專利名稱：用于長期造血種群恢復(fù)的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
當(dāng)前公開的主題在一些實施方案中涉及用于在受試者中種群恢復(fù)細(xì)胞類型的方法。在一些實施方案中，當(dāng)前公開的主題涉及給有需要的受試者以一定的量及通過一定的途徑施與包含多個分離的臍帶血衍生的⑶133+/GlyA_/⑶45_干細(xì)胞的組合物，所述量和途徑足以允許用于在受試者中種群恢復(fù)細(xì)胞類型的臍帶血衍生的至少一部分移入受試者的靶部位并在其中分化，由此在受試者中種群恢復(fù)細(xì)胞類型。背景
血液移植術(shù)的發(fā)展增加了對分離自組織可相容供體的造血干細(xì)胞(HSC)的需求。公知合適的骨髓(BM)供體通常是短缺的。不幸的是，臍帶血(CB)含有的HSC絕對數(shù)量比BM低得多，使得CB在成人患者的治療用途中不那么優(yōu)選。此外，當(dāng)前極難以可靠地擴(kuò)增分離自 BM和CB-HSC的長期種群恢復(fù)(LT)的HSC，使得加重了對新的LT-HSC供應(yīng)的需求。因此，假設(shè)胚胎干細(xì)胞衍生的HSC可能比分離自諸如BM和CB的常規(guī)來源的HSC 具有許多優(yōu)勢。然而，這已被證明難以應(yīng)用，因為難以應(yīng)用和優(yōu)化使胚胎干細(xì)胞(ESC)沿著造血譜系分化的策略。此外，人類ESC是各種限制的對象，這限制了它們的可利用性和有用性，即使對于實驗研究也如此。發(fā)明概述
本概述列出了當(dāng)前公開的主題的數(shù)個實施方案，以及在許多情況下列出了這些實施方案的變形和互換。這一概述僅是許多且不同的實施方案的示例。給定實施方案的一個或更多個代表性特征的提及同樣是示例性的。此類實施方案可在有或無該提及的特征的情況下一般地存在；同樣地，這些特征可應(yīng)用于當(dāng)前公開的主題的其他實施方案，而無論在這一概述中列出與否。為避免過多的重復(fù)，這一概述沒有列出或提示此類特征的所有可能組合。當(dāng)前公開的主題提供了分離臍帶血細(xì)胞的⑶133+/⑶45_/GlyA_亞群的方法。在一些實施方案中，該方法包括(a)提供臍帶血細(xì)胞的初始群；(b)使該初始細(xì)胞群與對CD133 特異的第一抗體、對CD45特異的第二抗體以及對血型糖蛋白A(GlyA)特異的第三抗體，在足以允許每一抗體與初始細(xì)胞群每一細(xì)胞上的其靶標(biāo)(如果存在的話)結(jié)合的條件下接觸；以及(c)分離⑶133+、⑶45_且617々_的細(xì)胞亞群。在一些實施方案中，該接觸步驟包括使臍帶血細(xì)胞與特異性結(jié)合⑶133、GlyA和⑶45的多個抗體同時地或反復(fù)地接觸。在一些實施方案中，該方法還包括從⑶133+/GlyA_/⑶45_細(xì)胞中分離ALDHs細(xì)胞，從⑶133+/GlyA_/ CD45_細(xì)胞中分離ALDHte細(xì)胞，或分別從CD133+/GlyA_/CD45_細(xì)胞中分離ALDHs細(xì)胞和ALDH 細(xì)胞。當(dāng)前公開的主題還提供了包含基本上純化的分離自臍帶血(CB)的⑶133+/GlyA_/ ⑶45_細(xì)胞的分離的干細(xì)胞群。在一些實施方案中，該⑶133+/GlyA_/⑶45_細(xì)胞是々0)!^細(xì)胞。在一些實施方案中，該⑶133+/GlyA_/⑶45_細(xì)胞是ALDHte細(xì)胞。當(dāng)前公開的主題還提供了包含當(dāng)前公開的分離的干細(xì)胞群的組合物。在一些實施方案中，該組合物還包含一種或更多種可藥用載體和/或賦形劑。在一些實施方案中，該可藥用載體和/或賦形劑對于在人類中的應(yīng)用是可藥用的。當(dāng)前公開的主題還提供了用于在受試者中種群恢復(fù)細(xì)胞類型的方法。在一些實施方案中，該方法包括以一定的量和通過一定的途徑給受試者施與在可藥用載體中包含多個分離的⑶133+/GlyA_/⑶45_干細(xì)胞的組合物，所述量和途徑足以允許⑶133+/GlyA_/ CD45—干細(xì)胞的至少一部分移入靶部位并在其中分化，由此在受試者中種群恢復(fù)細(xì)胞類型。 在一些實施方案中，該細(xì)胞類型是造血細(xì)胞。在一些實施方案中，該靶部位包括骨髓。在一些實施方案中，受試者是哺乳動物。在一些實施方案中，哺乳動物是人。在一些實施方案中，該多個分離的CD1337GlyA7CD45_干細(xì)胞包含分離自臍帶血的CD1337GlyA7CD45_干細(xì)胞。在一些實施方案中，該可藥用載體對于對于在人類中的應(yīng)用是可藥用的。當(dāng)前公開的主題還提供了用于骨髓移植的方法。在一些實施方案中，該方法包括給至少部分地缺乏骨髓的受試者施與包含有效量的分離自臍帶血的⑶133+/GlyA_/⑶45_干細(xì)胞的藥物制備物，其中該有效量包含分離的⑶133+/GlyA_/⑶45_干細(xì)胞足以移入受試者骨髓的量。在一些實施方案中，該至少部分地缺乏骨髓的受試者經(jīng)歷了至少部分地減少該受試者骨髓的預(yù)治療。在一些實施方案中，該預(yù)治療包括脊髓減少或脊髓抑制治療。在一些實施方案中，該預(yù)治療包括給該受試者施與免疫治療、化療、放射治療或其組合。在一些實施方案中，放射治療包括全身放射。在一些實施方案中，該施與包括靜脈內(nèi)施與該藥物制備物。在一些實施方案中，該CD133+/GlyA_/CD45_干細(xì)胞是CD133+/GlyA7CD457ALDH髙干細(xì)胞。在一些實施方案中，該方法還包括在施與步驟前在0P9細(xì)胞飼養(yǎng)層的存在下共培養(yǎng) CD133+/GlyA7CD45-干細(xì)胞至少 5 天。當(dāng)前公開的主題還提供了用于誘導(dǎo)⑶133+/GlyA_/⑶45_干細(xì)胞的造血能力的方法。在一些實施方案中，該方法包括(a)提供⑶133+/GlyA_/⑶45_干細(xì)胞；和(b)在0P9飼養(yǎng)層的存在下共培養(yǎng)⑶133+/GlyA7⑶45—干細(xì)胞足以誘導(dǎo)該⑶133+/GlyA7⑶45—干細(xì)胞的造血能力的時間。在一些實施方案中，該⑶133+/GlyA7⑶45—干細(xì)胞是骨髓衍生的⑶133+/ GlyA7⑶45—干細(xì)胞、臍帶血衍生的⑶133+/GlyA7⑶45—干細(xì)胞、或其組合。在一些實施方案中，該CD133+/GlyA7CD45-干細(xì)胞是0)1337617六-/^045-/^0)!1低干細(xì)胞。在一些實施方案中，該CD133+/GlyA7CD45-干細(xì)胞是CD133+/GlyA7CD457ALDH高干細(xì)胞。在一些實施方案中，該造血能力包括當(dāng)將該⑶133+/GlyA_/⑶45_干細(xì)胞施與受試者時將骨髓移入受試者的能力。在一些實施方案中，該造血能力包括在受試者中提供骨髓長期移入的能力。在一些實施方案中，足以誘導(dǎo)造血能力的時間包括共培養(yǎng)至少5天。在一些實施方案中，當(dāng)前公開的方法進(jìn)一步包括從人臍帶血分離⑶133+/GlyA_/⑶45_干細(xì)胞。當(dāng)前公開的主題還提供了包含⑶133+/GlyA_/⑶45_干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。在一些實施方案中，該細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)還包含0P9細(xì)胞飼養(yǎng)層。在一些實施方案中，⑶133+/GlyA_/ CD45-干細(xì)胞是人臍帶血CD133+/GlyA7CD45-干細(xì)胞、人骨髓CD133+/GlyA7CD45-干細(xì)胞或其組合。在一些實施方案中，CD133+/GlyA7CD45-干細(xì)胞是0)1337617470)45-/^0)!^干細(xì)胞。因此，當(dāng)前公開的主題的一個目的是提供用于分離臍帶血細(xì)胞⑶1337⑶457 GlyA-亞群的方法。上文已指出了當(dāng)前公開的主題的一個目標(biāo)，并且其全部或部分由當(dāng)前公開的主題實現(xiàn)，當(dāng)聯(lián)系作為后文中最佳描述的附圖時，其他目標(biāo)也會隨著描述的進(jìn)行而變得明顯。附圖簡述
圖IA和IB是分別是通過應(yīng)用磁性細(xì)胞分選(MACS)以及隨后的熒光激活細(xì)胞分選 (FACS)分離的聯(lián)合策略分離ALDHte和ALDHsCB_VSEL的示意方法，以及基于ALDH活性的 FACS分離CB-VSEL亞群的代表性選通策略。圖2是體外擴(kuò)增ALDHte和ALDHsCB_VSEL亞群的技術(shù)的示意圖。將新鮮分離的細(xì)胞亞群培養(yǎng)在甲基纖維素克隆形成測試中(頂圖)，或在0P9細(xì)胞飼養(yǎng)層上擴(kuò)增5天(底圖)并隨后在甲基纖維素克隆測試中測試克隆形成祖細(xì)胞的數(shù)量。二圖3是柱狀圖，其顯示了在來自CB-VSEL的ALDHte和ALDHs亞群的克隆形成培養(yǎng)物中獲得的造血集落(CFU)總數(shù)。計算每一群的每1 χ IO3個分選細(xì)胞的集落數(shù)量。展示的值是平均值士 SEM; *: /7 < 0.05 ；N = 5。圖4是由與0P9細(xì)胞共培養(yǎng)的CD133+/GlyA7CD45- CB-VSEL的ALDH低和ALDH髙亞群形成的“鵝卵石”區(qū)域的兩張顯微照片的組。兩張顯微照片都是亮視野圖。每一顯微照片左下角的線條表示10 Um0顯示了紡錘樣形狀的0P9細(xì)胞在培養(yǎng)板中形成飼養(yǎng)層。圖5是來自在0P9飼養(yǎng)細(xì)胞上擴(kuò)增的CD133+/GlyA7CD45- CB-VSEL的ALDH低和 ALDHs亞群的克隆形成甲基纖維素測試中獲得的集落的兩張顯微照片的組。兩張照片均展示亮視野圖。每一顯微照片左下角的線條表示10 μπι。圖6Α和6Β分別是柱狀圖和顯微照片，其顯示了從由ALDHffi和ALDHsCB_VSEL開始的克隆形成培養(yǎng)物獲得的細(xì)胞的CD45表達(dá)。二圖6A顯示了通過流式細(xì)胞術(shù)分析的從由ALDHffi和ALDHSCB_VSEL開始的克隆形成培養(yǎng)物獲得的細(xì)胞的CD45抗原表達(dá)。圖6B顯示了下述細(xì)胞的代表性圖片所述細(xì)胞從克隆形成培養(yǎng)物中的ALDHte CB-VSEL獲得，并隨后再鋪板至單細(xì)胞培養(yǎng)物，針對CD45染色 (TRITC)，并通過表面熒光顯微鏡術(shù)分析。左圖和右圖的比較顯示了左圖中由黑色箭頭指示的〇045_細(xì)胞，以及在右圖中由白色箭頭指示的幾個CD45+細(xì)胞。左圖中顯示的比例線條表示10 μ m，并且該比例尺對兩個圖是相同的。圖7是針對血型糖蛋白A(上圖)或⑶45 (下圖)染色的衍生自⑶133+/GlyA_/ CD457ALDHffi* CD133+/GlyA7CD457ALDH髙CB-VSEL的集落的一系列代表性表面熒光圖片。 以相同的放大倍數(shù)顯示所有圖片，以及比例線條表示10 μπι。 ^圖8Α和8Β是柱狀圖，其顯示了 CB-VSEL的ALDHte和ALDHs級份中與多能性狀態(tài)和造血定型相關(guān)的基因的表達(dá)。圖8Α顯示了緊接著分離后CB-VSEL的ALDHte和ALDHs級份中與多能性狀態(tài)和造血定型相關(guān)的基因的表達(dá)L以及圖8Β顯示了與0Ρ9細(xì)胞共培養(yǎng)及隨后的克隆形成培養(yǎng)后 CB-VSEL的ALDHte和ALDHs級份中與多能性狀態(tài)和造血定型相關(guān)的基因的表達(dá)。Y軸上的倍差數(shù)表示平均值(平均值士 SEM)。與總具核細(xì)胞(TNC)相比/7 < 0.05。
圖9A是柱狀圖，其顯示了可從TNC (裂解RBC后分離)和單核細(xì)胞(MNC ； Ficoll-Paque分離后)級份中分離的CB-VSEL和HSC的絕對數(shù)量。以每1 ml經(jīng)處理的CB 表達(dá)數(shù)據(jù)。圖9B是柱狀圖，其顯示了與HSC相比的CB-VSEL的大小和細(xì)胞核比細(xì)胞質(zhì)之比 (N/C 比)。數(shù)值表示平均值士 SEM. *: /7 < 0. 05 ;N = 5。圖 IOA 和 IB 是柱狀圖，其顯示了 CB 衍生的 CD457CD133+/ALDH高和 CD457CD133+/ ALDH VSEL在移植至經(jīng)致死放射的N0D/SCID小鼠后體內(nèi)測試的造血潛能，在移植4_6周后測試。圖 IOA 是柱狀圖，其顯示了 CB 衍生的 CD457CD133+/ALDH髙和 CD457CD133+/ALDH低 VSEL對移植小鼠的周圍血(PB)、脾(SP)和骨髓(BM)中的造血細(xì)胞的貢獻(xiàn)。從鼠PB、BM和 SP中CB衍生的VSEL亞群衍生得到的人造血⑶45+水平在兩個移植CB-VSEL級份之間是相當(dāng)?shù)?.1 士 2. 9% (PB) ,23. 2 士 0. 2% (SP)和 25. 2 士 1.0% (BM)。圖IOB是柱狀圖，其顯示了在N0D/SCID小鼠周圍血中造血譜系重建的程度。⑶3 是T細(xì)胞標(biāo)記物，⑶19是B細(xì)胞標(biāo)記物(盡管其還在濾泡樹突狀細(xì)胞上表達(dá))、⑶66b是粒細(xì)胞標(biāo)記物，以及GlyA是紅細(xì)胞譜系標(biāo)記物。

圖11是上胚層衍生的胚胎干細(xì)胞在成人組織中發(fā)育沉積(developmental deposition)的可能機(jī)制的示意圖。VSEL在胎肝、BM和其他組織中的存在可由CXCR4+上胚層衍生的VSEL隨SDF-I梯度的發(fā)育沉積來解釋。胎肝可作為這些細(xì)胞遷移途徑的重要交
點(diǎn)ο圖12顯示了 FL中各群體含量的流式細(xì)胞分析結(jié)果，顯示了分析VSEL含量 (50&-1+/1^1170)45_細(xì)胞)的選通策略。圖13A和1 是柱狀圖，其分別顯示了多能干細(xì)胞和組織定型干細(xì)胞的標(biāo)記物表達(dá)，以及胎肝細(xì)胞在各個發(fā)育階段的VSEL含量和VSEL-DS形成能力。Sca-rLirTCD45- FL 衍生的細(xì)胞表達(dá)PSC的幾種標(biāo)記物，并且在與C2C12肌原細(xì)胞共培養(yǎng)時長成球形。數(shù)值表示從三個獨(dú)立實驗獲得的平均值(平均值士SEM)。在每一實驗中合并了來自15-20個胚胎的胎肝。圖13A是柱狀圖，其顯示了與胎肝細(xì)胞單核細(xì)胞相比較時，分選的ka-r/LirT/ CD45_ FL衍生的細(xì)胞級份中表征多能干細(xì)胞(PSC)和組織定型干細(xì)胞(TCSC)的幾個基因的mRNA的表達(dá)分析。在受精后不同的時間點(diǎn)進(jìn)行分析。圖1 是柱狀圖，其顯示了 Sca-r/LirT/⑶45_ FL-衍生的細(xì)胞百分比含量與從分選的ka-l7Lin7CD45-體外培養(yǎng)的VSEL衍生的球體(VSEL-DS)絕對數(shù)量的關(guān)于總FL細(xì)胞的關(guān)系。圖14是FL衍生的VSEL含量和形態(tài)的一系列IMAGESTREAM System (ISS)分析。 用Sca-I特異的抗體(與FITC綴合)、Lin標(biāo)記物特異的抗體(每一個與PE綴合)、以及 CD45特異的抗體(與PE-Cy5 綴合)染色FL衍生的細(xì)胞，用多聚甲醛溶液固定，用 TRITON X (0. 01%)透化，并通過ISS分析。圖14顯示了在15. 5 dpc的FL中基于它們的大小和抗原性模式鑒定ka-r/Lin7⑶45_細(xì)胞。左上圖根據(jù)它們的形態(tài)學(xué)參數(shù)顯示了所有經(jīng)分析的對象，所述參數(shù)包括在亮視野中的細(xì)胞核面積和長寬比。基于亮視野細(xì)胞圖，作為細(xì)胞短軸(寬)對長軸(高)之比計算長寬比(圓的，非伸長的細(xì)胞擁有接近1.0的長寬比，而伸長的細(xì)胞或團(tuán)塊具有更低的長寬比)。使具有DNA內(nèi)容物的圓的單細(xì)胞包括在區(qū)Rl中，并進(jìn)一步分析⑶45表達(dá)。對來自區(qū)R2的⑶45_細(xì)胞分析Lin標(biāo)記物表達(dá)，并將 LirT/⑶45_細(xì)胞封入?yún)^(qū)R3中。然后基于表達(dá)顯現(xiàn)來自這一區(qū)域的細(xì)胞，并使ka-1+/ Lin7⑶包括在區(qū)R4中。圖15是兩張照片，其概述了胎肝中&a-l7Lin7CD45_細(xì)胞(黑菱形)和Oct-4+/ ka-l+/Lin7CD45- VSEL (灰圓圈；左圖)以及 ka-l+/Lin7CD45+ HSC (右圖)在 dpc 12. 5、15. 5和17. 5天絕對數(shù)量的改變。發(fā)明詳述
當(dāng)移植至合適的受體時，原始LT-HSC可保持長期的造血作用。盡管已經(jīng)實驗地證實了這些細(xì)胞的存在，但此類細(xì)胞的表型以及因此的特定分離仍然是有爭議的。越來越多的證據(jù)表明BM含有多能(P) SC群，其可產(chǎn)生LT-HSC (Kucia等，Q006) Leukemia 20 857-869)。最近，在分析鼠BM期間，發(fā)現(xiàn)了稀有(BM單核細(xì)胞(MNC) 的-0.01%)且極小(約2-4 ym)的Sca-l+/lin7⑶45—細(xì)胞同質(zhì)群，所述細(xì)胞表達(dá)PSC標(biāo)記物諸如SSEA-I、0ct-4、Nanog和Rex-I，以及高表達(dá)Rif-I端粒酶蛋白(Kucia等，Q006) Leukemia 20:857-869)。直接電子顯微鏡分析揭示這些細(xì)胞表現(xiàn)出初級上胚層衍生的ESC 典型的幾種特征，諸如由一窄環(huán)細(xì)胞質(zhì)包圍的大細(xì)胞核，以及開放型染色質(zhì)(常染色質(zhì))。 在與C2C12鼠肉瘤支持飼養(yǎng)層共培養(yǎng)時，這些細(xì)胞長成由具有含常染色質(zhì)的大細(xì)胞核的未成熟CXCR47SSEA-l70ct-4+細(xì)胞組成的球體。當(dāng)鋪板至促進(jìn)組織分化的培養(yǎng)物時，這些細(xì)胞顯示出多能性并擴(kuò)增為來自所有三個胚細(xì)胞層的細(xì)胞?；谶@點(diǎn)，將這些細(xì)胞稱為極小胚胎樣(VSEL) SC (也參見PCT國際專利申請公開WO 2007/067280和2009/059032號)。本文公開的是集中在這些細(xì)胞的造血分化上的研究。據(jù)信VSEL可能是BM中最原始的PSC群，以及它們能夠沿著造血譜系分化并產(chǎn)生LT-HSC。如本文所提出的那樣，從BM 中新鮮分離的VSEL不擁有即刻的造血活性；它們不會長成造血集落，也不能輻射防護(hù)經(jīng)致死輻射的受體。然而，若將⑶45— VSEL鋪在支持0P9細(xì)胞系上，它們產(chǎn)生⑶45+/⑶41+/Grl7 TerllQ+細(xì)胞集落。這些細(xì)胞的表型類似于從建立的胚胎細(xì)胞系體外衍生的最早造血細(xì)胞的那些。VSEL的這一造血分化伴隨著幾種調(diào)節(jié)造血作用的基因(例如，PU-l、c-myb、LM02 和Uaros)mRNA的上調(diào)。更重要的是，當(dāng)移植至野生型(WT)動物時，⑶45+/⑶4l7Gr-l_/ Terlir細(xì)胞擴(kuò)增自從GFP+小鼠分離的VSEL。這些保護(hù)WT免受致死輻射，并在體內(nèi)分化為所有主要的造血譜系(例如，Gr-1+、B220+和⑶3+細(xì)胞)。在移植至第二受體后，這一造血活性得以保持?；谶@點(diǎn)，似乎VSEL是能產(chǎn)生LT-HSC的PSC，并且⑶45+細(xì)胞可衍生自 CD45-群。I.定義
盡管相信以下術(shù)語對本領(lǐng)域技術(shù)人員人員而言能很好的理解，但提出了以下的定義以幫助當(dāng)前公開的主題的解釋。除非下面另外定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語，意圖具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解的相同的含義。本文所用的技術(shù)參考文獻(xiàn)意圖指本領(lǐng)域通常理解的技術(shù)，包括對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的那些技術(shù)的變體或等效技術(shù)的替換。盡管相信以下術(shù)語對本領(lǐng)域技術(shù)人員人員而言能很好的理解，但提出了以下的定義以幫助當(dāng)前公開的主題的解釋。
根據(jù)長期存在的專利法慣例，術(shù)語“一”、“一個”及“該(這)”用在這個申請(包括權(quán)利要求書)中時是指“一個或更多個”。例如，短語“一個細(xì)胞”指的是一個或更多個細(xì)胞，包括但不限于多個相同的細(xì)胞類型或多個不同的細(xì)胞類型。類似地，當(dāng)在本文中用于指示實體時，短語“至少一個”例如是指 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、 75、100或更多個該實體，包括但不限于1至100以及超過100的整數(shù)值。除非以其他方式指出，在說明書和權(quán)利要求中使用的表達(dá)組分量、反應(yīng)條件等的所有數(shù)值均理解為在所有情況下均由術(shù)語“約”修飾。當(dāng)提及可測量值諸如質(zhì)量、重量、時間、體積、濃度或百分比的量時，本文使用的術(shù)語“約”意味著包括在某些實施方案中從該特定量士 20%、在某些實施方案中士 10%、在某些實施方案中士 5%、在某些實施方案中士 1%、在某些實施方案中士0. 5%以及在某些實施方案中士0. 1%的變化量，因為此類變化量適于實現(xiàn)本發(fā)明的方法。因此，除非相反的指出，否則在這一說明書和所附權(quán)利要求中提出的數(shù)值參數(shù)是可根據(jù)尋求由當(dāng)前公開的主題獲得的期望性質(zhì)而不同的近似值。當(dāng)在一列實體的上下文中使用時，本文所使用的術(shù)語“和/或”是指單個或組合存在的實體。因此，例如，短語“A、B、C和/或D”包括單個的A、B、C和D，但還包括A、B、C和 D的任意和所有組合。術(shù)語“包括”與“包含”、“含有”、“其特征在于”同義，為包括在內(nèi)的或開放式的，并且不排除其他的、未列出的元件和/或方法步驟。“包括”是領(lǐng)域術(shù)語，其意味著存在所列舉的元件和/或步驟，但可添加其他元件和/或步驟，并且仍然落入相關(guān)主題的范圍之內(nèi)。本文所使用的短語“由……組成”排除沒有具體列出的任何元件、步驟或組分。例如，當(dāng)在權(quán)利要求文本中的分句中出現(xiàn)，而非緊接前序部分時，短語“由……組成”僅限于該分句中闡述的元件；其他元件不從作為一個整體的該權(quán)利要求中排除。本文所使用的短語“基本上由……組成”將相關(guān)公開內(nèi)容或權(quán)利要求的范圍限制在具體指定的材料和/或步驟，加上不會實質(zhì)上地影響該公開的和/或要求保護(hù)的主題基礎(chǔ)和新穎特征的那些。例如，藥物組合物“可基本上由”藥物活性劑或多個藥物活性劑“組成”，其意味著所列出的藥物活性劑是在該藥物組合物中存在的唯一的藥物活性劑。然而， 應(yīng)當(dāng)注意，載體、賦形劑和其他非活性劑可以并很可能存在于該藥物組合物中。就術(shù)語“包含”、“基本上由……組成”和“由……組成”而言，當(dāng)在本文中使用這三個術(shù)語之一時，當(dāng)前公開的和要求保護(hù)的主題可包括使用其他兩個術(shù)語的任一個。例如，當(dāng)前公開主題在一些實施方案中涉及包含⑶133+/GlyA_/⑶45_細(xì)胞的組合物。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)前公開的主題因此還包括在一些實施方案方案中基本上由⑶133+/GlyA7⑶45—細(xì)胞組成的組合物，以及在一些實施方案中由⑶133+/GlyA_/⑶45_細(xì)胞組成的組合物。類似地，也應(yīng)當(dāng)理解，在一些實施方案中，當(dāng)前公開的主題的方法包括本文公開的和/或權(quán)利要求中敘述的步驟，在一些實施方案中，當(dāng)前公開的主題的方法基本上由本文公開的和/或權(quán)利要求中敘述的步驟組成，以及在一些實施方案中，當(dāng)前公開的主題的方法由本文公開的和/或權(quán)利要求中敘述的步驟組成。當(dāng)在骨髓移植的上下文中使用時，本文所使用的短語“長期”是指一段時間，在這段時間中供體細(xì)胞或從其中衍生的后代細(xì)胞保持在供體中的活力和功能。當(dāng)衍生自供體細(xì)胞的造血細(xì)胞施與后在一些實施方案中在受體中存在至少3個月、在一些實施方案中6個月、在一些實施方案中9個月、在一些實施方案中12個月以及在一些實施方案中超過12個月時，認(rèn)為骨髓移植產(chǎn)生了長期的移植。II.分離臍帶血細(xì)胞亞群的方法
在一些實施方案中，當(dāng)前公開的主題提供了用于分離臍帶血(CB)細(xì)胞的CD133+/ ⑶45_/GlyA_亞群的方法。在一些實施方案中，該方法包括(a)提供初始臍帶血細(xì)胞群；(b) 使所述初始細(xì)胞群與對CD133特異的第一配體(例如抗體)、對CD45特異的第二配體(例如抗體)以及對血型糖蛋白A(GlyA)特異的第三配體(例如抗體)在足以允許每個抗體與其在初始細(xì)胞群的每個細(xì)胞上的靶標(biāo)(如果存在)結(jié)合的條件下接觸；(c)選擇CD133+、 CD45-且GlyA-的細(xì)胞。因此，在一些實施方案中，當(dāng)前公開的主題提供了從CB細(xì)胞群分離⑶45—干細(xì)胞亞群的方法。在一些實施方式中，該方法包括(a)提供懷疑包含〔045_干細(xì)胞的CB細(xì)胞群；(b)將所述CB細(xì)胞群與對CD45特異的第一抗體，對CD133特異的第二抗體接觸，接觸條件足以允許每個抗體與其在細(xì)胞群的每個細(xì)胞上的靶標(biāo)(如果存在)結(jié)合；(c)選擇為 ⑶133+、并且⑶45—的CB細(xì)胞的第一亞群；(d)將所述CB細(xì)胞的第一亞群與對于一個或更多個細(xì)胞表面標(biāo)記物特異的一個或更多個抗體在足以允許每個抗體與其在CB細(xì)胞群的每個細(xì)胞上的靶標(biāo)(如果存在)結(jié)合的條件下接觸，所述標(biāo)記物選自包括而不限于CD45R/B220、 Gr-I、TCRa β ,TCRy δ、CDlIb及Ter-119的組；(e)從所述CB細(xì)胞的第一亞群去除結(jié)合到步驟(d)的抗體的至少一個的那些細(xì)胞；以及(f)收集為⑶133+/⑶45_/GlyAl々CB細(xì)胞的第二亞群，由此分離⑶45_干細(xì)胞的亞群。本文所使用的術(shù)語“CD45”是指酪氨酸磷酸酶，也稱為白細(xì)胞共同抗原(LCA)，并具有基因記號PTPRC。這一基因相應(yīng)于GENBANK 登記號(人類)、NP_035340 (小鼠)、NP_612516 (大鼠)、XP_0(^^9 (狗)、XP_599431 (牛)及 AAR16420 (豬)。另外的 CD45 同源物的氨基酸序列也存在于GENBANK 數(shù)據(jù)庫中，包括那些來自幾種魚類和幾種非人類靈長類的那些。本文所使用的術(shù)語“⑶34”指的是存在于一些造血和非造血干細(xì)胞上的細(xì)胞表面標(biāo)記物，并具有基因記號⑶34。GENBANK 數(shù)據(jù)庫披露了來自人類(例如，AAB25223)、小鼠 (NP_598415)、大鼠(XP_223083)、貓(ΝΡ_001009318)、豬(MP_999251)、牛(NP_776434)及其它的CD34的氨基酸和核酸序列。在小鼠中，一些干細(xì)胞還表達(dá)干細(xì)胞抗原ka-1 (GENBANK 登記號ΝΡ_0!34868)，也稱為淋巴細(xì)胞抗原Ly-6A.2。本文所使用的術(shù)語“⑶133”是指存在于一些造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)干細(xì)胞以及一些其他細(xì)胞類型上的細(xì)胞表面標(biāo)記物。其還稱為 Prominin 1 (PROMl)。GENBANK 數(shù)據(jù)庫披露了來自人類(例如，NM_006017 和 NP_006008)、 小鼠(匪_0089；35 和 NP_032961)、大鼠(NM_021751 和 NP_068519)和其他的 CD133 核酸及
氨基酸序列。本文所使用的術(shù)語“GlyA”是指血型糖蛋白A，其為存在于紅細(xì)胞上的細(xì)胞表面分子。GENBANK 數(shù)據(jù)庫披露了來自人類(例如，NM_002099和NP_002090)、小鼠(NM_010369 和NP_034499)和其他的GlyA核酸和氨基酸序列。因此，⑶45-干細(xì)胞的亞群表示存在于分離步驟前的細(xì)胞群中的⑶45_細(xì)胞的亞群。在一些實施方式中，⑶45-干細(xì)胞的亞群來自人類，并且是⑶34+/lin-/⑶45-。在一些實施方式中，⑶45_干細(xì)胞的亞群來自小鼠，并且是ka-r/lirT/⑶45_。所公開的亞群的分離可以利用可以基于CD45、CD133、GlyA, CXCR4、OKM、AC133、 ka-l、CD45R/B220、Gr-l、TCRa@ ,TCRy δ、CDllb 及 1^1-119 標(biāo)記物的一種或多種的表達(dá)或表達(dá)缺乏來分離細(xì)胞的任何方法進(jìn)行，包括但不限于熒光活化的細(xì)胞分選(FACS)。本文所使用的lin_指的是不表達(dá)下列標(biāo)記物的任何一種的細(xì)胞⑶45R/B220、 Gr-U TCRa^ , TCRy δ、CDllb及Ter-119。這些標(biāo)記物存在于下述細(xì)胞上從早期Pro-B 到成熟B細(xì)胞的B細(xì)胞譜系的細(xì)胞(CD45R/B220)；骨髓譜系的細(xì)胞，諸如在骨髓發(fā)育期間的單核細(xì)胞、骨髓粒細(xì)胞及外周中性白細(xì)胞(Gr-I)；胸腺細(xì)胞、外周T細(xì)胞及腸上皮內(nèi)皮淋巴細(xì)胞(TCRaii和TCR γ δ)；骨髓細(xì)胞、NK細(xì)胞、一些活化的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、 Bl細(xì)胞及樹突細(xì)胞的亞類(CDllb)；以及成熟的紅細(xì)胞和紅細(xì)胞系前體細(xì)胞(Ter-119)。所述分離步驟可以作為一系列步驟以逐步方式或同時進(jìn)行。例如，每個標(biāo)記物的存在或缺乏可以單獨(dú)地評估，在每個步驟基于是否存在單獨(dú)的標(biāo)記物產(chǎn)生兩個亞群。此后， 感興趣的亞群可以被選擇并基于下一標(biāo)記物的存在或缺乏而被進(jìn)一步分開。可選地，所述亞群可以通過僅分離出具有特定標(biāo)記物模式的那些細(xì)胞而產(chǎn)生，其中短語“標(biāo)記物模式(marker profile) ”指的是兩種或更多種標(biāo)記物的存在或缺乏的總結(jié)。 例如，混合的細(xì)胞群可以含有⑶133+和⑶34 _細(xì)胞。類似地，相同的混合細(xì)胞群可以含有 ⑶45+和⑶45.細(xì)胞。因此，這些細(xì)胞中的一些將是⑶133+/⑶45+，另一些將是⑶133+/⑶45、 另一些將是⑶1337⑶45+，其它將是⑶1337⑶45_。這些標(biāo)記物的單獨(dú)的組合的每種代表不同的標(biāo)記物模式。隨著另外的標(biāo)記物被加入，所述模式可以變得更復(fù)雜，并且對應(yīng)最初的混合細(xì)胞群中越來越小的百分比。在一些實施方式中，當(dāng)前公開的主題的細(xì)胞具有CD133+/ CD457GlyA_的標(biāo)記物模式。在當(dāng)前公開的主題的一些實施方案中，對由感興趣的細(xì)胞類型表達(dá)的標(biāo)記物(諸如，在⑶1337⑶45_/GlyA_細(xì)胞的表面上表達(dá)的多肽)特異的抗體用于分離和/或純化具有感興趣的標(biāo)記物模式的BM細(xì)胞的亞群。應(yīng)當(dāng)理解基于感興趣的標(biāo)記物模式，所述抗體可以用于陽性或陰性地選擇群體的級份，其在一些實施方式中隨后被進(jìn)一步分級分離。在一些實施方式中，采用具有不同特異性的多個抗體、抗體衍生物、和/或抗體片段。在一些實施方式中，每個抗體、或其片段或衍生物，對選自包括而不限于⑶133、⑶45、 GlyA、Ly-6A/E、CD34、CXCR4、AC133、CD45、CD45R、B220、Gr_l、TCR α β , TCR γ δ、 CDllb、Ter-119、c_met、LIF-R、SSEA-1、0ct_4、Rev-I 和 Nanog 的組的標(biāo)記物是特異性的。 在一些實施方式中，分離和/或純化表達(dá)一個或更多個選自包括但不限于SSEA-1、Oct-4、 Rev-I及Nanog的組的基因的細(xì)胞。當(dāng)前公開的主題涉及細(xì)胞群，其在一些實施方式中表達(dá)下述抗原CXCR4、AC133、 CD34,SSEA-I (小鼠)或SSEA-4 (人類)、胎兒堿性磷酸酶(AP)、c-met及LIF-受體(LIF-R)。 在一些實施方式中，當(dāng)前公開的主題的細(xì)胞不表達(dá)下述抗原CD45、譜系標(biāo)記物(S卩，細(xì)胞為lirT)、GlyA、HLA-DR、I類MHC、CD90、Q^9及CD105。因此，在一些實施方式中，當(dāng)前公開的主題的細(xì)胞可以被表征如下CXCR47CD133+/CD347SSEA-r (小鼠)或SSEA-4+(人類)/ AP+/c-met7LIF-R7CD457lin7HLA-DR7 I 類 MHC 7 GlyA7CD907CD^7CD105-。應(yīng)當(dāng)理解，為了分離具有期望標(biāo)記物模式(例如，⑶133+/⑶45_/GlyA_)的細(xì)胞亞群，可以任何方便的組合，同時或反復(fù)地使用基于相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)來用于分離細(xì)胞的配體(例如，抗體)。例如，可同時、以任意組合、或以任何順序單獨(dú)地使用與⑶133、⑶45和 GlyA結(jié)合的抗體，以便于分離期望的亞群。在一些實施方式中，每個抗體、其片段或衍生物包括可檢測的標(biāo)簽。結(jié)合于不同標(biāo)記物的不同的抗體、或其片段或衍生物可以包括不同的可檢測標(biāo)簽或可以采用相同的可檢測標(biāo)簽。各種可檢測標(biāo)簽對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，用于將可檢測標(biāo)簽結(jié)合到生物分子諸如抗體和其片段和/或衍生物的方法也是公知的。本文所使用的短語“可檢測標(biāo)簽”指的是可以加入到抗體、或其片段或衍生物的任何部分，其允許抗體的檢測。代表性的可檢測部分包括但不限于共價附著的生色團(tuán)、熒光部分、酶、抗原、具有特異反應(yīng)性的基團(tuán)、化學(xué)發(fā)光部分及電化學(xué)可檢測的部分等。在一些實施方案中，抗體被生物素化。在一些實施方式中，利用第二抗體檢測生物素化的抗體，所述第二抗體包括親和素或鏈霉親和素基團(tuán)并且還綴合于包括但不限于Cy3、Cy5及Cy7的熒光標(biāo)簽。在一些實施方式中，抗體、其片段或衍生物用熒光標(biāo)簽諸如Cy3、Cy5、或Cy7直接標(biāo)記。在一些實施方式中，所述抗體包括生物素-綴合的大鼠抗-小鼠Ly-6A/E(ka-1 ；克隆E13-161. 7)、鏈霉親和素_PE_Cy5綴合物、 抗-CD45-APCCy7 (克隆 30-F11)、抗-CD45R/B220-PE (克隆 RA3-6B2)、抗-Gr-l-PE (克隆 RB6-8C5)、抗-TCRa β PE (克隆 Η57-597)、抗-TCR γ δ PE (克隆 GL3)、抗-CDllb PE (克隆Μ1/70)及抗-Ter-119 PE (克隆TER-119)。在一些實施方式中，所述抗體、片段、或其衍生物用熒光標(biāo)簽直接標(biāo)記，并且通過熒光激活細(xì)胞分選術(shù)分離結(jié)合于抗體的細(xì)胞。另外的檢測策略對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。雖然FACS掃描是用于純化細(xì)胞亞群的便利方法，但是應(yīng)當(dāng)理解也可以采用其它方法。可以采用的示例性方法是采用特異性結(jié)合于⑶45、CXCR4、⑶34、AC133、Sca-l、⑶45R/ B220、Gr-U TCRa^ , TCRy δ、CDllb和Ter-119的一種或多種的抗體，所述抗體包含這樣的部分(例如生物素)，對于所述部分高親和力結(jié)合試劑是可獲得的(例如親和素或鏈霉親和素)。例如，生物素部分可以附著于對于每種標(biāo)記物的抗體，對于所述標(biāo)記物，在細(xì)胞表面上的存在是所期望的(例如，CD34、Sca-I、CXCR4)，并且具有結(jié)合的抗體的細(xì)胞群可以與包含親和素或鏈霉親和素部分的親和試劑接觸(例如，包含親和素或鏈霉親和素的柱)。 回收結(jié)合于柱的那些細(xì)胞，并按預(yù)期的進(jìn)一步分級分離?？蛇x地，結(jié)合于所述群中要去除的那些細(xì)胞上存在的標(biāo)記物(如，CD45R/B22O、Gr-l、TCRa0、TCRy δ、CDllb 及 Ter-119)的抗體可以用生物素標(biāo)記，可回收不與親和試劑結(jié)合的細(xì)胞，并進(jìn)一步純化。還應(yīng)理解可在純化過程的一個或更多個步驟中一起采用不同的分離技術(shù)(諸如親和純化和FACS)。在一些實施方式中，VSEL干細(xì)胞或其衍生物還表達(dá)選自包括但不限于c-met、 c-kit、LIF-R及其組合的組的標(biāo)記物。在一些實施方式中，所公開的分離方法進(jìn)一步包括分離為c-met+、c-kit+、和/或LIF-R+的那些細(xì)胞。在一些實施方案中，VSEL干細(xì)胞或其衍生物還表達(dá)SSEA-1、Oct-4、Rev-I及 Nanog，并且在一些實施方案中，所公開的分離方法進(jìn)一步包括分離表達(dá)這些基因的那些細(xì)胞。在一些實施方案中，基于醛脫氫酶(ALDH)的表達(dá)對當(dāng)前公開的主題的⑶133+/ GlyA7CD45_細(xì)胞群進(jìn)一步進(jìn)行分離。例如，可應(yīng)用配體ALDEFLUOR (STEMCELLTechnologies, Vancouver, British Columbia, Canada)基于 ALDH 染色來分離 CD 133+/ GlyA_/⑶45_細(xì)胞。如此，當(dāng)前公開的方法在一些實施方案中還可包括從⑶133+/GlyA_/ ⑶細(xì)胞中分離ALDH高細(xì)胞，從⑶133+/GlyA7⑶細(xì)胞中分離々0)!1低細(xì)胞，或分別從 CD133+/GlyA7CD45—細(xì)胞中分離ALDHs細(xì)胞和ALDHte細(xì)胞。當(dāng)前公開的主題還提供了分離的干細(xì)胞群，其中所述分離的干細(xì)胞群包含基本上純化的分離自臍帶血(CB)的⑶133+/GlyA7⑶45_細(xì)胞。該分離的干細(xì)胞群可包含⑶133+/ GlyA7CD457ALDH 細(xì)胞、CD133+/G1 yA7CD457ALDH 細(xì)胞或其組合。含有當(dāng)前公開的主題的⑶133+/⑶457617々_細(xì)胞的細(xì)胞群可以從任何受試者或從含有它們的受試者內(nèi)的任何來源分離。在一些實施方式中，所述細(xì)胞群包括骨髓樣品、臍帶血樣品、外周血樣品、或胎肝樣品。在一些實施方案中，在用足以將CD45—干細(xì)胞從骨髓遷移到受試者的外周血的量的遷移劑處理受試者后，從受試者的骨髓分離所述細(xì)胞群。本文所使用的短語“遷移劑”指的是這樣的化合物(例如，肽、多肽、小分子、或其它試劑)，其在給予受試者時導(dǎo)致VSEL干細(xì)胞或其衍生物從受試者的骨髓遷移到外周血。換句話說，將遷移劑給予受試者導(dǎo)致受試者外周血中存在比在即將給予遷移劑之前存在于其中的數(shù)量增加的VSEL干細(xì)胞和/或VSEL干細(xì)胞衍生物。然而，應(yīng)當(dāng)理解遷移劑的效果不需要是即時的，通常包括延遲時間，在此期間遷移劑作用于受試者中的組織或細(xì)胞類型以便產(chǎn)生其效果。在一些實施方案中，所述遷移劑包括粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)和CXCR4拮抗劑 (例如,Τ140肽；Tamamura等(1998)253 Biochem BiophysRes Comm 877-882)的至少一種。當(dāng)前公開的主題還提供了通過當(dāng)前公開的方法分離的⑶45_干細(xì)胞群。III.用于施與受試者的方法和組合物 III. Α.方法
當(dāng)前公開的主題還提供了用于在受試者中種群恢復(fù)細(xì)胞類型的方法。在一些實施方案中，該方法包括以一定的量和通過一定的途徑給受試者施與在可藥用載體中包含多個分離的CD1337GlyA7CD45_干細(xì)胞的組合物，所述量和途徑足以允許CD1337GlyA7CD45_干細(xì)胞的至少一部分移入靶部位并在其中分化，由此在受試者中種群恢復(fù)細(xì)胞類型。在一些實施方案中，該細(xì)胞類型是造血細(xì)胞。在當(dāng)前公開的方法的一些實施方案中，該多個分離的 CD133+/GlyA7CD45-干細(xì)胞包含分離自臍帶血的CD133+/GlyA7CD45-干細(xì)胞。在一些實施方案中，該靶部位包括受試者的骨髓。因此，在一些實施方案中，當(dāng)前公開的主題還提供了用于骨髓移植的方法。在一些實施方案中，該方法包括給至少部分地缺乏骨髓的受試者施與包含有效量的分離自所述細(xì)胞來源(例如，臍帶血、骨髓、外周血和/或胎肝)的〔0133+/6174_/^045_干細(xì)胞的藥物制備物，其中該有效量包含分離的⑶133+/GlyA_/⑶45_干細(xì)胞足以移入受試者骨髓的量。在閱讀了當(dāng)前公開內(nèi)容后，骨髓移植將是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員一般公知的技術(shù)。 幾個已經(jīng)公開美國和其他專利及專利申請描述了標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的變化。簡而言之，將接受骨髓移植(BMT)的受試者一般進(jìn)行一系列的預(yù)治療，所述預(yù)治療經(jīng)設(shè)計以準(zhǔn)備接受所施與的細(xì)胞的骨髓空間。這些預(yù)治療可包括但不限于，經(jīng)設(shè)計以抑制受試者免疫系統(tǒng)從而使得供體和受體不是組織可相容時移植物不會受到排斥，以及在骨髓中產(chǎn)生空間以允許施與的細(xì)胞移入的治療。示例性的產(chǎn)生空間的預(yù)治療包括暴露于破壞所有或部分骨髓的化療，以及全身放射(TBI)。
如此，在一些實施方案中，當(dāng)前公開的主題提供了這樣的方法，其中至少部分地缺乏骨髓的受試者經(jīng)歷了至少部分地減少該受試者骨髓的預(yù)治療。本文所使用的短語“至少部分地缺乏骨髓的受試者”是指接受了脊髓抑制治療或脊髓減少治療的受試者，其每一個均消除受試者中至少部分骨髓。脊髓抑制和脊髓減少治療是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的， 并且可包括免疫治療、化療、放療或其組合。III. B.組合物
一旦受試者經(jīng)歷了合適的預(yù)治療(若需要的話)，則施與包含當(dāng)前公開的主題的 ⑶133+/GlyA_/⑶45_干細(xì)胞分離群的組合物。在一些實施方案中，該組合物在可藥用載體 (任選地，對人使用而言是可藥用的載體)中包含⑶133+/GlyA7⑶45—干細(xì)胞。在一些實施方案中，施與新鮮分離的當(dāng)前公開主題的⑶133+/GlyA_/⑶45—干細(xì)胞，盡管也可使用冷凍細(xì)胞。用于冷凍保存用于施與受試者的干細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。在一些實施方案中，在飼養(yǎng)細(xì)胞層的存在下共培養(yǎng)當(dāng)前公開主題的CD133+/GlyA_/ CD45_干細(xì)胞，以提高該細(xì)胞移入受試者和/或在受試者中產(chǎn)生血細(xì)胞的效率。在一些實施方案中，飼養(yǎng)細(xì)胞層包含0P9細(xì)胞。III.B. 1.制劑
當(dāng)前公開的主題的組合物在一些實施方案中包括包含載體的組合物，尤其是可藥用載體，諸如但不限于人類中可藥用的載體。任何合適的藥物制劑可以用于制備用于施與受試者的組合物。例如，合適的制劑可以包括含水和無水無菌注射溶液，其可以含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、殺菌抗生素、以及使該制劑與預(yù)定的受者的體液等滲的溶質(zhì)。應(yīng)當(dāng)理解，除了上面特別提及的成分，當(dāng)前公開的主題的制劑還可包含本領(lǐng)域中關(guān)于討論的制劑類型的常見的其它試劑。例如，可以使用無菌不含致熱原的含水和無水溶液。當(dāng)前公開的主題的治療方法和組合物可以與其他的佐劑或生物反應(yīng)修飾劑一起使用，所述修飾劑包括但不限于細(xì)胞因子和其它免疫調(diào)節(jié)化合物。III. B. 2.施與
用于施與當(dāng)前公開的主題的組合物的合適的方法包括但不限于靜脈內(nèi)施與和直接遞送到靶組織或器官。在一些實施方案中，施與方法包括用于細(xì)胞在靶部位(例如，骨髓)區(qū)域化遞送或聚集的特征。在一些實施方案中，所述細(xì)胞被直接遞送入靶部位。在一些實施方案中，通過細(xì)胞的靜脈內(nèi)注射完成當(dāng)前公開主題的細(xì)胞的選擇性遞送，其中它們靶向(home to)靶部位并移入其中。III. B. 3.劑量
有效劑量的當(dāng)前公開主題的組合物被施與有需要的受試者?！爸委熡行Я俊被颉爸委熈俊?是足以產(chǎn)生可測量的反應(yīng)(例如，被治療的受試者中的生物或臨床相關(guān)反應(yīng))的治療組合物的量?？梢愿淖儺?dāng)前公開主題的組合物中的活性成分的實際劑量水平以便施與可以有效實現(xiàn)對于特定受試者的期望治療反應(yīng)的活性化合物的量。所選的劑量水平將依賴于治療組合物的活性、施與途徑、與其他藥物或治療的組合、要治療的狀況的嚴(yán)重性、以及要治療的受試者的狀況和先前醫(yī)療史。然而，化合物的開始劑量在低于實現(xiàn)期望的治療效果所需的水平，并逐漸提高劑量直到實現(xiàn)期望的效果，這在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。組合物的效能可以變化，因此“治療有效量”可以變化。然而，利用本文所述的實驗方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地評估當(dāng)前公開主題的候選化合物的效能和功效并因而調(diào)整治療方案。在閱覽本文呈現(xiàn)的當(dāng)前公開主題的公開內(nèi)容后，考慮特定劑型、所述組合物所用的施與方法及要治療的特定疾病，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以調(diào)整給予個體受試者的劑量。劑量的進(jìn)一步計算可以考慮受試者的身高和體重、癥狀的嚴(yán)重性和階段及另外的有害身體狀況的存在。這樣的調(diào)整或改變，以及何時和怎樣進(jìn)行這樣的調(diào)整或改變的評估對于醫(yī)藥領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員是熟知的。IV.其他應(yīng)用
當(dāng)前公開的主題還提供了用于誘導(dǎo)⑶133+/GlyA_/⑶45_干細(xì)胞的造血能力的方法。本文所使用的短語“造血能力”是指⑶133+/GlyA_/⑶45_干細(xì)胞(或其后代細(xì)胞)分化為造血細(xì)胞(例如，終端分化造血細(xì)胞)的能力。該短語因此包括單個細(xì)胞能夠種群恢復(fù)受試者的效率(例如，如由施與受試者以便使該受試者獲得臨床相關(guān)益處所需的最小細(xì)胞數(shù)測得)，以及該細(xì)胞在受試者中產(chǎn)生臨床相關(guān)益處所需的時間。在一些實施方案中，當(dāng)前公開主題的細(xì)胞的造血能力包括在受試者中提供骨髓長期移入的能力。如本文所公開，⑶133+/GlyA_/⑶45_干細(xì)胞可顯示出不同的造血能力，在一些實施方案中，其基于分離該CD133+/GlyA7CD45_干細(xì)胞的來源，以及該細(xì)胞可能接受的任何預(yù)處理(例如，與0P9細(xì)胞共培養(yǎng))。因此，在一些實施方案中，當(dāng)前公開的主題的方法包括(a) 提供⑶133+/GlyA7⑶45—干細(xì)胞；以及(b)在飼養(yǎng)層(例如，0P9飼養(yǎng)層)的存在下共培養(yǎng) CD133+/GlyA7CD45-干細(xì)胞足以誘導(dǎo)該CD133+/GlyA7CD45-干細(xì)胞的造血能力的時間。此外，當(dāng)前公開的方法可采用的⑶133+/GlyA_/⑶45_干細(xì)胞是骨髓衍生的⑶133+/ GlyA7CD45_干細(xì)胞、臍帶血衍生的CD1337GlyA7CD45_干細(xì)胞、或其組合。此外，該CD133+/ GlyA7CD45-干細(xì)胞是 CD133+/GlyA7CD457ALDH 干細(xì)胞、CD133+/GlyA7CD457ALDHs干細(xì)胞，或其組合。V.細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)
在一些實施方案中，當(dāng)前公開的主題還提供了包含⑶133+/GlyA_/⑶45_干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。在一些實施方案中，該細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)還包含飼養(yǎng)細(xì)胞層，任選0P9細(xì)胞飼養(yǎng)層。
實施例下面的實施例提供了示意性的實施方案。根據(jù)本發(fā)明披露的內(nèi)容和本領(lǐng)域的一般技術(shù)水平，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到下面的實施例僅是示例性的并且可以采用各種變化、修改及改變而不偏離當(dāng)前披露的主題的范圍。實施例1-4中俥用的材料和方法
最近，在臍帶血(CB)中鑒定了原始的極小胚胎樣干細(xì)胞(VSEL)群。這些CB-VSEL干細(xì)胞⑴尺寸極小 6 Mm;通常為 2-4 μπι) ； (ii)是 SSEA-470ct-47CD133+/CXCR47Lin7 CD45—的；(iii)對基質(zhì)衍生的因子I(SDF-I)梯度強(qiáng)烈的反應(yīng)；以及(iv)擁有相對大的含有原始常染色質(zhì)的細(xì)胞核(Kucia等，(2007) Leukemia 21:297-303; PCT國際專利申請
發(fā)明者K. 祖巴-敘爾馬 E., 拉塔查克 J., 拉塔查克 M. 申請人:路易斯維爾大學(xué)研究基金會有限公司