專利名稱：用于抑制cripto/grp78復(fù)合物形成和信號的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更加具體而言，其涉及對Cripto/GSP78 信號破壞所涉及高增生性疾病的治療。
背景技術(shù)：
Cripto (Cripto-1, TDGF1)是在胚胎發(fā)生過程中具有基本生理學(xué)作用的小的GPI 錨定信號蛋白。其還在人腫瘤中高水平表達(dá)，并且與腫瘤引發(fā)和進(jìn)展的數(shù)個方面相聯(lián)系，包括增強(qiáng)的細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、腫瘤血管發(fā)生和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT) (Strizzi等，2005)。認(rèn)為數(shù)個作用機(jī)制促成了 Cripto的致癌作用基礎(chǔ)(Strizzi等，2005)。例如， 它通過與這些配體中的一些配體以及它們各自的信號受體形成復(fù)合體調(diào)節(jié)TGF-β超家族成員的信號。在該背景下，Cripto在促進(jìn)某些配體例如Nodal的信號(Schier，2003 ； Shen 和 Schier，2000)而抑制激活蛋白(Adkins 等，2003 ；Gray 等，2003)和 TGF-β 1 (Reddy 等，2003)的信號中具有專一性作用。由于激活蛋白和TGF-β具有腫瘤阻抑制因子作用 (Pardali和Moustakas，2007)，它們的信號被Cripto抑制提供了至少部分解釋Cripto促進(jìn)腫瘤生長的機(jī)制(Adkins等，2003 ；Gray等，2003 ；Gray等，2006)。相反地，Cripto依賴的Nodal信號將促成腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的晚期階段，在該條件下細(xì)胞變成抵抗TGF- β配體的生長抑制作用(Pardali 和 Moustakas，2007 ；Topczewska 等，2006)。Cripto也可以溶解形式從細(xì)胞釋放并且以類似于分泌的生長因子的方式起作用 (Strizzi等2005)。在該方面，據(jù)報導(dǎo)，Cripto和爪蟾的Cripto直向同源物FRL-I分別引起 erbB-4 (Bianco 等，1999)和 FGFR-I (Kinoshita 等，1995)的磷酸化。然而，Cripto 不直接結(jié)合這些蛋白質(zhì)，并且介導(dǎo)這些磷酸化事件的假定的Cripto受體還沒有找到(Bianco等， 1999 ；Kinoshita等，1995)。在該方面，雖然Cripto擁有EGF樣結(jié)構(gòu)域并且類似于EGF受體的配體，但它不直接結(jié)合EGF受體家族的任何成員(Bianco等，1999)。此外，雖然Cripto 結(jié)合細(xì)胞外的GPI錨定的蛋白聚糖磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1通過c-Src引起MAPK和PI3K 途徑的活化，但是仍沒有鑒定出介導(dǎo)該作用的跨膜蛋白質(zhì)(Bianco等，2003)。因此，雖然Cripto具有促進(jìn)腫瘤生長的多種信號機(jī)制，但是已知其細(xì)胞表面結(jié)合配偶體似乎不能完全解釋所報導(dǎo)的其致癌作用。考慮到高增生性疾病的明顯的社會和經(jīng)濟(jì)影響，因此需要對高增生性疾病的改良治療，并且對Cripto引起這些效應(yīng)的機(jī)制的了解將得到改良的治療和篩選方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過確定了 Cripto可結(jié)合葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)并引起促進(jìn)高增生性細(xì)胞的生長的下游信號而克服現(xiàn)有技術(shù)的局限性。因此，本發(fā)明提供可用于治療疾病如癌癥的Cripto/GRP78相互作用抑制劑。在另外的方面中，本發(fā)明提供用于篩選Cripto/ GRP78復(fù)合物形成的調(diào)節(jié)劑的方法。本發(fā)明至少部分地基于這樣一個令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，即細(xì)胞表面的GRP78是Cripto 結(jié)合配偶體并且是人腫瘤細(xì)胞、人胚胎干細(xì)胞和正常人乳腺上皮細(xì)胞中Cripto信號所必需的。因此，細(xì)胞表面Cripto/GRP78復(fù)合體代表著干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中可以被治療性靶向的新的和稱心如意的靶標(biāo)。發(fā)明人在下面進(jìn)一步證明，細(xì)胞表面Cripto/GRP78相互作用對于Cripto共受體功能和腫瘤生長因子活性是必需的。結(jié)果表明，對細(xì)胞表面GRP78的敲低或免疫中和封閉了 Cripto對激活蛋白、Nodal和TGF-β信號的調(diào)節(jié)并阻止了 Cripto對 c-Src/MAPK/PI3K途徑的活化。因此資料支持這樣一種想法，即GRP78是對于Cripto信號必需的Cripto受體/共因子。重要的是，發(fā)明人首次證明GRP78存在于人ES細(xì)胞表面，其中它與Cripto共定位并且介導(dǎo)Cripto對激活蛋白和Nodal信號的相反作用。Cripto與細(xì)胞表面GRP78的結(jié)合對于Cripto增加細(xì)胞增殖和降低E-鈣黏著蛋白表達(dá)和細(xì)胞粘附的能力也是必需的，表明這些蛋白質(zhì)會一起作用促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，激活蛋白-A 和Nodal在Cripto/GRP78復(fù)合體存在下是促有絲分裂的而在Cripto/GRP78復(fù)合體缺乏時激活蛋白-A具有細(xì)胞抑制作用并且Nodal對增殖無作用。不希望被任何理論所束縛，該結(jié)果支持這樣一個想法，即細(xì)胞表面Cripto/GRP78復(fù)合體通過協(xié)調(diào)MAPK/PI3K和Smad2/3途徑之間的通訊調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。本發(fā)明的一個方面涉及用于抑制細(xì)胞中Cripto信號的方法，包括抑制CriptO和 GRP78之間復(fù)合體形成的形成。方法將包括將至少所述細(xì)胞表面與選擇性的GRP78靶向性化合物接觸，其中所述抑制包括抑制Cripto/GRP78復(fù)合體在細(xì)胞表面上的形成。所述復(fù)合體的形成將被抗GRP78抗體抑制，并且抗GRP78抗體將結(jié)合GRP78的N-20表位。在某些實施方案中，抗GRP78抗體是人源化單克隆抗體。抗體可與報告分子，例如放射性配體或熒光標(biāo)簽綴合。所述復(fù)合體的形成將被抗GRP78F(ab)或F(ab)2，或GRP78靶向性shRNA、siRNA 或siNA(例如包括SEQ ID N0:5的GRP78靶向性shRNA)抑制。施用可以是全身性的、局部的、部位性的、腸胃外的、靜脈內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、通過吸入或者瘤內(nèi)的。在某些實施方案中，方法進(jìn)一步定義為降低細(xì)胞增殖的方法，包括細(xì)胞與有效量的優(yōu)先結(jié)合GRP-78并抑制GRP-78結(jié)合Cripto并引起Nodal信號的能力的GRP-78靶向性化合物接觸。方法可包括將至少所述細(xì)胞表面與Cripto靶向性化合物接觸，其中Cripto 靶向性化合物選擇性地結(jié)合Cripto的CFC結(jié)構(gòu)域或GRP78-結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的表位并抑制 Cripto與GRP78之間復(fù)合物的形成。Cripto靶向性化合物可以是結(jié)合Cripto的GRP78-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或CFC結(jié)構(gòu)域中表位的抗體。方法可包括將至少所述細(xì)胞的表面與shRNA接觸，其中shRNA包括SEQID NO :4。靶向性化合物可以是不結(jié)合或基本不結(jié)合Cripto的GRP78突變體。GRP78突變體可以是缺乏天然GRP78的氨基酸19-68位的GRP78突變體，例如Δ 19-68 GRP78。在另外的實施方案中，GRP78可以通過在GRP78的19-68位氨基酸區(qū)的一個或更多個替代或插入突變進(jìn)行突變以產(chǎn)生不結(jié)合或者基本不結(jié)合Cripto的GRP78突變體。所述細(xì)胞可以衍生自選自下列的器官乳腺、結(jié)腸、胃、胰臟、肺、卵巢、子宮內(nèi)膜、睪丸、膀胱、前
5列腺、頭、頸、子宮頸、胃、膽囊和腎上腺皮質(zhì)。細(xì)胞可以是癌性細(xì)胞、癌前細(xì)胞或惡性細(xì)胞， 并且其中方法進(jìn)一步定義為治療高增生性疾病例如癌癥的方法。癌癥可以選自乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、睪丸癌、膀胱癌、前列腺癌、頭頸癌、宮頸癌、 膽囊癌或腎上腺皮質(zhì)癌。在某些實施方案中，方法進(jìn)一步定義為降低細(xì)胞增殖的方法。方法可包括降低細(xì)胞中由Cripto引起的Nodal信號、激活蛋白/TGF-β信號或c_Src/MAPK/PI3K信號的方法。 方法可包括向受試者施用第二治療，例如化學(xué)治療(例如紫杉醇、順鉬或碳鉬)、放射治療、 基因治療、免疫治療或外科手術(shù)。方法可進(jìn)一步定義為促進(jìn)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化的方法，其中細(xì)胞是干細(xì)胞， 并且其中抑制Cripto與GRP78之間復(fù)合體的形成促進(jìn)細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化。細(xì)胞可以是人胚胎干細(xì)胞(例如H9或BG02)或者誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPSC)。本發(fā)明的另一個方面涉及篩選Cripto/GRP78復(fù)合物形成的抑制劑的方法，包括 得到候選調(diào)節(jié)劑，將候選調(diào)節(jié)劑與Cripto和GRP78接觸，并測量Cripto/GRP78復(fù)合體的形成，其中在候選調(diào)節(jié)劑存在下Cripto/GRP78復(fù)合體形成的減少或者Cripto/GRP78復(fù)合體信號的降低表明候選調(diào)節(jié)劑是Cripto/GRP78復(fù)合物形成的抑制劑。Cripto和GRP78可以由細(xì)胞表達(dá)。在某些實施方案中，Cripto和GRP78由細(xì)胞轉(zhuǎn)基因性過表達(dá)。細(xì)胞可以是癌性細(xì)胞或癌前細(xì)胞。方法可包括測量Cripto/GRP78信號，其中Cripto/GRP78信號包括激活蛋白/TGF-β信號、c-Src/MAPK/PI3K信號或PI3K/Akt/GSK3i3信號。方法可包括測量 Cripto和GRP78之間的結(jié)合，其中在候選調(diào)節(jié)劑存在下Cripto/GRP78結(jié)合的降低表明候選調(diào)節(jié)劑抑制Cripto/GRP78復(fù)合物形成。所述的測量結(jié)合可包括細(xì)胞表面生物素化作用 /Co-IP測定(例如如在Shani等2008中所述的那樣)、125I_Cripto結(jié)合測定(例如在完整細(xì)胞中)、包括測量Cripto與固定化GRP78結(jié)合的測定(例如在多孔板中)、或者測量可溶性Cripto結(jié)合的ELISA測定。在許多實施方案中，包括將Cripto和GRP78用熒光團(tuán)或猝滅劑標(biāo)記并例如使用FACS測量熒光的熒光測定可以在本發(fā)明中使用。本發(fā)明的又一方面涉及人源化單克隆抗GRP78抗體，其中抗體結(jié)合GRP78中的 N-20表位，并且其中所述結(jié)合抑制Cripto/GRP78復(fù)合體形成。抗體可以包含在藥物組合物中，并且藥物組合物可以配制成用于腸胃外、靜脈內(nèi)或瘤內(nèi)施用。術(shù)語“抑制”、“降低”或“阻止”或者這些術(shù)語的任何變形，當(dāng)在權(quán)利要求書和/或說明書中使用時包括任何可測量的降低或者完全抑制以達(dá)到預(yù)期結(jié)果。如在說明書和/或權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“有效的”意思是指足以達(dá)到想要的、 期望的或預(yù)期的結(jié)果。當(dāng)詞語“a”或“an”在權(quán)利要求書和/或說明書中與術(shù)語“包括(包含)”結(jié)合使用時意思是指“一”，但是其還有“一或更多”、“至少一”和“一或一以上”的含義?？紤]了就本發(fā)明的任何方法或組合物而言，在本說明書中討論的任何實施方案可以實施，并且反之亦然。此外，本發(fā)明組合物可以用于實現(xiàn)本發(fā)明的方法。在本申請通篇中，術(shù)語“大約”用于指數(shù)值包括對于所采用測定數(shù)值的設(shè)備、方法所固有的誤差變化，或者在研究受試者當(dāng)中存在的變異。雖然本公開支持術(shù)語“或”的定義指僅僅備選方案和“和/或”，但是除非明確地指出是僅指備選方案或者備選方案相互排斥，否則術(shù)語“或”在權(quán)利要求書的使用意思是指“和/或”。如在本說明書和權(quán)利要求書中所使用，詞語“包含”(和包含的任何形式，例如復(fù)數(shù)和單數(shù)形式的“包含”)、“具有”(和具有的任何形式，例如復(fù)數(shù)和單數(shù)形式的“具有”)、“包括”(和包括的任何形式，例如復(fù)數(shù)和單數(shù)形式的“包括”)或“含有”(和含有的任何形式， 例如復(fù)數(shù)和單數(shù)形式的“含有”)是包含在內(nèi)的或開放式的并且不排除另外的、非描述的元素或方法步驟。根據(jù)下列詳細(xì)的描述，本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)勢將變得顯而易見。然而，應(yīng)當(dāng)理解，詳細(xì)的描述和表明本發(fā)明特定實施方案的特定實施例僅通過例證方式給出，因為根據(jù)該詳細(xì)的描述，處于本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的許多改變和修改對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將變得顯而易見。


下列圖構(gòu)成本說明書的一部分，并且旨在進(jìn)一步證明本發(fā)明的某些方面。通過參考一個或更多個這些附圖并結(jié)合本文呈現(xiàn)的特定實施方案的詳細(xì)描述可更好的理解本發(fā)明。圖1A-C.新的Cripto結(jié)合蛋白的鑒定.293T細(xì)胞以空載體或Cripto-Flag轉(zhuǎn)染， 免疫沉淀在抗Flag珠上，然后以Flag肽洗脫。通過SDS-PAGE分離Cripto相關(guān)蛋白然后或者進(jìn)行銀染色(A)或者印跡在硝酸纖維素上并用抗GRP78或抗Cripto抗體探測(C)，如在下面材料和方法中所述。將在(A)中指定為a和b的條帶切下并進(jìn)行質(zhì)譜分析，如在下面材料和方法中所述。對應(yīng)于條帶a的鑒定為GRP78的質(zhì)量指紋數(shù)據(jù)示于(B)中。圖2A-D. Cripto結(jié)合細(xì)胞表面上的GRP78. 293T細(xì)胞根據(jù)指示以的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染 (A-D)并且P19細(xì)胞(D)以細(xì)胞不滲透性NHS-LC-生物素標(biāo)記。使用所標(biāo)明的抗體對細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫沉淀，然后用Flag肽(肽洗脫液)或者通過在樣品緩沖液中加熱珠洗脫。 樣品通過SDS-PAGE分離并且用抗生物素蛋白-HRP或者標(biāo)明的抗體進(jìn)行印跡，如下面材料和方法中所述。在一些情況中(B和C)，對過表達(dá)GRP78的293T細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面生物素化作用，然后將所得到的細(xì)胞裂解液與載體或Cripto-Flag珠孵育。圖3A-C.使用RNA干擾對GRP78表達(dá)的靶向性降低.HeLa細(xì)胞以包含 GRP78shRNA(Gl)或空載體的慢病毒感染，并用如所標(biāo)明的毒胡蘿卜內(nèi)酯處理或者不處理。 (A)通過使用抗GRP78或抗肌動蛋白的抗體的Western印跡分析細(xì)胞裂解液，如在材料和方法中所描述。(B)柱表示每100個GFP陽性細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的數(shù)量，如在材料和方法中所述。(C)以載體或GlshRNA病毒感染的細(xì)胞以包含Cripto-Flag的病毒再次感染。使用抗Flag珠對來自這些細(xì)胞的裂解液進(jìn)行免疫沉淀，然后用Flag肽洗脫。使用抗生物素蛋白-HRP、抗GRP78和抗Cripto抗體對洗脫蛋白質(zhì)進(jìn)行Western印跡分析，如下面材料和方法中所述。圖4A-D.內(nèi)源GRP78表達(dá)的抑制增強(qiáng)TGF-β誘導(dǎo)的Smad2磷酸化.HeLa細(xì)胞以包含靶向GRP78的ShRNA(Gl)或空載體的慢病毒感染，然后用如所標(biāo)明的5 μ M毒胡蘿卜內(nèi)酯處理或者不處理。在毒胡蘿卜內(nèi)酯過夜處理之后，細(xì)胞根據(jù)指示以劑量的TGF-βΙ處理 (Α和B)，然后通過Western印跡確定磷酸化Smad2和總的Smad2水平，如在下面材料和方法中所述。備選地，按照所標(biāo)明處理的相同的細(xì)胞以細(xì)胞不滲透性生物素標(biāo)記，所得到的裂解液用抗GRP78抗體(抗KDEL)免疫沉淀，接著使用抗生物素蛋白-HRP進(jìn)行Western印跡 (C)，或者使用抗T β RI、抗T β RII或抗肌動蛋白抗體將裂解液直接進(jìn)行Western印跡(D)， 如在材料和方法中所述。圖5. GRP78不直接結(jié)合TGF-β類型I和類型II受體.293T細(xì)胞以p26_Flag、 Cripto-Flag、T β RI-HA或T β RII-His轉(zhuǎn)染，然后使用如所標(biāo)明的抗Flag、抗HA或抗His 抗體進(jìn)行免疫沉淀。使用抗生物素蛋白-HRP或標(biāo)明的抗體對沉淀的蛋白質(zhì)進(jìn)行Western 印跡分析，如在下面材料和方法中所述。圖6A-D. Cripto 和 GRP78 協(xié)同抑制 TGF- β 信號.(A)以空載體、GRP78、Cripto 或者GRP78和Cripto兩者轉(zhuǎn)染的PC3細(xì)胞根據(jù)指示以的TGF-β I(IOpM)處理或者不處理。磷酸化Smad2 (pSmad2)和總Smad2 (Smad2)水平通過Western印跡測定，如下面材料和方法中所述。(B)來自(A)的磷酸化Smad2條帶使用光密度測定法定量并且相對于對應(yīng)的Smad2 條帶標(biāo)準(zhǔn)化，如下面材料和方法中所述。(C)使用如所標(biāo)明和如在材料和方法中所述的抗 T β RII、抗T β RI和抗肌動蛋白抗體對PC3細(xì)胞裂解液進(jìn)行Western印跡。(D)將細(xì)胞鋪于 96孔板上，然后8天后測量細(xì)胞增殖，如下面材料和方法中所述。圖7A-D. GRP78和Cripto協(xié)同抑制TGF- β對前列腺癌細(xì)胞貼壁不依賴性生長的抗增殖作用.如下面材料和方法中所述，在媒介物或者增加劑量的TGF-β 1存在下，以載體、GRP78、Cripto或者GRP78和Cripto兩者轉(zhuǎn)染的PC3細(xì)胞在貼壁不依賴性條件下于軟瓊脂中生長15天。數(shù)據(jù)表示為在缺乏或存在所標(biāo)明劑量TGF-β 1下單一視野中計數(shù)的集落數(shù)(A)或者表示為在存在所標(biāo)明TGF-β 1濃度下計數(shù)的集落數(shù)除以在缺乏TGF-β 1處理時所計數(shù)的集落數(shù)(％基礎(chǔ))(B)。(C)來自IOOpM TGF-β 1存在或缺乏情況下所標(biāo)明視野的照片。(D)圖解Cripto/GRP78復(fù)合體致癌作用的模型。TGF-β通過經(jīng)Smad2/3途徑發(fā)信號而潛在抑制許多細(xì)胞類型的增殖(左)。Cripto和GRP78相互作用形成復(fù)合體，并且協(xié)同作用減弱TGF- β -依賴性Smad信號和生長抑制。此外，它們獨(dú)立地增加細(xì)胞增殖/存活。在Cripto和GRP78存在下，TGF-β還可增加細(xì)胞增殖(虛線箭頭)。圖8A-G. Cripto和GRP78協(xié)同調(diào)節(jié)激活蛋白、Nodal和TGF-β信號.穩(wěn)定表達(dá) Cripto和/或GRP78shRNA的NCCIT細(xì)胞通過使用所標(biāo)明抗體的Western印跡(A)或者完整細(xì)胞表面ELISA(B)分析。同樣的細(xì)胞以激活蛋白-A(C)或Nodal (D)處理，并且磷酸化 Smad2 (pSmad2)和Smad2的最終水平通過使用pSmad2和Smad2抗體的Western印跡測量。 過表達(dá)所標(biāo)明蛋白質(zhì)和/或shRNA的NCCIT細(xì)胞(E)和293T細(xì)胞(F，G)以Smad2響應(yīng)性螢光素酶報告分子轉(zhuǎn)染并根據(jù)指示以劑量的TGF-β配體處理。所得到的螢光素酶活性相對于未處理樣品標(biāo)準(zhǔn)化并表示為未處理樣品的誘導(dǎo)倍數(shù)。圖9A-G.人ES細(xì)胞中細(xì)胞表面GRP78介導(dǎo)Cripto信號.使用所標(biāo)明的抗體對H9 人ES細(xì)胞進(jìn)行完整細(xì)胞ELISA (A)或免疫熒光(B)。在(B)中，抗Cripto染色是綠色的并且抗GRP78染色是紅色的。(C)H9ES細(xì)胞根據(jù)指示以的激活蛋白-A或Nodal處理，并且通過使用pSmad2和Smad2抗體的Western印跡測量磷酸化Smad2 (pSmad2)和Smad2的最終水平。用Smad2響應(yīng)性螢光素酶報告分子轉(zhuǎn)染以空載體(D)或Cripto shRNA(E)穩(wěn)定感染的NCCIT細(xì)胞，并如所標(biāo)明在N-20抗體存在或缺乏情況下用標(biāo)明劑量的TGF- β配體處理。 所得到的螢光素酶活性相對于未處理樣品標(biāo)準(zhǔn)化并表示為相對于未處理樣品的誘導(dǎo)倍數(shù)。 (F)說明野生型GRP78和缺乏Ν-20表位的Δ 19-68GRP78構(gòu)建體的簡圖。(F，G)如所標(biāo)明，使用抗HA、抗Flag和抗GRP78抗體對根據(jù)指示以構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的裂解液進(jìn)行免疫沉淀禾口 Western 印跡。*p < 0. 01 ；***p < 0. 001。圖10A-F. Cripto需要GRP78受體功能以激活PI3K和MAPK途徑并促進(jìn)NCCIT細(xì)胞增殖.穩(wěn)定表達(dá)所標(biāo)明shRNA的NCCIT細(xì)胞進(jìn)行血清饑餓，然后根據(jù)指示以劑量的可溶性Cripto與所標(biāo)明的或者PI3K抑制劑(LY2940002) (A)或者M(jìn)EK1/2抑制劑(PD98059) (B) 處理。使用所標(biāo)明的抗磷酸化Akt (pAkt)、Akt、磷酸化GSK3 β (pGSK3 β )和肌動蛋白抗體 (A)或磷酸化ERK1/2 (pERKl/2)和ERK1/2抗體(B)對細(xì)胞裂解液進(jìn)行Western印跡。(C) 相同的NCCIT細(xì)胞以如所標(biāo)明的Cripto處理，生長8天，然后使用CyQuant增殖測定試劑盒測量增殖。(D)以Cripto shRNA感染的NCCIT細(xì)胞在一定范圍劑量的N-20抗體或IgG 對照存在下進(jìn)行125I-Cripto結(jié)合。Cripto特異性結(jié)合代表著被過量非標(biāo)記可溶性Cripto 封閉的125I-Cripto結(jié)合的量。以Cripto shRNA感染的NCCIT細(xì)胞進(jìn)行(E)血清饑餓，然后在所標(biāo)明劑量IgG或抗GRP78 (N-20)預(yù)處理后根據(jù)指示以劑量的可溶性Cripto處理，或者(F)在以IgG或抗GRP78(N-20)抗體預(yù)處理后以可溶性Cripto處理。細(xì)胞另外生長8 天并且使用CyQuant增殖測定試劑盒測定增殖。、< 0. 01 ；***p < 0. 001。圖11A-I.在人乳腺上皮細(xì)胞中細(xì)胞表面GRP78的免疫中和阻止Cripto的腫瘤生長因子活性.以空載體感染的人乳腺上皮MCFlOA細(xì)胞使用IgG或N-20抗體進(jìn)行完整細(xì)胞 ELISA(A)或者根據(jù)指示在一定范圍劑量N-20抗體或?qū)φ誌gG抗體存在下進(jìn)行125I-Cripto 結(jié)合(B)。(C)以空載體感染的MCFlOA細(xì)胞進(jìn)行血清饑餓，然后如所標(biāo)明，根據(jù)指示以劑量的可溶性Cripto、N-20抗體和/或IgG處理。如所標(biāo)明，所得到的細(xì)胞裂解液以抗磷酸化 Tyr (pTyr)抗體進(jìn)行免疫沉淀并且以抗磷酸化Src (pSrc，Y416)或抗Src抗體進(jìn)行Western 印跡。(D)以空載體感染的MCFlOA細(xì)胞進(jìn)行血清饑餓，根據(jù)指示以劑量的可溶性Cripto處理，然后細(xì)胞裂解液通過使用如所標(biāo)明的磷酸化Akt (pAkt)和Akt抗體的Western印跡進(jìn)行分析。(E)來自空載體感染的或者Cripto感染的MCFlOA細(xì)胞的細(xì)胞裂解液通過使用如所標(biāo)明的Cripto和肌動蛋白抗體的Western印跡分析。以空載體或Cripto(F)或者以空載體(G)感染的MCFlOA細(xì)胞根據(jù)指示以的可溶性Cripto、IgG和/或N-20抗體處理。細(xì)胞生長8天并且使用CyQuant增殖測定試劑盒測量增殖。(H)以空載體或Cripto感染的 MCFlOA細(xì)胞在根據(jù)指示以IgG或N-20抗體預(yù)處理之后用可溶性Cripto處理。通過使用 E-鈣黏著蛋白和肌動蛋白抗體的Western印跡分析細(xì)胞裂解液。(I)以空載體或Cripto 感染的MCFlOA細(xì)胞用IgG或N-20抗體預(yù)處理，鋪板并允許粘附。所得到的細(xì)胞粘附使用 CyQuant粘附測定定量。< 0. 001。圖12A-C.在NCCIT和MCFlOA細(xì)胞中激活蛋白-A和Nodal的促增殖作用需要 Cripto和GRP78.以空載體、Cripto和/或GRP78shRNA感染的NCCIT細(xì)胞(A，B)和以空載體或Cripto感染的MCFlOA細(xì)胞(C)根據(jù)指示在IgG或N-20抗體存在或缺乏情況下以激活蛋白-A或Nodal處理或不處理。細(xì)胞另外生長8天并且使用CyQuant增殖測定試劑盒測量增殖。***P < 0. 001 ；**p < 0. 005 ；*ρ < 0. Ol0圖 13A-C. GRP78D19-68 抑制經(jīng)由 erbB2、erbB4 和 PI3K 的 Cripto 信號.如所標(biāo)明，293T細(xì)胞以空載體、ErbB2和/或ErbB4表達(dá)載體連同葡萄糖_6_磷酸酶-螢光素酶 (G6Pase-Lux)和b_半乳糖苷酶構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。此外，細(xì)胞以(A)空載體、(B)GRP78或(C) GRP78 D19-68轉(zhuǎn)染。細(xì)胞不經(jīng)處理或者如所標(biāo)明以Cripto (400ng/ml)和/或LY294002 (LY)處理。所得到的螢光素酶活性相對于b_半乳糖苷酶表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化并且表示為相對于未處理樣品的變化倍數(shù)。圖14A-B.說明所提出的Cripto/GRP78信號機(jī)制和拮抗作用的模型.㈧細(xì)胞表面Cripto/GRP78復(fù)合體是經(jīng)由MAPK/PI3K和Smad2/3途徑的致癌Cripto信號所必需的。 Cripto與細(xì)胞表面GRP78的結(jié)合導(dǎo)致通過ErbB2和ErbB4的cSrc/MAPK/PI3K途徑的活化。 Cripto與細(xì)胞表面GRP78的結(jié)合還促進(jìn)Cripto對由激活蛋白/Nodal/TGF-β配體所發(fā)出信號的影響，導(dǎo)致低水平的Smad2/3活化。(B)打斷細(xì)胞表面Cripto/GRP78復(fù)合體致癌功能的試劑包括N-20 GRP78抗體、GRP78 D19-68突變體和sALK4_L75A_Fc。
具體實施例方式本發(fā)明通過提供用于抑制Cripto/GRP78復(fù)合物形成的方法和用于假定Cripto/ GRP78復(fù)合體調(diào)節(jié)劑的篩選方法克服了現(xiàn)有技術(shù)中的局限性。Cripto是在脊椎動物胚胎發(fā)生和人腫瘤進(jìn)展中具有重要作用的多功能細(xì)胞表面蛋白質(zhì)。雖然已經(jīng)證明其調(diào)節(jié)多重信號途徑，但是先前鑒定的其配偶體不能完全解釋它的分子作用。發(fā)明人針對鑒定新的Cripto 相互作用蛋白質(zhì)開展篩選，結(jié)果鑒定出葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)，它是一種在腫瘤細(xì)胞表面上也表達(dá)的ER蛋白伴侶。如在下面實施例中所示，Cripto與GRP78在多種細(xì)胞系的細(xì)胞表面上相互作用并且它們的相互作用不依賴于先前在ER內(nèi)的結(jié)合。使用shRNA對內(nèi)源 GRP78的敲低導(dǎo)致TGF-β信號增強(qiáng)，表明GRP78與Cripto —樣抑制該途徑。當(dāng)GRP78和 Cripto共表達(dá)時協(xié)同對抗TGF-β的反應(yīng)，包括在貼壁依賴性或不依賴性條件下生長的前列腺癌細(xì)胞的Smad磷酸化和生長抑制。下面的實例進(jìn)一步提供了證據(jù)表明，共表達(dá)GRP78 和Cripto的細(xì)胞在軟瓊脂中比單獨(dú)表達(dá)任一種蛋白的細(xì)胞生長快的多。對GRP78/Cripto復(fù)合物形成的抑制可以打斷Cripto信號并且降低細(xì)胞增殖。細(xì)胞表面GRP78的喪失或免疫中和阻斷了 Cripto依賴性Nodal信號，激活蛋白/TGF-β信號的拮抗作用和ERK/MAPK和PI3K/Akt/GSK3 β途徑的活化。發(fā)明人已經(jīng)證明，GRP78存在于人ES細(xì)胞的表面上，其中它與Cripto共定位并且介導(dǎo)Cripto對激活蛋白和Nodal信號的相反作用。此外，細(xì)胞表面GRP78的敲低或免疫中和阻斷了 Cripto引起增加的細(xì)胞增殖、降低的E-鈣黏著蛋白表達(dá)和降低的細(xì)胞粘附的能力。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，雖然在細(xì)胞表面Cripto/ GRP78復(fù)合體缺乏情況下激活蛋白-A是細(xì)胞抑制劑，但是在細(xì)胞表面Cripto/GRP78復(fù)合體存在情況下激活蛋白-A和Nodal均增加細(xì)胞增殖。這些資料共同表明細(xì)胞表面GRP78對于Cripto信號是必需的，并且支持了這樣一個想法，即在正常胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生過程中 GRP78介導(dǎo)Cripto的功能。CriptoCripto是在發(fā)育和癌癥進(jìn)展過程中具有重要作用的GPI錨定信號蛋白(Strizzi 等，2005)。在發(fā)育中的小鼠胚胎中，Cripto對于前-后軸的正確建立和胚層形成和心臟發(fā)生是必需的。Cripto還被認(rèn)為是在多能性維持和分化中具有重要作用的胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志物(Adewumi等，2007 ；Strizzi等，2005)。雖然在正常成人組織中Cripto表達(dá)通常低或缺乏，但是發(fā)現(xiàn)在許多人實體腫瘤中水平高并且過表達(dá)促進(jìn)貼壁不依賴性生長、增殖、 存活、遷移、侵襲、血管發(fā)生和EMT (Strizzi等，2005)。Cripto還促進(jìn)體內(nèi)腫瘤生長，因為 MMTV-Cripto 和 WAP-Cripto 小鼠產(chǎn)生了乳腺腫瘤(Strizzi 等，2005 ；Strizzi 等，2004 ；Sun
10等，2005 ；Wechselberger等，2005)并且靶向Cripto的單克隆抗體降低腫瘤異種移植物在裸鼠中的生長(Adkins等，2003 ；Xing等，2004)。與其它生長因子類似，Cripto在從其GPI錨中斷裂之后可從細(xì)胞釋放，并且已經(jīng)證明可溶形式的Cripto活化促有絲分裂的ras/raf/MAPK和PI3K/Akt途徑(Strizzi 等，2005)。Cripto 還充當(dāng) TGF- β 超家族成員例如 Nodal (Schier, 2003 ；Shen, 2007)、 ⑶Fl (Cheng等，2003)和⑶F3 (Chen等，2006)的專一性共受體。該共受體功能是胚胎發(fā)育過程所必需的(Schier，2003 ；Strizzi等，2005)并且在成體中可調(diào)節(jié)正常組織生長和重塑， 如通過Cripto和Nodal在懷孕和哺乳的乳腺中共表達(dá)的事實所表明(Bianco等，2002a)。 Cripto共受體功能還促進(jìn)腫瘤生長，因為最新表明Nodal信號在促進(jìn)人黑素瘤和乳腺癌細(xì)胞的可塑性和致瘤性中起著關(guān)鍵的作用(Postovit等，2008 ；Topczewska等，2006)。Cripto 還抑制由激活蛋白(Adkins) (Gray 等，2003 ；Kelber 等，2008)和 TGF-β 1 (Gray 等，2006) 引起的信號并且抑制對人乳腺上皮細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞的TGF-βΙ-依賴性抗增殖作用 (Gray等，2006 ；Shani等，2008)。因此，Cripto可通過激活生長/存活途徑和通過抑制腫瘤抑制基因途徑促進(jìn)腫瘤發(fā)生(Strizzi等，2005)。GRP78發(fā)明人已經(jīng)鑒定出GRP78作為新的Cripto結(jié)合配偶體，并且表明這兩種蛋白質(zhì)形成抑制細(xì)胞抑制性TGF-β信號和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長的細(xì)胞表面復(fù)合體。GRP78已經(jīng)廣泛表征為輔助蛋白質(zhì)折疊、成熟和裝配的ER蛋白伴侶并且還協(xié)調(diào)未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(UPR) (Bernales等，2006 ；Lee, 2005 ；Lee, 2001)。GRP78在低氧和營養(yǎng)物缺乏條件下被誘導(dǎo)，并且發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中水平高(Lee，2007)。GRP78在腫瘤發(fā)生中起著必需作用的證據(jù)第一次出現(xiàn)于如下證明中，即用反義核酸對纖維肉瘤細(xì)胞中GRP78誘導(dǎo)的抑制致使它們在裸鼠中完全不能形成腫瘤，而它們的體外生長不受影響(Jamora等，1996)。此外，向纖維肉瘤和乳腺腫瘤細(xì)胞中遞送由GRP78啟動子驅(qū)動的自殺轉(zhuǎn)基因?qū)е峦耆麥缧∈笾械南喈?dāng)大的腫瘤 (Chen等，2000 ；Dong等，2004 ；Gazit等，1999)。因此，在實體腫瘤中建立的環(huán)境導(dǎo)致誘導(dǎo) GRP78并且其表達(dá)促進(jìn)腫瘤生長。雖然GRP78主要位于ER中，但是其可以作為跨膜蛋白質(zhì)存在(Reddy等，2003)并定位在人腫瘤細(xì)胞的質(zhì)膜上，這最初在以毒胡蘿卜內(nèi)酯處理后的人橫紋肌肉瘤細(xì)胞中證明 (Delpino和Castelli, 2002 ；Delpino等，1998)。隨后，細(xì)胞表面蛋白質(zhì)組的總圖譜證實 GRP78暴露于腫瘤細(xì)胞表面上(Shin等，2003)。的確，GRP78已經(jīng)顯示與MHC類I 一起在細(xì)胞表面上作為病毒的共受體起作用(Triantafilou等，2002)并且作為纖維蛋白溶酶原衍生的Kringle 5結(jié)構(gòu)域(Davidson等，2005)和活化的2-巨球蛋白(.2M) (Misra等，2002 ； Misra等，2004)的受體起作用。值得注意的是，GRP78受體功能顯示引起生長途徑的活化， 導(dǎo)致增加的細(xì)胞增殖和抗細(xì)胞凋亡行為(Misra等，2006 ；Misra等，2005 ；Misra等，2004)。 GRP78的此類受體功能從GRP78自身抗體的存在已經(jīng)與增加的前列腺癌進(jìn)展和降低的患者存活相聯(lián)系的觀察中描繪出癌癥相關(guān)的關(guān)聯(lián)性(Mintz等，2003)。此外，GRP78在癌癥進(jìn)展中的因果作用由如下發(fā)現(xiàn)支持，即靶向質(zhì)膜上GRP78的自殺肽被證明選擇性地殺死腫瘤細(xì)胞(Arap等，2004)。重要的是，這些發(fā)現(xiàn)驗證了細(xì)胞表面GRP78作為癌癥治療的推定的靶標(biāo)。Cripto和GRP78結(jié)合并引起促進(jìn)細(xì)胞增殖的細(xì)胞內(nèi)信號
基于Cripto結(jié)合位于腫瘤細(xì)胞表面上的GRP78的證據(jù)，發(fā)明人評價了 GRP78作為 Cripto受體起作用的可能性。與該假設(shè)相一致并且如下面實例所示，Cripto與細(xì)胞表面 GRP78的結(jié)合對于腫瘤細(xì)胞、ES細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞中的Cripto信號是必需的。Cripto與GRP78的結(jié)合導(dǎo)致幾個下游細(xì)胞內(nèi)信號途徑的活化。例如，如下面實例所示，Cripto與細(xì)胞表面GRP78的結(jié)合對于Cripto作為專一性Nodal共受體和激活蛋白和TGF-β信號的拮抗劑的功能是必需的。GRP78受體功能介導(dǎo)可溶性Cripto腫瘤生長因子活性，包括活化C-SrC/MAPK/PI3K途徑，增加細(xì)胞增殖，降低E-鈣黏著蛋白表達(dá)和降低細(xì)胞粘附。在Cripto/GRP78復(fù)合體存在情況下激活蛋白-A和Nodal具有促增殖作用，而當(dāng) Cripto/GRP78復(fù)合體被打斷時激活蛋白-A是抗增殖的。不希望被任何理論所束縛，這些發(fā)現(xiàn)表明，GRP78作為細(xì)胞表面Cripto受體/共因子起作用，這對于Cripto對激活蛋白/ Nodal/TGF- β和ΜΑΡΚ/ΡΙ3Κ信號途徑的發(fā)育和致癌作用是必需的。A. GRP78和Cripto在細(xì)胞表面上形成復(fù)合體,其不需要先前在ER中結(jié)合.如在下面實例中所證明，GRP78與Cripto在細(xì)胞表面上形成復(fù)合體，這是一個有用的以及潛在治療暗示的發(fā)現(xiàn)。該相互作用看起來是特異性的和排他性的，因為GRP78是所觀察到的與Cripto共純化的僅有的兩種細(xì)胞表面蛋白質(zhì)之一并且因為大小與Cripto相似的無關(guān)的跨膜蛋白不與GRP78共純化。同樣，在相同條件下I型和II型TGF-β受體均不能免疫沉淀GRP78。結(jié)果還表明，Cripto/GRP78結(jié)合不依賴于GRP78ER蛋白伴侶功能，因為在單獨(dú)的細(xì)胞群體中這些蛋白質(zhì)成熟和加工之后的無細(xì)胞環(huán)境中觀察到它們的相互作用。 該結(jié)果還支持在細(xì)胞表面上該復(fù)合體的存在，因為顯示在這些條件下結(jié)合Cripto的GRP78 來自于質(zhì)膜。此外，該結(jié)果表明對于該特異性結(jié)合相互作用所需的信息可以完全包含在這兩種蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)中，并且預(yù)期使用特異性地打斷它們相互作用的分子可以靶向腫瘤細(xì)胞。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源Cripto和內(nèi)源GRP78可作為來自小鼠胚性癌細(xì)胞的復(fù)合體分離。不希望被任何理論所束縛，該發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步支持了對于它們作為質(zhì)膜上信號共因子的相互作用的內(nèi)在作用，并且再一次地反對GRP78只是在ER中過表達(dá)Cripto的折疊中起作用的可能性。發(fā)明人還通過免疫細(xì)胞化學(xué)探究了 Cripto和GRP78在同一細(xì)胞中的定位并且發(fā)現(xiàn)Cripto和GRP78主要共定位于作為部分出現(xiàn)在細(xì)胞表面的斑點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)中。這些發(fā)現(xiàn)支持Cripto和GRP78在質(zhì)膜上一起起作用的結(jié)論，但是還表明，它們在對于信號蛋白質(zhì)所普遍的囊泡運(yùn)輸過程中是相關(guān)的。此外，細(xì)胞表面染色的斑點(diǎn)狀性質(zhì)與先前顯示兩種蛋白質(zhì)均與脂筏相關(guān)的報導(dǎo)一致(Triantafilou 和 Triantaf ilou，2003 ；Watanabe 等，2007)。B. GRP78作為細(xì)胞表面受體起作用GRP78在ER中作為蛋白伴侶和UPR的協(xié)調(diào)者起著保護(hù)性作用，但是它還在細(xì)胞表面上表達(dá)，其在細(xì)胞表面上的功能理解甚少。細(xì)胞表面GRP78已經(jīng)被鑒定為是人乳腺癌樣品中的腫瘤特異性抗原，并且在前列腺癌患者血清中發(fā)現(xiàn)了靶向GRP78的自身抗體并且顯示靶向GRP78的自身抗體充當(dāng)癌癥侵襲性增加的生物標(biāo)志物(Arap等，2004 ；Mintz等， 2003)。而且，由融合至凋亡誘導(dǎo)序列的GRP78結(jié)合模體構(gòu)成的嵌合肽抑制前列腺和乳腺癌小鼠模型中的腫瘤生長(Arap等，2004 ；Liu等，2007)。資料表明GRP78不僅僅是腫瘤細(xì)胞的選擇性細(xì)胞表面標(biāo)志物，而且還是介導(dǎo)Cripto對激活蛋白/Nodal/TGF-β和ΜΑΡΚ/ΡΙ3Κ 信號的效應(yīng)的受體/共因子。雖然對GRP78和激活蛋白/Nodal/TGF-β信號之間存在功能性聯(lián)系的發(fā)現(xiàn)似乎是獨(dú)特的，但是先前研究已經(jīng)表明細(xì)胞表面GRP78具有受體活性并且可以介導(dǎo)生長/存活信號。例如，在I-LN前列腺癌細(xì)胞中，2-巨球蛋白(2-M)通過細(xì)胞表面 GRP78發(fā)信號引起MAPK和PI3K途徑活化，產(chǎn)生促增殖和抗細(xì)胞凋亡行為(Misra等，2006 ； Misra等，2004)。來自前列腺癌患者血清的靶向GRP78的抗體類似地顯示出活化MAPK/PI3K 途徑并且增加細(xì)胞增殖。有趣的是，細(xì)胞表面GRP78也顯示在介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中經(jīng)由Akt的 GPI錨定的T-鈣黏著蛋白依賴性存活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有必不可少的作用(Philippova等， 2008)。Cripto、T-鈣黏著蛋白和GRP78每一個定位在脂筏中，表明GRP78受體功能也許局限在這些質(zhì)膜微域中。下面的結(jié)果表明，對于Cripto與TGF-β配體和它們的受體功能性相互作用的能力而言需要GRP78。不希望被任何理論所束縛，發(fā)明人預(yù)期，GRP78將充當(dāng)質(zhì)膜上的錨或支架，允許Cripto采用對于其與TGF-β配體以及它們的受體形成復(fù)合體并且改變它們的信號特性所需要的構(gòu)象或定向。Cripto的CFC介導(dǎo)與GRP78的結(jié)合以及與類型I信號受體 ALK4和ALK7的結(jié)合。不希望被任何理論所束縛，發(fā)明人預(yù)期，Cripto與GRP78或者ALK4/7 之間的結(jié)合相互作用不是彼此排斥的，而是GRP78將促進(jìn)Cripto與ALK4/7和配體如Nodal 和激活蛋白之間復(fù)合物的形成。GRP78除了作為Cripto對TGF-β配體信號的作用的必不可少的介導(dǎo)物的作用之外，結(jié)果還顯示GRP78與可溶性Cripto偶聯(lián)活化ΜΑΡΚ/ΡΙ3Κ途徑。 該發(fā)現(xiàn)表明，GRP78或者作為跨膜受體起作用，或者與一種或者兩者偶聯(lián)。雖然通常認(rèn)為 GRP78是局限在ER腔內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)，但是表明相當(dāng)大部分的GRP78作為具有兩個推定跨膜螺旋的整合膜蛋白質(zhì)存在(Reddy等，2003)。Reddy等對ER微粒體使用有限的胰蛋白酶消化表明，膜相關(guān)GRP78的N-末端和C-末端區(qū)在ER腔內(nèi)/細(xì)胞外，而蛋白質(zhì)的中間三分之一在細(xì)胞質(zhì)中(Reddy等，2003)。該罕見的跨膜拓?fù)鋵W(xué)與這樣的事實一致，即已經(jīng)表明細(xì)胞外蛋白質(zhì)結(jié)合GRP78的N-末端或C-末端附近(Davidson等，2005 ；Gonzalez-Gronow 等，2006 Jakobsen 等，2007 ；Philippova 等，2008).C. Cripto結(jié)合GRP78的N-末端附近下面的資料表明，Cripto結(jié)合至GRP78的最N-末端，因為N-末端N_20抗體封閉結(jié)合并且缺乏N-20表位的GRP78缺失突變體不能夠結(jié)合Cripto。N-20抗體還顯示競爭性的封閉Kringle 5 (Davidson等，2005)和T-鈣黏著蛋白(Philippova等，2008)的細(xì)胞效應(yīng)，表明這些蛋白質(zhì)結(jié)合GRP78的N-末端。此外，2-M和促增殖性前列腺癌患者來源自身抗體結(jié)合至定位于GRP78的鄰近N-20表位的N-末端的部位(Gonzalez-Gronow等，2006)。 這些細(xì)胞外蛋白質(zhì)的每一種結(jié)合GRP78最N-末端的事實表明它們具有相似的激活GRP78 受體功能的方式并且它們還彼此競爭對GRP78的結(jié)合。P. GRP78 結(jié)合 Cripto 的 CFC.Cripto和GRP78之間相互作用的特異性被如下證明進(jìn)一步支持，即Cripto的CFC 結(jié)構(gòu)域?qū)τ贕RP78結(jié)合似乎是必需的和足夠的。該發(fā)現(xiàn)是值得注意的，因為它表明Cripto 可通過其EGF-樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合TGF-β，如發(fā)明人先前證明的那樣(Gray等，2006)，而同時通過其CFC結(jié)構(gòu)域結(jié)合GRP78。發(fā)明人推測，包含Cripto、GRP78、TGF-β和TGF-β受體的更大級別的蛋白質(zhì)復(fù)合體也可形成并導(dǎo)致TGF-β信號的降低和/或改變。此外，Cripto 的CFC結(jié)構(gòu)域結(jié)合GRP78的觀察進(jìn)一步肯定了 GRP78對Cripto通過其它TGF- β配體例如 Nodal和激活蛋白調(diào)節(jié)信號的可能影響。例如，先前已經(jīng)表明，Cripto的CFC結(jié)構(gòu)域特異性地結(jié)合激活蛋白/Nodal I型受體ALK4(Yeo和衡行11^11，2001)，并且因此61^78可與41^4 競爭與Cripto的結(jié)合。備選地，GRP78可參與包含ALK4、Cripto和激活蛋白/Nodal的蛋白質(zhì)復(fù)合體。E. Cripto相關(guān)GRP78的靶向敲低抑制TGF- β信號.多條線的證據(jù)表明，Cripto和GRP78每一個促進(jìn)腫瘤形成并且兩種蛋白質(zhì)均選擇性地表達(dá)于癌細(xì)胞的細(xì)胞表面。如本文所述，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，先前已經(jīng)表明涉及促進(jìn)腫瘤生長的這兩種蛋白質(zhì)在細(xì)胞表面形成復(fù)合體。該發(fā)現(xiàn)將這些蛋白質(zhì)在物理上以及通過抑制 TGF-β信號的機(jī)制上關(guān)聯(lián)起來。最初，GRP78在TGF-β信號中的作用通過開發(fā)能夠降低與質(zhì)膜上Cripto結(jié)合的 GRP78水平的shRNA評價。該shRNA(SEQ ID NO :5)增強(qiáng)TGF-β依賴的Smad2磷酸化，這提供了內(nèi)源61^78可限制16 -0信號的證據(jù)。據(jù)發(fā)明人所知，該發(fā)現(xiàn)是GRP78影響TGF-β 信號的首次證明，并且重要的是，其構(gòu)成了一個新的機(jī)制，通過該機(jī)制細(xì)胞表面的GRP78可傳送其致瘤信息。該結(jié)果還與內(nèi)源Cripto在這些細(xì)胞中具有相似作用的先前證明不謀而合(Gray等，2006)并且與GRP78結(jié)合細(xì)胞表面上的Cripto以對抗生長抑制性的TGF-β信號的假設(shè)相一致。F. GRP78和Cripto協(xié)同減弱細(xì)朐抑制件TGF- β信號并財曾強(qiáng)人前歹U腺癌細(xì)朐的增葙.當(dāng)GRP78和Cripto —起表達(dá)時比單獨(dú)表達(dá)時更大程度地抑制TGF-β -依賴性 Smad2磷酸化作用的證明表明它們一起作用抑制TGF-β信號。不希望被任何理論所束縛， 由于Smad磷酸化的水平直接依賴于受體活化的程度，該結(jié)果表明Cripto和GRP78通過降低TGF-β激活其受體的能力發(fā)揮它們的抑制性效應(yīng)。這樣的解釋得到如下事實的進(jìn)一步支持，即Cripto和/或GRP78在這些細(xì)胞中的過表達(dá)不改變TGF-β受體水平。此外，未能檢測到GRP78與其I型或II型TGF- β受體之間的相互作用表明GRP78可通過結(jié)合Cripto 或者通過直接結(jié)合TGF-β或者兩者發(fā)揮其對TGF-β信號的抑制性效應(yīng)。發(fā)明人進(jìn)一步地證明，Cripto和GRP78協(xié)同起作用以增強(qiáng)細(xì)胞生長并抑制TGF- β 的細(xì)胞抑制性效應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞在貼壁依賴性條件下生長時，Cripto和GRP78每一個減弱 TGF-β的生長抑制性效應(yīng)，并且有趣的是，它們的共表達(dá)導(dǎo)致TGF-β性質(zhì)上從抗增殖轉(zhuǎn)變成促增殖。雖然對于Cripto和GRP78對細(xì)胞對TGF-β的增殖反應(yīng)的聯(lián)合作用的機(jī)制尚未確立，但是已經(jīng)顯示TGF-β在其細(xì)胞抑制效應(yīng)已經(jīng)喪失的條件下增加增殖/存活 (Paradali和Moustakas，2007)。同樣地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，Cripto和GRP78可協(xié)同封閉貼壁不依賴性條件下TGF-β的細(xì)胞抑制效應(yīng)。然而，與在單層中觀察到的不同，TGF-β處理不能增強(qiáng)共表達(dá)Cripto和GRP78的細(xì)胞在軟瓊脂中的生長。另一個差異是，當(dāng)GRP78和Cripto 單獨(dú)表達(dá)時并且更顯著地當(dāng)它們共表達(dá)時，在缺乏TGF-β處理的情況下，GRP78和Cripto 增加在軟瓊脂中的集落生長。因此，結(jié)果表明GRP78和Cripto以取決于特定生長條件而變的方式影響細(xì)胞生長和TGF-β反應(yīng)性。與貼壁不依賴性條件相反，在生長在貼壁依賴性條件下的細(xì)胞中，不同的信號途徑可響應(yīng)環(huán)境而活化。例如，腫瘤細(xì)胞利用信號途徑例如FAK和Src促進(jìn)貼壁不依賴性生長和避免失巢凋亡(Mitra和Schla印fer，2006)。因此，雖然特定的機(jī)制有待闡明， 但是從TGF-β發(fā)源的具有與特定生長環(huán)境明確相關(guān)的信號途徑的信號的集中可導(dǎo)致生長效應(yīng)的細(xì)微差別。不管發(fā)明人觀察的差別如何，然而，發(fā)明人已經(jīng)一致性的發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Cripto 和GRP78蛋白質(zhì)一起表達(dá)時Cripto和GRP78對TGF-β反應(yīng)性的效應(yīng)大于它們單獨(dú)表達(dá)時。因此，細(xì)胞表面Cripto-GRP78復(fù)合體表現(xiàn)出在貼壁依賴性和貼壁不依賴性生長條件下抑制細(xì)胞抑制性TGF-β反應(yīng)的明確且一致的作用。TGF-β是主要的腫瘤阻抑因子并且其細(xì)胞抑制功能的喪失與腫瘤起始和進(jìn)展相關(guān)(Pardali和Moustakas，2007)。這種生長抑制性TGF-β信號的喪失將源于受體信號的減少，Smad功能受損或者轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物或其它靶標(biāo)的破壞，它們一起構(gòu)成了細(xì)胞抑制性程序 (Siegel和Massague，2003)。的確，TGF-β信號頻繁地加重了抵抗抗增殖效應(yīng)的腫瘤的生長和擴(kuò)散(Pardali和Moustakas，2007)。Cripto和GRP78每一種已經(jīng)單獨(dú)涉及到人癌進(jìn)展并且這些蛋白質(zhì)中的每一個在腫瘤細(xì)胞表面上選擇性表達(dá)。在此發(fā)明人已經(jīng)提出證據(jù)證明這兩種蛋白質(zhì)在細(xì)胞表面上物理性相互作用。發(fā)明人還進(jìn)一步提供了證明，即它們協(xié)同增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞生長并且逆轉(zhuǎn)TGF-β的腫瘤阻抑因子效應(yīng)。不希望被任何理論所束縛，這些結(jié)果支持這樣的一個想法，即該復(fù)合體導(dǎo)致惡性腫瘤增加并且其通過在受體水平抑制TGF-β 信號賦予腫瘤細(xì)胞以競爭性增殖的優(yōu)勢。依據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，預(yù)期細(xì)胞表面Cripto_GRP78復(fù)合體代表著具有重要治療潛能的稱心如意的靶標(biāo)，因為其具有僅影響癌癥細(xì)胞而不影響其正常組織對等物的固有選擇性優(yōu)勢。G. GRP78/Cripto/TGF~ β 配體結(jié)果顯示，GRP78介導(dǎo)Cripto的共受體功能并且涉及細(xì)胞表面GRP78在胚胎發(fā)生和干細(xì)胞調(diào)節(jié)過程中的新的和必不可少的作用。在胚胎發(fā)育過程中Cripto作為Nodal和相關(guān)TGF- β配體的共受體起著至關(guān)重要的作用，并且在斑馬魚和小鼠中的遺傳學(xué)研究已經(jīng)表明Cripto和相關(guān)的EGF-CFC蛋白質(zhì)對于中胚層和內(nèi)胚層形成、心臟發(fā)生和左/右不對稱性的建立是必不可少的。Cripto還已經(jīng)被公認(rèn)為是胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志物并且在干細(xì)胞維持和分化中起著重要的作用。從Cripto-無效小鼠產(chǎn)生的ESC不能夠經(jīng)歷心肌發(fā)生和自發(fā)分化成神經(jīng)元。如在下面實例中所示，內(nèi)源GRP78是Cripto信號包括Cripto-依賴性Nodal 信號的必需的介導(dǎo)者。此外，發(fā)明人提供了證明，即GRP78出現(xiàn)在人ES細(xì)胞的表面上，它在表面上與Cripto共定位。對hES細(xì)胞上GRP78的抗體阻斷封閉了 Nodal信號，表明在這些細(xì)胞中對于Nodal信號需要GRP78。這些結(jié)果支持靶向Cripto和GRP78之間的界面將有助于對hES細(xì)胞需要優(yōu)先分化成神經(jīng)元的神經(jīng)變性疾病的基于細(xì)胞的治療。數(shù)項研究也支持Cripto對促進(jìn)腫瘤表型的激活蛋白/Nodal/TGF-β信號的調(diào)節(jié)作用(Adkins 等，2003 ；Gray 等，2003 ；Gray 等，2006 ；Salomon, 2006 ；Shani 等，2008 ；Shen, 2003 ；Shukla 等，2008 ；Topczewska 等，2006)。Cripto 抑制 TGF- β 信號以及 TGF- β 對乳腺上皮細(xì)胞(Gray等，2006)和原代角質(zhì)形成細(xì)胞(Shukla等，2008)的細(xì)胞抑制性效應(yīng)。 Cripto還抑制TGF- β對前列腺癌細(xì)胞的抗增殖效應(yīng)，這是一種被GRP78過表達(dá)所增強(qiáng)的效應(yīng)(Shani等，2008)。與TGF-β —樣，激活蛋白-A抑制大多數(shù)上皮細(xì)胞的增殖并且已經(jīng)提出激活蛋白/TGF-β信號的拮抗作為致癌性Cripto的機(jī)制。與之相反，已經(jīng)證明Nodal促進(jìn)黑素瘤和乳腺癌可塑性和致瘤性(Hendrix等，2007 ；Postovit等，2008 ；Salomon, 2006 ； Topczewska等，2006)并且結(jié)果表明這將需要經(jīng)由Cripto和GRP78的信號。在本發(fā)明中， 發(fā)明人已經(jīng)證明使用shRNA或N-20GRP78封閉性抗體靶向NCCIT上的細(xì)胞表面GRP78消除了 Cripto對通過激活蛋白、TGF-β和Nodal的信號的影響。該影響可能是通過Cripto和GRP78之間的相互作用介導(dǎo)的，因為將兩種蛋白質(zhì)一起敲低比將任一個蛋白質(zhì)單獨(dú)敲低具有更深遠(yuǎn)的影響。重要的是，這是內(nèi)源Cripto抑制激活蛋白-A和激活蛋白-B信號的首次證明并且證實了內(nèi)源Cripto阻斷通過TGF-β的信號的先前證明。這些發(fā)現(xiàn)還支持GRP78 具有作為Cripto共因子的新作用，這對于Cripto對激活蛋白/Nodal/TGF-β信號的潛在致癌效應(yīng)是必需的。H. GRP78介導(dǎo)Cripto牛長因子活件Cripto除了對激活蛋白/Nodal/TGF-β信號具有效應(yīng)外，還激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇-3-激酶(ΡΙ3Κ)途徑(De Santis等，1997 ；Ebert等，1999 ； Strizzi等，2005)。這些途徑在大多數(shù)人癌癥中被異?；罨⑶覐V泛認(rèn)為它們具有促進(jìn)多種致瘤后果包括增加腫瘤細(xì)胞存活和增殖的能力(Dhillon等，2007 ；Shaw和Cantley， 2006)。已經(jīng)顯示，用可溶性Cripto處理HC-Il乳腺上皮細(xì)胞導(dǎo)致SH2-銜接蛋白Shc的酪氨酸磷酸化、Shc與Grb2的結(jié)合以及p42/44Erk/MAPK途徑的活化(Kannan等，1997)?？扇苄訡ripto還引起PI3K的p85調(diào)節(jié)亞基的磷酸化，導(dǎo)致SiHa頸癌細(xì)胞中Akt的磷酸化和活化(Ebert等，1999)。Cripto不結(jié)合EGF受體家族成員(Kannan等，1997)，并且據(jù)報導(dǎo) MAPK/PI3K途徑被可溶性Cripto的活化是ALK4-不依賴性的(Bianco等，2002b)。在用可溶性Cripto處理細(xì)胞之后c-Src被活化并且c_Src活化對于MAPK和PI3K途徑的Cripto 依賴性活化是必需的(Bianco等，2003)。此外，據(jù)報導(dǎo)GPI-錨定蛋白聚糖磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1結(jié)合Cripto并促進(jìn)Cripto依賴性c-Src活化(Bianco等，2003)。然而，尚未鑒定出介導(dǎo)c-Src活化和MAPK/PI3K信號的跨膜Cripto受體。下面的資料證明細(xì)胞表面GRP78 介導(dǎo)Cripto的腫瘤生長因子活性。Cripto/GRP78 復(fù)合體還影響 Akt/ErK 信號。對 NCCIT 細(xì)胞中 Cripto/GRP78 復(fù)合體的敲低或抗體破壞阻斷了可溶性Cripto誘導(dǎo)Akt、GSK3b和p42/44的磷酸化。I. Cripto/GRP78復(fù)合體轉(zhuǎn)換激活蛋白-A和Nodal的增殖效應(yīng)響應(yīng)于激活蛋白、Nodal和TGF- β配體的Smad2/3信號取決于細(xì)胞類型和細(xì)胞環(huán)境具有對細(xì)胞增殖、凋亡和分化可變性并且甚至具有相反的作用。Smad2/3途徑的腫瘤阻抑制因子功能已經(jīng)被廣泛表征，并且從其具有抑制多種細(xì)胞類型增殖的能力以及在一些情況下引起終末分化或凋亡的能力得出來的?，F(xiàn)在已經(jīng)廣泛確立，Smad2/3信號下游的細(xì)胞抑制性轉(zhuǎn)錄程序?qū)τ谡５慕M織穩(wěn)態(tài)和腫瘤抑制是至關(guān)重要的，并且已經(jīng)在數(shù)個類型的人癌癥，包括乳腺癌中觀察到該途徑的破壞或改變。然而，激活蛋白/Nodal/TGF-β配體在腫瘤細(xì)胞已經(jīng)變得抵抗Smad2/3途徑的抗增殖效應(yīng)的條件下加重腫瘤表型。腫瘤細(xì)胞通常分泌高水平的這些配體，這些配體作用于腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境內(nèi)的其它細(xì)胞類型包括基質(zhì)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞。在該環(huán)境中Smad2/3的活化可引起增強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞增殖、 運(yùn)動性、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)以及增加的血管發(fā)生和降低的免疫監(jiān)視。加在一起， 這些效應(yīng)可導(dǎo)致腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的增強(qiáng)并且產(chǎn)生針對阻斷人癌癥中TGF-β信號的治療成就。發(fā)明人還顯示，取決于細(xì)胞表面Cripto/GRP78復(fù)合體的存在與否，激活蛋白-A 對細(xì)胞增殖具有相反的作用。在空載體感染的NCCIT細(xì)胞和其中Cripto/GRP78復(fù)合體完整的Cripto-過表達(dá)性MCFlOA細(xì)胞中激活蛋白-A具有促增殖效應(yīng)。相反，當(dāng)通過敲低或 N-20抗體阻斷將這些細(xì)胞中的Cripto/GRP78復(fù)合體破壞時，激活蛋白-A具有抗增殖效應(yīng)。與激活蛋白-A —樣，在表達(dá)完整Cripto/GRP78復(fù)合體的這些細(xì)胞中，Nodal增強(qiáng)增殖。然而，與激活蛋白-A不同，Nodal對其中Cripto/GRP78復(fù)合體被破壞的細(xì)胞的增殖沒有影響。 激活蛋白-A和Nodal之間的這種差異可能反映出這樣的一個事實，即Cripto對于Nodal 信號是必需的而對于激活蛋白-A信號是不需要的。這些資料表明，細(xì)胞表面上的Cripto/ GRP78復(fù)合體可通過促進(jìn)Nodal的促有絲分裂效應(yīng)并引起激活蛋白-A性質(zhì)上從細(xì)胞抑制轉(zhuǎn)變成促增殖而促進(jìn)腫瘤生長。因此，Cripto引起從上皮-細(xì)胞抑制性向間質(zhì)-促增殖性轉(zhuǎn)變的細(xì)胞反應(yīng)，并且這類似于當(dāng)腫瘤細(xì)胞變成對Smad2/3的細(xì)胞抑制效應(yīng)抵抗時所觀察到的情況。這些結(jié)果暗示了通過它激活蛋白和Nodal變成促腫瘤發(fā)生性的機(jī)制，并且該效應(yīng)似乎是GRP78依賴性的。有趣的是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，激活蛋白-A和Nodal在Cripto/GRP78復(fù)合體存在下是促有絲分裂性的，然而在這些復(fù)合體缺乏情況下激活蛋白-A具有細(xì)胞抑制性效應(yīng)并且Nodal對增殖無影響。因此，細(xì)胞表面Cripto/GRP78復(fù)合體可促進(jìn)MAPK/PII 和Smad2/3途徑之間的交叉通訊，使得細(xì)胞抑制性Smad2/3信號在性質(zhì)上變成促增殖性的。 因此，細(xì)胞表面Cripto/GRP78復(fù)合體作為細(xì)胞信號節(jié)點(diǎn)起作用以調(diào)節(jié)多種腫瘤和干細(xì)胞行為。如下事實支持Cripto和GRP78之間存在生物學(xué)相互作用，即Cripto和GRP78具有重疊的分布和功能。Cripto (Ding等，1998)和GRP78 (Luo等，2006)敲除小鼠均是早期胚胎致死性的。Cripto還可調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞行為(MinChiotti，20(^)并且發(fā)明人在此已經(jīng)證明 Cripto和GRP78在干細(xì)胞中共定位并且協(xié)同調(diào)節(jié)激活蛋白和Nodal信號。就此而論，發(fā)現(xiàn) GRP78對于作為多能性干細(xì)胞前體的胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的增殖和存活是必需的(Luo等，2006)。 此外，Cripto (Xu等，1998 ；Xu等，1999)和GRP78 (Mao等，2006)在發(fā)育中的心臟中顯著表達(dá)并且它們中的每一個已經(jīng)涉及到心臟發(fā)生。最后，向Cripto—樣(Strizzi等，2005)，GRP78 增加了惡性腫瘤并且通過增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞存活、增殖和血管發(fā)生向腫瘤細(xì)胞提供了競爭性生長優(yōu)勢(Dong等，2008 ；Lee, 2007)。重要的是，Cripto和GRP78均選擇性地表達(dá)于人腫瘤細(xì)胞的質(zhì)膜上并在它們的正常組織對等物上不表達(dá)，并且它們中的每一個均獨(dú)立地驗證可作為體內(nèi)的腫瘤特異性治療靶標(biāo)。因此，Cripto/GRP78復(fù)合體代表著具有顯著治療潛力的新的且稱心如意的靶標(biāo)。IV. Cripto/GRP78相互作用的抑制劑Cripto/GRP78相互作用可以通過抑制Cripto/GRP78復(fù)合物形成和/或功能的Cripto靶向性化合物和/或GRP78靶向性化合物選擇性地抑制。在某些實施方案中， Cripto靶向性或GRP78靶向性化合物可以是抗體、雙功能抗體、適體、抗體片段例如f (ab) 或f (ab)2區(qū)、抑制性肽、小分子、反義分子或siNA(例如siRNA或shRNA)。這些化合物可以由技術(shù)人員通過測試Cripto/GRP78結(jié)合和/或下游信號被候選化合物改變的篩選法產(chǎn)生。 在某些實施方案中，Cripto靶向性化合物可特異性影響或結(jié)合Cripto的CFC結(jié)構(gòu)域并且抑制Cripto/GRP78結(jié)合和/或信號。在另外的實施方案中，GRP78靶向性化合物可與GRP78 的N-末端區(qū)或最N-末端區(qū)，例如GRP78的N-20抗體表位結(jié)合或相互作用。A.抗體本發(fā)明的某些方面涉及選擇性結(jié)合Cripto和/或GRP78的一種或更多種抗體。這些抗體可以用于治療癌癥(例如黑素瘤、肝癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、肺癌、NSCLC、頭頸癌癥)。 此外，這些抗體可用于評估Cripto和/或GRP78在組織中，例如癌性組織或癌前組織中的表達(dá)。在某些實施方案中，N-20抗體或結(jié)合GRP78的N-20表位的抗體可用于靶向GRP78并破壞Cripto/GRP78復(fù)合體的形成。在某些實施方案中，希望產(chǎn)生抗所鑒定靶向性肽或它們的受體的抗體。適當(dāng)?shù)陌邢蛐噪幕蚴荏w或其部分可通過連接體、多連接體或衍生的氨基酸與一種或更多種試劑偶聯(lián)、結(jié)合、連接、綴合或化學(xué)交聯(lián)。這可以如下開展以致于產(chǎn)生雙特異性或多價組合物或疫苗。進(jìn)一步地構(gòu)想，在制備這些組合物中使用的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的并且將適宜向人施用，即可藥用。優(yōu)選的試劑是載體鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)。術(shù)語“抗體”用于指具有抗原結(jié)合區(qū)的任何抗體樣分子，并且包括抗體片段例如 Fab，、Fab、F(ab，)2、單結(jié)構(gòu)域抗體(DAB)、Fv、scFv(單鏈Fv)等等。用于制備和使用多種基于抗體的構(gòu)建體和片段的技術(shù)在本領(lǐng)域眾所周知。用于制備和表征抗體的方法也是本領(lǐng)域眾所周知的(見例如Harlow和Lane，1988 ；通過參考并入本文)。在本發(fā)明的多個實施方案中，可以針對噬菌體展示文庫得到和篩選來自一個或更多個患病個體的循環(huán)抗體。結(jié)合循環(huán)抗體的靶向性肽可充當(dāng)天然抗原，例如位于靶組織內(nèi)皮細(xì)胞表面上的受體蛋白質(zhì)的模擬位。例如，在患有前列腺癌個體中的循環(huán)抗體可以結(jié)合特異性或選擇性地位于前列腺腫瘤中的抗原。如在下面更詳細(xì)地討論，可以通過噬菌體展示針對此類抗體鑒定靶向性肽。此類靶向性肽可以用于通過例如使用已知技術(shù)如免疫親和純化、Western印跡、電泳后的條帶切除和蛋白質(zhì)/肽測序和/或計算機(jī)同源性檢索，鑒定被抗體識別的天然抗原。技術(shù)人員將認(rèn)識到，針對疾病特異性或選擇性抗原的抗體可用于多種應(yīng)用中，例如疾病狀態(tài)的檢測、診斷和/或預(yù)后、患病組織成像和/或治療劑的靶向遞送。在某些實施方案中，Cripto和/或GRP78抗體是單克隆抗體。單克隆抗體(MAb) 被認(rèn)為具有某些優(yōu)勢，例如重現(xiàn)性和大規(guī)模生產(chǎn)，并且通常優(yōu)選使用它們。因此，本發(fā)明提供人、小鼠、猴、大鼠、倉鼠、兔甚至雞來源的單克隆抗體。由于小鼠單克隆抗體具有易制備性和立即可用性，因此常優(yōu)選小鼠單克隆抗體?！叭嗽椿笨贵w是本發(fā)明特別考慮的，它們是攜帶有人恒定區(qū)和/或可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的來自小鼠、大鼠或其它物種的嵌合抗體、雙特異性抗體、重組和工程化抗體及其片段。用于開發(fā)針對患者疾病的“客戶定制”抗體的方法同樣也是已知的并且此類客戶定制的抗體也在考慮之內(nèi)。1.用于抗體產(chǎn)生的方法可以使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)制備Cripto和/或GRP78選擇性抗體。例如，用于產(chǎn)生單克隆抗體(MAb)的方法通常以與制備多克隆抗體的方法相同的路線開始。簡言之，以根據(jù)本發(fā)明的LEE或CEE組合物免疫動物并從所免疫動物收集抗血清來制備多克隆抗體。廣范圍的動物種類可以用于產(chǎn)生抗血清。有代表性地，用于產(chǎn)生抗血清的動物是兔、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠或山羊。動物的選擇可以根據(jù)操作的難易程度、成本或預(yù)期的血清量決定，這將是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。為了產(chǎn)生更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)和幫助產(chǎn)生抗血清，特定免疫原成分的免疫原性可以通過使用稱作佐劑的非特異性免疫反應(yīng)刺激劑增強(qiáng)。適宜的佐劑包括所有可接受的免疫刺激化合物，例如細(xì)胞因子、趨化因子、輔因子、毒素、合胞體、合成的組合物或者編碼此類佐劑的LEE或CEE。可以使用的佐劑包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、γ -干擾素、GMCSP、BCG、氫氧化鋁、MDP化合物如thur-MDP和nor_MDP、CGP (MTP-PE)、脂質(zhì)A和單磷酰脂質(zhì)A (MPL)。還考慮了 RIBI，其包含在2%鯊烯/Tween 80中的從細(xì)菌提取的MPL、海藻糖二霉菌酸酯(TDM) 和細(xì)胞壁支架(CWQ三種成分。甚至可以使用MHC抗原。示例性的常常優(yōu)選的佐劑包括完全弗氏佐劑(包含殺死的結(jié)核分枝桿菌的非特異性的免疫反應(yīng)刺激劑)、不完全弗氏佐劑和氫氧化鋁佐劑。除了佐劑之外，還希望共同施用已經(jīng)顯示上調(diào)T細(xì)胞免疫或者下調(diào)阻抑因子細(xì)胞活性的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(BRM)。此類BRM包括，但不限于，西咪替丁(CIM ； 1200mg/d) (Smith/ Kline, PA)；低劑量環(huán)磷酰胺(CYP ；300mg/m2) (Johnson/Mead, NJ)，細(xì)胞因子例如Y -干擾素、IL-2或IL-12或者編碼涉及免疫輔助功能蛋白質(zhì)的基因，例如B-7。用于產(chǎn)生多克隆抗體的免疫原組合物的量根據(jù)免疫原的性質(zhì)以及用于免疫的動物而變化?？刹捎枚喾N途徑施用免疫原，包括但不限于皮下、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、表皮內(nèi)、靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)?？梢酝ㄟ^在免疫后不同點(diǎn)從所免疫動物抽取血液檢測多克隆抗體的產(chǎn)生。還可以給于第二次加強(qiáng)劑量(例如注射提供)。重復(fù)加強(qiáng)或滴定過程直到達(dá)到適宜的滴度。當(dāng)?shù)玫剿释降拿庖咴詴r，可將免疫的動物放血并將分離的血清儲存，和 /或動物可以用于產(chǎn)生MAb。對于兔多克隆抗體的產(chǎn)生，可以通過耳靜脈或備選地通過心臟穿刺從動物中取血。使所取出的血液凝固，然后離心從全細(xì)胞和血液凝塊中分離血清部分。血清可以用于多種應(yīng)用中，或者通過眾所周知的方法純化想要的抗體部分，例如使用另一抗體即結(jié)合至固體基質(zhì)上的肽的親和層析或者通過使用例如蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G層析?？梢酝ㄟ^使用眾所周知的技術(shù)，例如在美國專利4，196，265中例證的那些技術(shù)容易地制備MAb，該美國專利通過參考并入本文。有代表性地，該技術(shù)涉及以所選擇的免疫成分，例如純化或部分純化的蛋白質(zhì)、多肽、肽或結(jié)構(gòu)域免疫適宜的動物，而不管它是野生型的或者突變體成分。免疫成分以有效刺激抗體產(chǎn)生性細(xì)胞的方式施用。用于產(chǎn)生單克隆抗體(MAb)的方法通常以與產(chǎn)生多克隆抗體的方法相同的路線開始。嚙齒類例如小鼠和大鼠是優(yōu)選的動物，然而，也可以使用兔、綿羊或青蛙細(xì)胞。使用大鼠可以提供某些優(yōu)勢(Goding，1986，第60-61頁)，但是優(yōu)選小鼠，BALB/c小鼠是最優(yōu)選的，因為這是最常規(guī)使用的并且通常得到更高百分比的適宜融合體。通常如上所述，以抗原注射動物。抗原可以與佐劑混合，例如弗氏完全佐劑或不完全佐劑。以同一抗原或者編碼抗原的DNA進(jìn)行加強(qiáng)施用將以大約兩周的間隔進(jìn)行。在免疫之后，選擇具有產(chǎn)生抗體潛能的體細(xì)胞，特別是B淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞)用于 MAb生產(chǎn)方案中。這些細(xì)胞可以從活組織檢查的脾臟、扁桃體或淋巴結(jié)中得到，或者從外周血液樣品得到。脾臟細(xì)胞和外周血細(xì)胞是優(yōu)選的，前者是因為它們是處于分裂中的漿母細(xì)胞階段的抗體產(chǎn)生性細(xì)胞的豐富來源，并且后者是因為外周血容易得到。通常將免疫一組動物，并且具有最高抗體滴度的動物的脾臟將被取出并通過用注射器將脾臟勻漿得到脾臟淋巴細(xì)胞。有代表性地，來自所免疫小鼠的脾臟包含大約5X107 至2X108個淋巴細(xì)胞。然后將來自所免疫動物的抗體產(chǎn)生性B淋巴細(xì)胞與永生化骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合，骨髓瘤細(xì)胞通常與所免疫動物為同一物種。適用于雜交瘤產(chǎn)生融合方法中的骨髓瘤細(xì)胞系優(yōu)選地是非抗體產(chǎn)生性的、具有高的融合效率和酶缺乏，酶缺乏使得它們不能夠在支持僅想要的融合細(xì)胞(雜交瘤)生長的某些選擇培養(yǎng)基中生長。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多骨髓瘤細(xì)胞中的任何一種(Goding，第65-66 頁，1986 ；Campbell，第75-83頁，1984)。例如，當(dāng)免疫的動物是小鼠時，可以使用P3-X63/ Ag8、X63-Ag8. 653、NS1/1. Ag 41、Sp210_Agl4、F0、NSO/U、MPC-IU MPC11-X45-GTG 1. 7 和 S194/5XX0Bul ；對于大鼠可使用 R210. RCY3,Y3-Ag 1. 2. 3、IR983F 和 4B210 ；并且與人細(xì)胞融合體相關(guān)的可使用 U-266、GM1500-GRG2、LICR-L0N-HMy2 和 UC7^_6。一個優(yōu)選的小鼠骨髓瘤細(xì)胞是NS-I骨髓瘤細(xì)胞系(也稱作P3-NS-l-Ag4_l)，其可以通過請求細(xì)胞系庫編號GM3573容易地從NIGMS人基因突變細(xì)胞庫中得到?？梢允褂玫牧硪粋€小鼠骨髓瘤細(xì)胞系是8-氮鳥嘌呤抗性小鼠骨髓瘤SP2/0非生產(chǎn)者細(xì)胞系。用于產(chǎn)生抗體產(chǎn)生性脾臟或淋巴結(jié)細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的雜合體的方法通常包括在促進(jìn)細(xì)胞膜融合的一種試劑或多種試劑(化學(xué)的或電的)存在下以21的比例混合體細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞，雖然比例可以大約20 1至大約1 1變化。使用仙臺病毒的融合方法已經(jīng)由Kohler和Milstein描述(1975 ；1976)，并且使用聚乙二醇(PEG)的那些方法，例如37% (v/v)PEG,由Gefter等描述(1977)。電誘導(dǎo)融合方法的使用也是適當(dāng)?shù)?Goding, 第 71-74 頁，1986)。融合過程通常以低的頻率，大約1X10_6至1X10_8，產(chǎn)生能存活的雜合體。然而， 這不存在難題，因為通過在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可存活的融合雜合體可與親本、未融合的細(xì)胞(特別是正常情況下將連續(xù)無限分裂的未融合骨髓瘤細(xì)胞)區(qū)別開來。選擇性培養(yǎng)基通常是在組織培養(yǎng)基中包含阻斷核苷酸從頭合成的試劑的培養(yǎng)基。示例性且優(yōu)選的試劑是氨基蝶呤、甲氨蝶呤和偶氮絲氨酸。氨基蝶呤和甲氨蝶呤阻斷嘌呤和嘧啶兩者的從頭合成， 而偶氮絲氨酸僅阻斷嘌呤的合成。當(dāng)使用氨基蝶呤或甲氨蝶呤時，培養(yǎng)基補(bǔ)充有次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷作為核苷酸的來源(HAT培養(yǎng)基)。當(dāng)使用偶氮絲氨酸時，培養(yǎng)基補(bǔ)充有次黃嘌呤。優(yōu)選的選擇培養(yǎng)基是HAT。僅能夠利用核苷酸補(bǔ)救途徑的細(xì)胞能夠在HAT培養(yǎng)基中存活。骨髓瘤細(xì)胞缺乏補(bǔ)救途徑的關(guān)鍵酶，例如次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)，并且因此它們不能存活。B細(xì)胞能夠利用該途徑，但是它們在培養(yǎng)時具有有限的壽命并通常在大約兩周內(nèi)死亡。因此，能夠在選擇培養(yǎng)基中存活的僅有的細(xì)胞是從骨髓瘤和B細(xì)胞形成的那些雜合體細(xì)胞。這種培養(yǎng)提供一群雜交瘤，從這些雜交瘤中可以選擇特異性的雜交瘤。有代表性地，雜交瘤的選擇可以如下開展，即通過在微量滴定板中進(jìn)行單克隆稀釋來培養(yǎng)細(xì)胞，接著測試各個克隆上清液(大約兩周至三周之后)的預(yù)期反應(yīng)性。測定將是敏感的、簡單的和快速的，例如放射免疫測定、酶免疫測定、細(xì)胞毒性測定、空斑測定、斑點(diǎn)免疫結(jié)合測定等等。然后將所選擇的雜交瘤進(jìn)行連續(xù)稀釋并克隆成各個抗體-產(chǎn)生性細(xì)胞系，然后克隆可以無限繁殖以提供MAb。細(xì)胞系可以用來以兩個基本方式生產(chǎn)MAb。第一，可將雜交瘤樣品注射入(常常注射入腹腔)用于提供最初融合的體細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的組織相容性動物類型中(例如同基因小鼠中)。任選地，在注射前，動物以碳?xì)浠衔?，特別是油類例如降植烷(四甲基十五烷)致敏。所注射的動物產(chǎn)生分泌由所融合細(xì)胞雜合體產(chǎn)生的特異性單克隆抗體的腫瘤。然后可以抽取動物的體液，例如血清或腹水，以提供高濃度的MAb。第二，各個細(xì)胞系可體外培養(yǎng)，其中MAb可天然地分泌進(jìn)入培養(yǎng)基中，從培養(yǎng)基中可以容易地得到高濃度的MAb。如果需要的話，通過任一種方法產(chǎn)生的MAb可以使用過濾、離心和多種層析方法如HPLC或親和層析進(jìn)一步純化。本發(fā)明單克隆抗體的片段可以通過包括用酶例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化的方法和/或通過化學(xué)還原斷裂二硫鍵從如此產(chǎn)生的單克隆抗體得到。備選地，本發(fā)明包括的單克隆抗體片段可以使用自動肽合成儀合成。還考慮了可使用分子克隆方法產(chǎn)生單克隆。在一個實施方案中，從所免疫動物脾臟分離的RNA制備組合的免疫球蛋白噬菌體文庫，并且通過使用表達(dá)抗原的細(xì)胞和對照細(xì)胞淘洗選擇表達(dá)適當(dāng)抗體的噬菌粒。該方法相對于常規(guī)雜交瘤技術(shù)的優(yōu)勢是在一輪中可以產(chǎn)生和篩選大約IO4次量的抗體，并且通過H和L鏈組合產(chǎn)生新的特異性，這進(jìn)一步提高發(fā)現(xiàn)適當(dāng)抗體的機(jī)會。在另一實例中，LEE或CEE可以用于在無細(xì)胞體系中體外產(chǎn)生抗原。這些可以用作用于篩選單鏈抗體文庫的靶標(biāo)。這可以極其快速地鑒定許多不同的抗體，而無需使用動物。備選地，本發(fā)明包括的單克隆抗體片段可以使用自動肽合成儀合成，或者通過在大腸桿菌中表達(dá)全長基因或基因片段合成。全部為人的單克隆抗體可以使用轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)生，例如包括攜帶人IgH和 Igkappa基因座部分，包括大多數(shù)可變區(qū)庫，對于Cmicro、Cdelta和Cgammal、Cgamma2或 Cgamma4任一的基因，以及對于它們的功能必需的順式元件的種系配置的巨堿基大小YAC 的XenoMouse (Green，1999)?？梢苑敝吃谶z傳背景上小鼠免疫球蛋白產(chǎn)生不足的IgH和 Igkappa轉(zhuǎn)基因。在XenoMouse品系中的Ig轉(zhuǎn)基因上編碼的大且復(fù)雜的人可變區(qū)庫支持開發(fā)大的外周B細(xì)胞分隔和產(chǎn)生多種與來自成人相似的初次免疫庫。以人抗原免疫 XenoMouse小鼠通常導(dǎo)致強(qiáng)烈的次級免疫反應(yīng)，這可以最終作為具有亞納摩爾親和性的一大組抗原特異性的完全人IgGkappa mAb收集到。來自XenoMouse動物的單克隆抗體已經(jīng)顯示在體外和體內(nèi)均具有治療潛能，并且基于人臨床試驗似乎具有正常人抗體的藥物代謝動力學(xué)。2.抗體結(jié)合物本發(fā)明還提供選擇性結(jié)合Cripto或GRP78的連接至至少一種試劑形成抗體結(jié)合物抗體，通常是單克隆類型的抗體。為了增加抗體分子作為診斷或治療劑的有效性，抗體可以與至少一個想要的分子或部分共價結(jié)合或復(fù)合。此類分子或部分可以是，但不限于，至少一個效應(yīng)子或報告分子。效應(yīng)子分子包括具有所希望活性如細(xì)胞毒性活性的分子。連接至抗體的效應(yīng)子分子的非限定性實例包括毒素、抗腫瘤劑、治療酶、放射性標(biāo)記的核苷酸、抗病毒劑、螯合劑、細(xì)胞因子、生長因子和寡或多核苷酸。相反，報告分子被定義為可使用測定法檢測的任何部分。與抗體綴合的報告分子的非限定性實例包括酶、放射性標(biāo)記、半抗原、 熒光標(biāo)記、磷光分子、化學(xué)發(fā)光分子、生色團(tuán)、發(fā)光分子、光親和性分子、有色顆?；蛘吲潴w， 例如生物素。Cripto和/或GRP78抗體可以用作抗體結(jié)合物的基礎(chǔ)。除了抗體分子的抗原結(jié)合位點(diǎn)之外，抗體分子中用于結(jié)合生物活性分子的位點(diǎn)包括位于可變結(jié)構(gòu)域中的可結(jié)合病原體、B細(xì)胞超抗原、T細(xì)胞共受體⑶4和HIV-I包膜的位點(diǎn)(Sasso等，1989 ；Shorki等，1991 ；SiIvermann 等，1995 ；Cleary 等，1994 ；Lenert 等，1990 ；Berberian 等，1993 ；Kreier 等，1991)。此外，可變結(jié)構(gòu)域參與抗體自身結(jié)合(Kang等，1988)，并且包含由抗抗體識別的表位(獨(dú)特位)(Kohler等，1989)。某些抗體結(jié)合物的實例是其中抗體被連接至可檢測標(biāo)記的那些結(jié)合物。“可檢測標(biāo)記”是由于它們的特異性功能特性和/或化學(xué)特征而可以被檢測到化合物和/或元素，它們的使用使得與其連接的抗體可以被檢測和/或根據(jù)需要被進(jìn)一步定量。另一個此類實例是包含連接至細(xì)胞毒性劑或抗細(xì)胞劑的抗體的結(jié)合物的形成，并且可以稱作“免疫毒素”。抗體結(jié)合物通常優(yōu)選作為診斷劑?？贵w診斷通常分為兩類，即用于體外診斷的那些，例如在多種免疫測定中，和/或用于體內(nèi)診斷方案的那些，通常稱作“抗體導(dǎo)向的成像”。許多適當(dāng)?shù)某上駝┦潜绢I(lǐng)域已知的，如用于附著抗體的方法的那些(見例如美國專利5，021，236，4，938，948，和4，472，509，每一文獻(xiàn)通過參考并入本文)。所使用的成像部分可以是順磁離子；放射性同位素；熒光染料；NMR可檢測的物質(zhì)；X射線成像。以順磁離子為例，可以以實例方式提到的離子例如鉻(III)、錳(II)、鐵(III)、鐵 (II)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、釹(III)、釤(III)、鐿(III)、釓(III)、釩(II)、鋱(III)、 鏑(III)、鈥(III)和/或鉺(III)，其中釓是特別優(yōu)選的。用于其它背景，如X射線成像的離子包括但不限于鑭(III)、金(III)、鉛(II)并且特別是鉍(III)。用于治療和/或診斷應(yīng)用的放射性同位素包括砹21V4碳、51鉻、36氯、57鈷、58鈷、 銅67、152 銪、鎵67、3 氫、碘123、碘125、碘131、銦 m、59 鐵、32 磷、錸186、錸 188J5 硒、35 硫、锝99m 和 / 或釔9°。125I對于某些實施方案是優(yōu)選的，并且锝99m和/或銦111由于它們能量低并且對大范圍的檢測具有適應(yīng)性也是經(jīng)常優(yōu)選的。可以根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的產(chǎn)生放射性標(biāo)記的本發(fā)明單克隆抗體。例如，單克隆抗體可以通過與碘化鈉和/或碘化鉀和化學(xué)氧化劑如次氯酸鈉，或酶性氧化劑如乳過氧化物酶接觸被碘化。根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體可以通過配體交換過程以锝99m標(biāo)記，例如通過以亞錫溶液還原過锝酸鹽，將還原的锝螯合在kphadex柱上并且向該柱應(yīng)用抗體。備選地，可以使用直接標(biāo)記技術(shù)，例如通過孵育過锝酸鹽、還原劑例如SNCl2、緩沖溶液如鄰苯二甲酸鈉-鉀溶液和抗體。常用于將作為金屬離子存在放射性同位素結(jié)合至抗體的中間的功能基是釓噴酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。在熒光標(biāo)記中考慮用作結(jié)合物的包括Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL, B0DIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、Cascade 811^丄73丄75、6呼六11、異硫氰酸熒光素、冊乂、6-(^、俄勒同綠488、俄勒同綠500、俄勒岡綠 514、太平洋藍(lán)、REG、羅丹明綠、羅丹明紅、腎造影劑、ROX、TAMRA, TET、四甲基羅丹明、和/或德克薩斯紅。本發(fā)明考慮的另一類型的抗體結(jié)合物是預(yù)期主要用于體外使用的那些，其中抗體與第二個結(jié)合配體和/或酶(酶標(biāo)簽)連接，當(dāng)與生色底物接觸時酶產(chǎn)生有色的產(chǎn)物。適宜的酶實例包括尿素酶、堿性磷酸酶、(辣根)過氧化氫酶或葡萄糖氧化酶。優(yōu)選的第二個結(jié)合配體是生物素和/或抗生物素蛋白和鏈親和素化合物。此類標(biāo)簽的使用是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的并且描述于例如美國專利3，817，837 ；3, 850，752 ；3, 939，350 ；3, 996，345 ； 4，277，437 ；4, 275，149和4，366，241中；每一美國專利通過參考并入本文。分子與抗體的位點(diǎn)特異性附著的另一已知方法包括抗體與基于半抗原的親和性標(biāo)簽的反應(yīng)?；旧?，基于半抗原的親和性標(biāo)簽與抗原結(jié)合位點(diǎn)中的氨基酸反應(yīng)，由此破壞了該位點(diǎn)并封閉特異性的抗原反應(yīng)。然而，這并不是有利的，因為這導(dǎo)致抗原喪失結(jié)合抗體結(jié)合物。包含疊氮基的分子還可用于通過由低強(qiáng)度紫外線產(chǎn)生的活性氮烯中間體與蛋白質(zhì)形成共價鍵(Potter和Haley，1983)。具體而言，嘌呤核苷酸的2_和8_疊氮類似物已經(jīng)用作位點(diǎn)定向光探針來鑒定粗細(xì)胞提取液中的核苷酸結(jié)合蛋白(Owens和Haley，1987 ； Atherton等，1985)。2-和8-疊氮核苷酸也已經(jīng)用于所純化蛋白質(zhì)的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域作圖(Khatoon等，1989 ；King等，1989 ；以及Dholakia等，1989)并且可以用作抗體結(jié)合劑。用于抗體附著或綴合至其結(jié)合物部分的數(shù)個方法是本領(lǐng)域已知的。一些附著方法涉及使用金屬螯合復(fù)合物，采用例如有機(jī)螯合劑，如釓噴酸酐(DTPA) ；二亞乙基三胺； N-氯-ρ-甲苯磺酰胺；和 / 或 tetrachloro-3a-6 α-diphenylglycouril-3 與抗體連接 (美國專利4，472，509和4，938，948，每一美國專利通過參考并入本文)。單克隆抗體還可在偶聯(lián)劑如戊二醛或高碘酸鹽存在下與酶反應(yīng)。帶有熒光素標(biāo)記物的結(jié)合物在這些偶聯(lián)劑存在下或者通過與異硫氰酸酯反應(yīng)制備。在美國專利4，938，948中，使用單克隆抗體實現(xiàn)乳腺腫瘤的成像并且可檢測的成像部分使用連接體如對羥基苯甲亞胺酸甲酯或3-(4-羥基苯基)-丙酸-N-琥珀酰亞胺酯與抗體連接。在另外的實施方案中，考慮了通過使用不改變抗體結(jié)合位點(diǎn)的反應(yīng)條件向免疫球蛋白的Fc區(qū)選擇性引入巰基的免疫球蛋白的衍生化。公開了根據(jù)該方法學(xué)產(chǎn)生的表現(xiàn)出改善的壽命、特異性和敏感性的抗體結(jié)合物(美國專利號5，196，066，通過參考并入本文)。 在文獻(xiàn)中已經(jīng)公開了其中報告分子或效應(yīng)子分子結(jié)合至Fc區(qū)糖殘基的效應(yīng)子或報告分子的位點(diǎn)特異性附著(0' Siannessy等，1987)。已經(jīng)報導(dǎo)該方法產(chǎn)生當(dāng)前處于臨床評定中的有希望用于診斷和治療的抗體。3.雙功能性抗體在某些實施方案中，雙功能性抗體可以用于靶向Cripto和/或GRP78。例如，雙特異性的Fc- 二聚體可用于靶向和結(jié)合Cripto和GRP78兩者，并且構(gòu)想這種結(jié)合將抑制隨后的Cripto/GRP78復(fù)合體的信號，例如Nodal信號、激活蛋白/TGFi^信號、ERK/MAPK信號和 /或PI!3K/Akt/GSK3i3信號。在某些實施方案中，雙功能性的或雙特異性的抗體可以結(jié)合至少一部分的Cripto EGF樣區(qū)、Cripto CFC結(jié)構(gòu)域、GRP78的氨基酸19-68，和/或GRP78的 N-20區(qū)。備選地，包含多個scFv分子的雙鏈抗體、三鏈抗體或四鏈抗體可用于以例如增加的親和性結(jié)合Cripto和/或GRP78。位于雙特異性抗體中V結(jié)構(gòu)域之間不同長度的連接體可用于指導(dǎo)雙鏈抗體(例如大約60kDa)、三鏈抗體(例如大約90kDa)或四鏈抗體(例如大約120kDa)的形成，如取決于所希望的特定應(yīng)用，例如體內(nèi)或體外成像或治療所希望的那樣以優(yōu)化大小、柔性和效價 (Robinson等2008 ；Todorovska等，2001)。多功能性抗體表現(xiàn)出對這些scFv多聚體增強(qiáng)的結(jié)合效價，導(dǎo)致高的親和力和降低的脫落。在一些實施方案中，多功能性抗體可以有利地用于腫瘤靶向，因為大約60-100kDa的某些分子表現(xiàn)出與親本Ig(例如大約150kDa)相比增加的腫瘤滲透性和快速的清除率。在某些實施方案中，設(shè)計多特異性Fv模塊以交聯(lián)兩個或更多個不同的靶抗原。這些雙特異性和三特異性多聚體可以通過不同scFv分子的結(jié)合形成(Dutertre和Teillaud，2006 ；Pluckthun 等，1997 ；Kortt 等，2001 ；Hudson 等，1999 ；Atwell 等，1996)。B. Cripto/GRP78 靶向件肽Cripto靶向性或GRP78靶向性蛋白質(zhì)或肽可以用于抑制Cripto/GRP78復(fù)合體的形成和/或功能。例如，可以使用例如體外細(xì)胞噬菌體展示篩選肽文庫以鑒定可結(jié)合 Cripto和/或GRP78以抑制Cripto/GRP78復(fù)合物形成的肽或蛋白質(zhì)。多種方法可以用于此目的，包括例如 Mintz PJ 等 Nat Biotechnol 2003 21 (1)57-63 ；Kim Y 等 Biochemistry 45(31)9434-44 Jakobsen CG 等 Cancer Res 2007 67 (19) 9507-17 ；和 Gonzalez-Gronow M 等Cancer Res 2006 66 11424-31中描述的那些，它們通過參考并入本文。如本文中所使用，蛋白質(zhì)或肽通常指，但不限于從基因翻譯的大于大約200個氨基酸直至全長序列的蛋白質(zhì)；大約100至200個氨基酸的多肽；和/或從大約3個至大約100個氨基酸的肽。為了方便起見，術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“多肽”和“肽”在本文中互換使用。在某些實施方案中，包含GRP78的N-20表位的肽可用于結(jié)合Cripto并抑制 Cripto/GRP78復(fù)合物的形成。如本文所示，GRP78的N-20表位對于Cripto/GRP78結(jié)合是至關(guān)重要的；因此，包含GRP78的N-20表位的肽可用于競爭性地拮抗Cripto/GRP78復(fù)合物的形成。N-20表位由GRP78信號肽下游的前50個殘基內(nèi)的20個氨基酸組成。N-20抗體可以購自Santa Cruz Biotechnology (CA，美國)。類似地，在另外的實施方案中，包含Cripto 的CFC結(jié)構(gòu)域的肽可用于結(jié)合GRP78并抑制Cripto/GRP78復(fù)合物的形成。如在下面實例中所示，Cripto的CFC結(jié)構(gòu)域?qū)τ贑ripto/GRP78結(jié)合是至關(guān)重要的；因此，包含Cripto的 CFC結(jié)構(gòu)域的肽可用于競爭性地拮抗Cripto/GRP78復(fù)合物的形成。使用125I-標(biāo)記的可溶性Cripto的結(jié)合測定法，例如在Kelber等中描述的那些， 可用于本發(fā)明中。例如，Cripto與完整MCFlOA或NCCIT細(xì)胞的結(jié)合可被未標(biāo)記的Cripto 競爭性阻斷，并且重要的是可被N-20GRP78抗體競爭性阻斷。該測定法或其改良形式可用于篩選能夠破壞Cripto/GRP78結(jié)合的肽。在某些實施方案中，至少一種蛋白質(zhì)或肽的大小可包括，但不限于，1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、 58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、 83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、大約 110、大約 120、大約 130、大約140、大約150、大約160、大約170、大約180、大約190、大約200、大約210、大約 220、大約230、大約M0、大約250、大約275、大約300、大約325、大約350、大約375、大約 400、大約425、大約450、大約475、大約500、大約525、大約550、大約575、大約600、大約 625、大約650、大約675、大約700、大約725、大約750、大約775、大約800、大約825、大約 850、大約875、大約900、大約925、大約950、大約975、大約1000、大約1100、大約1200、大約1300、大約1400、大約1500、大約1750、大約2000、大約2250、大約2500或更多個氨基酸殘基。如本文中所使用，“氨基酸殘基”指本領(lǐng)域已知的任何天然存在的氨基酸、任何氨基酸衍生物或任何氨基酸模擬物。在某些實施方案中，蛋白質(zhì)或肽的殘基是連續(xù)的，沒有任何非氨基酸打斷氨基酸殘基序列。在另外的實施方案中，序列可以包含一個或更多個非氨基酸部分。在特定的實施方案中，蛋白質(zhì)或肽殘基序列可被一個或更多個非氨基酸部分打
24斷。因此，術(shù)語“蛋白質(zhì)或肽”包括包含在天然存在蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的20種常見氨基酸中至少一種或者至少一種修飾或罕見氨基酸，包括但不限于下表2所示的那些的氨基酸。
權(quán)利要求
1.抑制細(xì)胞中Cripto信號以降低細(xì)胞增殖的方法，包括將細(xì)胞與一定量的選擇性的 GRP78/Cripto靶向性化合物接觸，所述的GRP78/Cripto靶向性化合物有效抑制Cripto和 GRP78之間復(fù)合體的形成，由此降低細(xì)胞的增殖。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述復(fù)合體的形成被a)抗GRP78抗體、b)結(jié)合至在Cripto 的GRP78-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或CFC結(jié)構(gòu)域中的表位的抗體或c)缺乏天然GRP78的氨基酸19-68 位的GRP78突變體抑制。
3.權(quán)利要求2的方法，其中抗體是結(jié)合GRP78的N-20表位的抗GRP78抗體。
4.權(quán)利要求2的方法，其中抗體是人單克隆抗體或人源化單克隆抗體。
5.權(quán)利要求2的方法，其中抗體是雙特異性抗體。
6.權(quán)利要求2的方法，其中抗體結(jié)合至報告分子。
7.權(quán)利要求6的方法，其中報告分子是放射性配體或熒光性標(biāo)簽。
8.權(quán)利要求2的方法，其中抗體是抗GRP78scFV、F(ab)或F(ab)2。
9.權(quán)利要求1的方法，其中靶向性化合物是shRNA、siRNA或siNA。
10.權(quán)利要求9的方法，其中靶向性化合物是包括SEQID NO :5或SEQ ID NO :4的 ShRNA0
11.權(quán)利要求2的方法，其中靶向性化合物是缺乏天然GRP78的氨基酸19-68位的 GRP78突變體。
12.權(quán)利要求11的方法，其中缺乏天然GRP78的氨基酸19-68位的GRP78突變體是 Δ19-68GRP78。
13.權(quán)利要求1的方法，其中施用是全身施用、局部施用、部位施用、腸胃外施用、靜脈內(nèi)施用、腹膜內(nèi)施用、通過吸入施用或者腫瘤內(nèi)施用。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是乳腺、結(jié)腸、胃、胰、肺、卵巢、子宮內(nèi)膜、睪丸、 膀胱、前列腺、頭、頸、子宮頸、胃、膽囊或腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞。
15.權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞是癌性細(xì)胞、癌前細(xì)胞或惡性細(xì)胞，并且其中方法進(jìn)一步定義為治療受試者中高增生性疾病的方法。
16.權(quán)利要求15的方法，其中高增生性疾病是癌癥。
17.權(quán)利要求16的方法，其中癌癥選自乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、睪丸癌、膀胱癌、前列腺癌、頭頸癌、宮頸癌、膽囊癌或腎上腺皮質(zhì)癌。
18.權(quán)利要求16的方法，其中方法包括向受試者施用第二癌癥治療。
19.權(quán)利要求18的方法，其中第二癌癥治療是化學(xué)治療、放射治療、基因治療、免疫治療或外科手術(shù)。
20.權(quán)利要求19的方法，其中第二癌癥治療是化學(xué)治療。
21.權(quán)利要求20的方法，其中化學(xué)治療是紫杉醇、順鉬或碳鉬。
22.權(quán)利要求1的方法，其中方法進(jìn)一步定義為促進(jìn)干細(xì)胞分化成為神經(jīng)元細(xì)胞的方法，其中細(xì)胞是干細(xì)胞，并且其中抑制Cripto和GRP78之間復(fù)合體的形成促進(jìn)細(xì)胞分化成為神經(jīng)元細(xì)胞。
23.權(quán)利要求22的方法，其中細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。
24.權(quán)利要求23的方法，其中人胚胎干細(xì)胞是Η9或BG02。
25.權(quán)利要求23的方法，其中干細(xì)胞是誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPSC)。
26.篩選Cripto/GRP78復(fù)合物形成抑制劑的方法，包括a)獲得候選調(diào)節(jié)劑；b)將候選調(diào)節(jié)劑與Cripto和GRP78接觸；和c)測量Cripto/GRP78復(fù)合體的形成；其中在候選調(diào)節(jié)劑存在下Cripto/GRP78復(fù)合體形成的降低或Cripto/GRP78復(fù)合體信號的降低表明候選調(diào)節(jié)劑是Cripto/GRP78復(fù)合物形成的抑制劑。
27.人源化單克隆抗GRP78抗體，其中抗體結(jié)合GRP78的N-20表位，并且其中所述結(jié)合抑制Cripto/GRP78復(fù)合體的形成。
28.權(quán)利要求26的抗體，其中抗體包含在藥物組合物中。
29.權(quán)利要求28的組合物，其中藥物組合物被配制成用于腸胃外、靜脈內(nèi)或瘤內(nèi)施用。
全文摘要
本發(fā)明提供用于治療高增生性疾病的組合物和方法，包括破壞高增生性細(xì)胞中的Cripto/GRP78復(fù)合物的形成。在某些實施方案中，抗體和/或siRNA可用于抑制Cripto/GRP78結(jié)合，任選地與其它癌癥治療相結(jié)合。還提供用于鑒定可選擇性抑制Cripto/GRP78結(jié)合的治療化合物的方法。
文檔編號C12N15/11GK102272157SQ200980154121
公開日2011年12月7日 申請日期2009年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月7日
發(fā)明者G·沙尼, J·A·科爾博, W·維爾, 彼得·C·格雷 申請人:研究發(fā)展基金會