程中梓醇易氧化，造成收率下降；同 時因大量乙醇溶液的使用，使更多雜質(zhì)被提出，增加了后期分離純化的困難。地黃具有清熱 養(yǎng)陰，涼血止血的功能，國內(nèi)對其所含的梓醇的生物活性研究主要集中在對血糖的影響方面， 尚未見對帕金森病和老年性癡呆病方面的應(yīng)用和機理研究的報道。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目在于提供梓醇的制備新方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種從地黃中提取制 備梓醇的方法。本發(fā)明的進一步目的是提供本發(fā)明制備方法制備的梓醇和含它的藥物組合物 在治療帕金森病和老年性癡呆病方面的用途。本發(fā)明人采用以80%乙醇溶液為溶劑進行平轉(zhuǎn) 式連續(xù)逆流提取、H103大孔吸附樹脂進行分離純化的新方法從地黃中制備梓醇，經(jīng)證實該化 合物具有抗帕金森病和老年性癡呆病的藥物活性。本發(fā)明的技術(shù)方案是1、梓醇的結(jié)構(gòu)通式(I )如下<formula>formula see original document page 4</formula>其中Rt為單糖，R3， R4, R5， Rs為氫，Re為0H，尺7為-0CH20H。2 、制備權(quán)利要求1所述的梓醇的新方法，該方法包括以下步驟a將地黃(y e/M7a/7/^'a《7""/ osa h'力osc力.)的新鮮或干燥塊根放置于平轉(zhuǎn)式連續(xù)逆流 提取裝置中在乙醇溶液中浸泡并滲漉；b將地黃的乙醇提取液濃縮后用水分散，依次用石油醚，乙酸乙酯萃取除去雜質(zhì)；c將b中水溶液相用H103大孔吸附樹脂柱層析，用水洗至色淺，換成10%、 20%、 30%、 50%、 .80%乙醇溶液梯度洗脫，收集80%乙醇餾分；d將c中收集餾分減壓濃縮并干燥；f將d中的干燥物用甲醇-乙醇反復多次重結(jié)晶處理，得到純度為99%的該化合物。本發(fā)明的化合物與水按質(zhì)量百分比1: 1000000至1: 4的組合物； 本發(fā)明的化合物與植物油按質(zhì)量百分l: 1000000至l: 5的組合物； 本發(fā)明的化合物與淀粉或/和蔗糖按質(zhì)量百分l: 10000至100: l的組合物； 本發(fā)明的化合物化合物與左旋多巴或/和卡比多巴或/和司米吉蘭或/和硝替卡朋按質(zhì)量百分1: 10000至10000: 1的組合物；本發(fā)明的化合物與苯海索或/和丙環(huán)定或/和苯扎托品按質(zhì)量百分1: 10000至10000: 1的組合物；本發(fā)明的化合物與金剛烷胺或/和溴隱亭或/和培高利特按質(zhì)量百分1: 10000至10000: 1的組合物；本發(fā)明的化合物與他克林或/和哈伯因或/和美曲膦酯或/和加蘭他敏按質(zhì)量百分1:10000 至10000: 1的組合物；本發(fā)明的化合物與占諾美林或/和Sabcomedine hydrochloride按質(zhì)量百分1: 10000至 10000: 1的組合物；本發(fā)明的化合物化合物化合物與AIT082或/和鹽酸乙酰L肉堿或/和丙戊茶堿按質(zhì)量百 分h 10000至10000: l的組合物；本發(fā)明的化合物及所述的組合物可作制備抗帕金森病和 老年性癡呆病藥物的用途。本發(fā)明經(jīng)過活性篩選，確定以地黃的新鮮或干燥塊根為原料，采 用以80%乙醇溶液為溶劑進行平轉(zhuǎn)式連續(xù)逆流提取、H103大孔吸附樹脂進行分離純化相結(jié)合 的方法，最終獲得梓醇的高收率和高純度；由體外神經(jīng)細胞和體內(nèi)動物模型實驗結(jié)果表明， 梓醇具有抗帕金森病和老年性癡呆病的活性。本發(fā)明又從該化合物出發(fā)設(shè)計了一系列該化合 物的藥物組合物。本發(fā)明為研究開發(fā)新的抗帕金森病和老年性癡呆病藥物提供了梓醇的制備 新方法和含它的藥物組合物，有利于進一步開發(fā)天然藥物資源。本發(fā)明的有益效果是，為研究開發(fā)新的抗老年性癡呆和帕金森病藥物提供了該化合物新 的制備方法和含它的藥物組合物，有利于進一步開發(fā)天然藥物資源。


下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步的說明。圖1是梓醇在帕金森小鼠細胞模型上的作用(對照組)圖2是梓醇在帕金森小鼠細胞模型上的作用(MPP+)圖3是梓醇在帕金森小鼠細胞模型上的作用(梓醇組)圖4是梓醇對帕金森模型鼠的活性作用(對照組)圖5是梓醇對帕金森模型鼠的活性作用(帕金森模型)圖6是梓醇對帕金森模型鼠的活性作用(梓醇治療組)圖7是梓醇對卜42誘導的大腦皮層神經(jīng)元損傷的保護的作用(對照組)圖8是梓醇對A 0卜42誘導的大腦皮層祌經(jīng)元損傷的保護的作用(A P ,-,2組)圖9是梓醇對A e H2誘導的大腦皮層神經(jīng)元損傷的保護的作用(梓醇組)具體實施方式
下面的實施例可以使本專業(yè)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實施例1梓醇的制備方法將100千克干地黃(y e力/z 朋"ia ^""/7osa "Zjosc/ .)加入平轉(zhuǎn)式連續(xù)逆流提取器的回 轉(zhuǎn)格中，加入10倍80%乙醇溶液，常溫滲漉，控制滲漉流速為20ml/min;將地黃的乙醇提取 液減壓濃縮至浸膏狀，按浸膏水(1: 2.5)的量用水分散，依次用5倍量石油醚、5倍量 乙酸乙酯萃取除去雜質(zhì)；水溶液相加到H103大孔吸附樹脂柱上，浸膏與干樹脂的比例為l: 25，充分吸附2小時后，用水洗至色淺，換成10%、 20%、 30%、 50%、 80%乙醇溶液各5000ml 梯度洗脫，收集80%乙醇餾分；將收集鎦分減壓濃縮并至浸膏狀，進行真空干燥；將干燥物 用甲醇-乙醇(2; 1)反復3次重結(jié)晶處理，得到純度為9鄉(xiāng)的該化合物白色粉末。HPLC條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-水(0.6: 99.4， v/v)為流動相， 檢測波長210nm;流速1.0ml/min;柱溫25。C。TLC條件硅膠G薄層板，以氯仿-甲醇-水(14; 8; 1)為展開劑，10%硫酸乙醇為顯色 劑，90'C加熱至斑點清晰，365nm紫外燈下觀察檢測。分子式為Cl5H220i()，分子量362. 45， mp206-208。C 。ESI-MS m/z: 360.9 (M-1) 、 190 (M-1-苷元)、181 (M-1-苷元-0H) 一。'H-NMR (MeOH_d3， 400MHz) SH(ppm): 3. 87， 4. 10('H each, d.H-10)， 5. Ol(U d, J=9. 7Hz， H-19)， 5.04('H, t.H-4),6.33('H， d. J=5.9Hz， H-3)。 13C-NMR(Me0H-d3, 100MHz) S c(ppm):碳PPm1，141.83，104.04，39.05，77.66，62.57，66. 18，43.59，61.610，95.2r99. 62'74.83，79.54，71.75，78.66，62.9實施例2梓醇對帕金森病細胞模型的作用1細胞形態(tài)學分析和免疫組織化學方法①小鼠中腦純神經(jīng)元培養(yǎng)無菌操作下取出胎齡14天的KM小鼠胚胎，分離出腹側(cè)中腦，然后在DMEM/F12中輕柔的 機械吹打以破碎組織。1500r離心機械分離后的細胞懸液10min,除去組織細胞碎片。棄上清 液，計數(shù)重懸后的細胞并接種到多聚賴氨酸(20Pg/ml)預(yù)包被的24孔培養(yǎng)板中，細胞接種密 度為5X107孔。本研究選用DMEM/F12外加10%滅活胎牛血清、100U/ml青霉素，100U/ml鏈 霉素作為細胞培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)48小時后，加入MP-阿拉伯糖呋喃糖苷(P -D-arabinofuranoside)以抑制膠質(zhì)細胞增殖。再過48小時，用新鮮的細胞培養(yǎng)液置換出舊的培養(yǎng)液。最初接種的第7天，細胞用于實驗。此時，純神經(jīng)元培養(yǎng)體系中神經(jīng)元》95%。②免疫細胞化學染色與細胞計數(shù)加藥處理后的細胞用以PBS為溶劑的4y。的多聚甲醛室溫下固定20分鐘，PBS洗3次，用 含W的過氧化氫的PBS處理20分鐘以消除內(nèi)源性過氧化氫酶；PBS洗3次，然后用固定劑固 定20分鐘，勿洗；加入用抗體稀釋液稀釋的一抗(TH 1/300) 4。C過夜或37'C孵育2小時； 然后用PBS震蕩漂洗10minX3，加入生物素化的二抗(TH羊抗大鼠抗體1:200) 37'C孵育1 小時，PBS震蕩漂洗10minX3;加入ABC試劑孵育30分鐘，PBS洗三次后用新鮮配置的0. 05 X的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色。適時終止反應(yīng)。光學顯微鏡下觀察、計數(shù)。細胞計數(shù)時，在 24孔培養(yǎng)板中每孔選取16個代表性區(qū)域，在100X放大倍數(shù)下計數(shù)。測量神經(jīng)突起長度時， 每孔選50個代表性神經(jīng)元，每個處理組有四孔。結(jié)果來自三次獨立的實驗，并表示為對照組 細胞數(shù)目(或平均突觸長度)的百分比。(D實驗結(jié)果-原代培養(yǎng)的中腦神經(jīng)元體系用不同濃度的(0.01-0. 5 mM)梓醇預(yù)處理30分鐘后，然后與 MPP+ (10 MM)共同作用48小時。從形態(tài)學分析，與對照組相比(圖2),MPP+不僅極大的降低了 TH-IR細胞的密度，而且神經(jīng)突觸的長度也受損縮短(圖3)。梓醇預(yù)處理30分鐘可以(圖4) 抑制.MPP+的作用，與MPP+處理組比較，TH-IR細胞的密度明顯提高，神經(jīng)突觸長度受損程度 變低。此實驗結(jié)果表明梓醇在帕金森病細胞模型上有效。實施例3梓醇對帕金森病動物模型的作用ICR小鼠灘性)，十周齡，隨機分為3組?？瞻讓φ战M、模型組和梓醇治療組。在開始的 l-7天，空白對照組和梓醇治療組小鼠腹腔注射生理鹽水；帕金森模型組小鼠注射MPTP(30 mg/kg)。在8-14天，梓醇治療組組小鼠腹腔注射梓醇(15mg/kg)，其它2組小鼠腹腔注射生理 鹽水。在末次注射藥物24小時后麻醉后開胸、灌注、取腦。.實驗結(jié)果如所示，注射生理鹽水的對照組ICR小鼠黑質(zhì)致密部(圖5)可見大量的TH-ir 陽性神經(jīng)元，排列成致密的網(wǎng)狀；與對照組相比，經(jīng)注射MPTP的小鼠黑質(zhì)致密部TH-ir陽性 神經(jīng)元明顯減少(圖6)，表明經(jīng)MPTP腹腔注射7天的ICR小鼠出現(xiàn)了PD特征。與MPTP組相 比，梓醇組小鼠黑質(zhì)致密部TH-ir陽性神經(jīng)元無明顯減少，表明一定劑量的梓醇對MPTP導致 的TH-ir陽性神經(jīng)元減少產(chǎn)生了拮抗作用(圖7)。動物實驗結(jié)果顯示，梓醇對帕金森模型鼠 有一定治療作用。實施例4梓醇對老年性癡呆細胞模型的作用1細胞形態(tài)學分析和免疫組織化學方法① 小鼠大腦皮層神經(jīng)元細胞培養(yǎng)無菌操作下取出胎齡15/16天的KM小鼠胚胎，分離出兩側(cè)大腦皮層，然后在DMEM/F12 中輕柔的機械吹打以破碎組織。lOOOr離心機械分離后的細胞懸液10min，除去組織細胞碎片。 棄上清液，計數(shù)重懸后的細胞并接種到多聚賴氨酸(2(mg/ml)預(yù)包被的24孔培養(yǎng)板中，細胞 接種密度為1X 10V孔。本研究選用DMEM/F12外加1(^滅活胎牛血清、100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素作為細胞培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)48小時后，加入io幽e-阿拉伯糖呋喃糖苷(e-D-arabinofuranoside)以抑制膠質(zhì)細胞增殖。再過48小時，用新鮮的細胞培養(yǎng)液置換出舊 的培養(yǎng)液。最初接種的第7天，細胞用于實驗。此時，純神經(jīng)元培養(yǎng)體系中大腦皮層神經(jīng)元 純度》95%。② 免疫細胞化學染色加藥處理后的細胞用以PBS為溶劑的4%的多聚甲醛室溫下固定30分鐘，PBS洗3次，用 含3l的過氧化氫的PBS處理30分鐘以消除內(nèi)源性過氧化氫酶；PBS洗3次，然后用封閉劑封 閉30分鐘，勿洗；加入用抗體稀釋液稀釋的一抗MAP-2 (1: 200) 4"C過夜或37。C孵育2小 時；然后用PBS震蕩漂洗10minX3，加入生物素化的羊抗兔二抗37t孵育1小時，PBS震蕩 漂洗10minX3;加入ABC試劑孵育30分鐘，PBS洗三次后用新鮮配置的0. 05%的二氨基聯(lián) 苯胺(DAB)染色。適時終止反應(yīng)['5]。光學顯微鏡下觀察、計數(shù)。③ 實驗結(jié)果大腦皮層神經(jīng)-膠質(zhì)細胞體外培養(yǎng)7天用于實驗。先用梓醇500MM預(yù)處理神經(jīng)細胞30分 鐘，后用Ae^5剛共同作用72小時。藥物處理完畢后，用抗MAP-2抗體對大腦皮層神經(jīng)元 細胞進行免疫組化染色，與對照組相比(圖7)，經(jīng)5MM AP,-42作用72小時后，MAP-2-陽性皮 層神經(jīng)元數(shù)目大大減少，其相應(yīng)的樹突也呈現(xiàn)明顯的回縮、變短現(xiàn)象，由神經(jīng)突觸交錯形成 的完整的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞(圖8)。經(jīng)500幽梓醇與處理后，受損的皮層神經(jīng)元有所恢 復，MAP-2-陽性皮層神經(jīng)元數(shù)目有所增加，而且回縮、彎曲變短的退化的樹突也明顯伸長， 逐漸重新形成交錯連接的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。至少從形態(tài)學意義上說明梓醇保護了 Ae,H2直接損 傷的床層神經(jīng)元(圖9)。此實驗結(jié)果表明梓醇在老年癡呆細胞模型上有效。實施例5梓醇與水組合物的制備-取梓醇100nig加入1000ml注射用水，攪拌使溶解，用3號垂熔玻璃濾器濾過，再通過 0.6Pm微孔濾膜，分裝入安瓿瓶中，每支2ml，滅菌，即得。實施例6梓醇與淀粉組合物的制備-取梓醇10g與淀粉990g混合，攪拌均勻，在濕法混合顆粒機上制成顆粒，于60'C熱風 干燥至水分為4%左右，裝膠囊，每粒0.25g,即得。實施例7梓醇與左旋多巴組合物的制備取梓醇10g、左旋多巴140g與淀粉850g混合，攪拌均勻，在濕法混合顆粒機上制成顆 粒，于6(TC熱風干燥至水分為4《左右，裝膠囊，每粒0.25g，即得。實施例8梓醇與左旋多巴和硝替卡朋組合物的制備取梓醇2g、左旋多巴10g、硝替卡朋8g與淀粉980g混合，攪拌均勻，在濕法混合顆粒 機上制成顆粒，于6(TC熱風干燥至水分為4。/。左右，裝入PE袋中，封口，每袋5g，即得。實施例9梓醇與苯海索和苯扎托品組合物的制備取梓醇10g、苯海索15g、苯扎托品25g與淀粉950g混合，攪拌均勻，在濕法混合顆粒 機上制成顆粒，于60匸熱風干燥至水分為4%左右，壓制成片，每片0.3g，包薄膜衣，即得。實施例10梓醇與他克林組合物的制備取梓醇50mg和他克林20 mg，加入1000ml注射用水，攪拌使溶解，用3號垂熔玻璃濾 器濾過，再通過0.6wm微孔濾膜，分裝入安瓿瓶中，每支2ml，滅菌，即得。
權(quán)利要求
1、梓醇的結(jié)構(gòu)通式(I)如下其中R1為單糖，R3，R4，R5，R8為氫，R6為OH，R7為-OCH2OH。
2 、制備權(quán)利要求1所述的梓醇的新方法，該方法包括以下步驟a將地黃的新鮮或干燥塊根放置于平轉(zhuǎn)式連續(xù)逆流提取裝置中在乙醇溶液中浸泡并滲漉； b將地黃的乙醇提取液濃縮后用水分散，依次用石油醚，乙酸乙酯萃取除去雜質(zhì)； c將b中水溶液相用H103大孔吸附樹脂柱層析，用水洗至色淺，換成10%、 20%、 30%、 50%、 80%乙醇溶液梯度洗脫，收集80%乙醇餾分； d將c中收集餾分減壓濃縮并干燥；f將d中的干燥物用甲醇-乙醇反復多次重結(jié)晶處理，得到純度為99%的該化合物。
3、 按照權(quán)利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物與水按質(zhì)量百分比1: 1000000 至1: 4的組合物。
4、 按照權(quán)利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物與植物油按質(zhì)量百分1: 1000000至l: 5的組合物。
5、 按照權(quán)利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物與淀粉或/和蔗糖按質(zhì)量百 分l: 10000至100: l的組合物。
6、 按照權(quán)利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物化合物與左旋多巴或/和卡 比多巴或/和司米吉蘭或/和硝替卡朋按質(zhì)量百分h 10000至10000: l的組合物。
7、 按照權(quán)利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物與苯海索或/和丙環(huán)定或/和 苯扎托品按質(zhì)量百分1: 10000至10000: 1的組合物。
8、 按照權(quán)利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物與金剛烷胺或/和溴隱亭或/ 和培高利特按質(zhì)量百分1: 10000至10000: 1的組合物。
9、 按照權(quán)利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物化合物與他克林或/和哈伯 因或/和美曲膦酯或/和加蘭他敏按質(zhì)量百分l: 10000至10000: l的組合物b
10、 按照權(quán)利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物化合物與占諾美林或/和Sabcomedine hydrochloride按質(zhì)量百分1: 10000至10000: 1的組合物。
11、 按照權(quán)利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物化合物與AIT082或/和鹽 酸乙酰L肉堿或/和丙戊茶堿按質(zhì)量百分1: 10000至10000: 1的組合物:。
12、 按照權(quán)利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物用作制備抗帕金森病和老 年性癡呆病藥物的用途。
13、 按照權(quán)利要求3-ll其中之一所述的梓醇，其特征在于，所述的組合物用作制備抗帕 金森病和老年性癡呆病藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及通式(I)的梓醇的制備新方法，其中R₁為單糖，R₃，R₄，R₅，R₈為氫，R₆為OH，R₇為-OCH₂OH。本發(fā)明還涉及該化合物和含它的藥物組合物在預(yù)防和治療老年性癡呆病和帕金森病方面的應(yīng)用。本發(fā)明為研究開發(fā)新的抗老年性癡呆和帕金森病藥物提供了該化合物新的制備方法和含它的藥物組合物，有利于進一步開發(fā)天然藥物資源。
文檔編號C07H17/04GK101220063SQ20071015933
公開日2008年7月16日 申請日期2007年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月29日
發(fā)明者包永明, 波 姜, 濤 姜, 安利佳, 靜 畢, 趙榮國 申請人:大連理工大學