專利名稱：核苷酸和核苷以及將其用于dna測序的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體而言涉及用于DNA測序和其他類型DNA分析的組合物和方法。更特別地，本發(fā)明部分涉及帶有可化學(xué)切割、可光切割、可酶切割或非可光切割基團(tuán)的核苷酸和核苷，以及將其用于多種DNA測序法中的方法及其在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
快速DNA測序的方法已經(jīng)成為分析人群中疾病和突變并開發(fā)療法的需求。通常觀察到的人類序列變異形式為單核苷酸多態(tài)性(SNP)(其在基因組序列約每300至1000個堿基對中發(fā)生1處)和結(jié)構(gòu)變體(structual variant, SV)包括塊的替換、插入/缺失、倒位、 區(qū)段重復(fù)，以及拷貝數(shù)變體。結(jié)構(gòu)變體可占所有變異事件的22%，比SNP導(dǎo)致的變體堿基更多(Levy等2007，通過參考并入本文)。這一發(fā)現(xiàn)與khereiNHurles及其同事用基于微陣列方法分析270名個體所得結(jié)論一致(Redon等2006，通過參考并入本文)?；谌祟惢蚪M全序列，正努力通過SNP作圖或直接關(guān)聯(lián)來鑒定與常見疾病背后的遺傳聯(lián)系。致力于快速、高通量且低成本DNA測序的技術(shù)發(fā)展將加速對遺傳信息(如SNP)的理解和其在應(yīng)用醫(yī)學(xué)中的使用。一般地，10%至15%的SNP會通過改變特定的氨基酸殘基而影響蛋白質(zhì)功能，通過改變剪接機制而影響基因的正確加工，或是通過改變調(diào)節(jié)機制而影響基因或蛋白質(zhì)的正常表達(dá)水平。SV還可在人類生物學(xué)和疾病中發(fā)揮重要作用(Iafrate等2004 ;Sebat等 2004，Tuzun等2005，Stranger等2007，通過參考并入本文)。人們設(shè)想，對信息性SNP和 SV的鑒定會導(dǎo)致對遺傳性疾病更準(zhǔn)確的診斷，對風(fēng)險易感性更好的預(yù)后，或是對組織中偶發(fā)突變的鑒定。個體SNP和SV譜的一個應(yīng)用將是通過預(yù)防性藥物治療來顯著地推遲疾病的發(fā)生或發(fā)展。此外，藥物代謝基因的SNP和SV譜可用于制定特定的用藥方案，以提供更安全和更有效的結(jié)果。為實現(xiàn)這些遠(yuǎn)大的目標(biāo)，基因組測序?qū)⑦M(jìn)入有潛力對大部分人口進(jìn)行部分測序的再測序階段，這將涉及對分布在整個人類基因組中的特定區(qū)域進(jìn)行并行測序， 以獲得給定復(fù)雜疾病的SNP和SV譜。大多數(shù)常見疾病中內(nèi)在的序列變異很可能涉及多個SNP、SV及其多種組合，它們散布于相關(guān)基因中并以低頻率存在。因此，相比于僅以已知SNP為靶標(biāo)的技術(shù)，采用從頭測序策略的DNA測序技術(shù)更有可能檢測和/或發(fā)現(xiàn)這些罕見的、廣泛分布的變體。傳統(tǒng)上，DNA測序通過“Sanger”或“雙脫氧”法來實現(xiàn)，所述方法涉及通過用DNA 聚合酶摻入2’，3’-雙脫氧核苷酸(ddNTP)對DNA合成進(jìn)行鏈終止(Sanger等1997，通過參考并入本文)。該反應(yīng)還包括天然的2’ -脫氧核苷酸(dNTP)，其通過DNA合成而延伸DNA 鏈。在合適的平衡下，鏈延伸與鏈終止的競爭導(dǎo)致產(chǎn)生一系列嵌套DNA片段，它們均勻地分布于數(shù)千個堿基中，并且隨著堿基對的增加而大小不同。使用電泳通過其相應(yīng)大小來解析所述嵌套DNA片段。測序反應(yīng)中dNTP/ddNTP的比值決定了鏈終止的頻率，因此決定被終止鏈的長度分布。然后通過之前附著在四種DNA堿基(即A、C、G和T)上的四種不同熒光團(tuán)來檢測片段，所述熒光團(tuán)在適當(dāng)?shù)募す庠凑丈鋾r發(fā)出相應(yīng)顏色的熒光。如今，Sanger測序是通過直接PCR測序(Gibbs等1989，通過參考并入本文)或基因組測序(Himkapiller等 1991，國際人類基因組測序聯(lián)盟，2001，通過參考并入本文)發(fā)現(xiàn)SNP的最廣泛應(yīng)用的方法。下一代測序(next-generation sequencing, NGS)技術(shù)的優(yōu)勢包括能夠便宜地產(chǎn)生龐大的數(shù)據(jù)容量，在一些情況下每次儀器運行讀出超過一億短序列。許多這些方法被統(tǒng)稱為合成測序(sequencing-by-synthesis，SBS)，這不能清晰地描述不同的DNA測序機制 (Metzker 2005，通過參考并入本文)。這里，DNA聚合酶依賴性策略被分為循環(huán)可逆終止 (cyclic reversible termination, CRT)、單核苷酸添力口(single nucleotide addition, SNA,如焦磷酸測序)和實時測序。用DNA連接酶替代DNA聚合酶的方法被稱為連接測序 (sequencing-by-ligation, SBL)。非常需要開發(fā)有可能應(yīng)用于多個研究領(lǐng)域(包括比較基因組學(xué)和進(jìn)化學(xué)、法醫(yī)學(xué)、流行病學(xué)以及用于診斷和治療的應(yīng)用醫(yī)學(xué))的新型測序技術(shù)。現(xiàn)有的測序技術(shù)對于在人類序列變異研究中的廣泛應(yīng)用來說常常過于昂貴、費力和費時?；蚪M中心的費用基于每1，000個( 2(ι堿基所需美元來計算，一般可分為設(shè)備、人力、試劑和材料以及管理費用等幾類。如今，這些中心的運行費用為每1，000個Q2tl堿基不到1美元，其中至少有50%的支出是由DNA測序設(shè)備這一項產(chǎn)生的。新型檢測方法的開發(fā)、設(shè)備小型化、微流體分離技術(shù)以及每次運行的測試數(shù)量的增加將最有可能對降低成本產(chǎn)生最大的影響。

發(fā)明內(nèi)容
在一些方面中，本公開內(nèi)容提供了可用于在高通量測序反應(yīng)中對基因組信息進(jìn)行高效測序的新的化合物和組合物。在另一方面中，還提供了可高效且經(jīng)濟地提供基因組信息的試劑和試劑組合。在另一些方面中，本發(fā)明還提供了用于診斷方法和用于針對個體開發(fā)靶向療法的試劑文庫和陣列。在一些方面中，本公開內(nèi)容提供了可用于DNA測序的新化合物。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了下式的化合物或其鹽、酯、水合物、溶劑化物、互變異構(gòu)體、前藥或光學(xué)異構(gòu)體
權(quán)利要求
1.下式的化合物或其鹽、酯、水合物、溶劑化物、互變異構(gòu)體、前藥或光學(xué)異構(gòu)體
2.權(quán)利要求1的化合物，其進(jìn)二步定義為式A的化合物。
3.權(quán)利要求1的化合物，其進(jìn)一步定義為式B的化合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的化合物，其中Z為-0-。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的化合物，其中R1為羥基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的化合物，其中R1為一磷酸基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的化合物，其中R1為二磷酸基。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的化合物，其中R1為三磷酸基。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的化合物，其中R1為多磷酸基。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項的化合物，其中&為氫。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項的化合物，其中&為羥基。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項的化合物，其中R3為氫。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項的化合物，其中民為烷基或其取代形式。
14.權(quán)利要求13的化合物，其中R3為烷基(K8)。
15.權(quán)利要求14的化合物，其中R3為烷基(K6)。
16.權(quán)利要求15的化合物，其中R3選自甲基、乙基、正丙基、異丙基和叔丁基。
17.權(quán)利要求16的化合物，其中R3為甲基。
18.權(quán)利要求15的化合物，其中R3為烷基(《ο。
19.權(quán)利要求18的化合物，其中R3為烷基(C3-5)。
20.權(quán)利要求19的化合物，其中R3為異丙基。
21.權(quán)利要求19的化合物，其中R3為叔丁基。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項的化合物，其中R4為氫。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項的化合物，其中R4為烷基或其取代形式。
24.權(quán)利要求23的化合物，其中R4為烷基(c(&。
25.權(quán)利要求M的化合物，其中R4為烷基(?！?。
26.權(quán)利要求25的化合物，其中R4選自甲基、乙基、正丙基、異丙基和叔丁基。
27.權(quán)利要求沈的化合物，其中R4為甲基。
28.權(quán)利要求25的化合物，其中R4為烷基(《ο。
29.權(quán)利要求28的化合物，其中R4為烷基(C3-5)。
30.權(quán)利要求四的化合物，其中R4為異丙基。
31.權(quán)利要求四的化合物，其中R4為叔丁基。
32.根據(jù)權(quán)利要求1-31中任一項的化合物，其中&為氫。
33.根據(jù)權(quán)利要求1-31中任一項的化合物，其中&為氰基。
34.根據(jù)權(quán)利要求1-31中任一項的化合物，其中&為烷氧基或其取代形式。
35.權(quán)利要求34的化合物，其中&為烷氧基(。<8)。
36.權(quán)利要求35的化合物，其中&為烷氧基(?！?。
37.權(quán)利要求36的化合物，其中&為烷氧基(。。)。
38.權(quán)利要求37的化合物，其中&為甲氧基。
39.根據(jù)權(quán)利要求1-31中任一項的化合物，其中&為下式的基團(tuán)
40.權(quán)利要求39的化合物，其中X為炔撐(K12)。
41.權(quán)利要求40的化合物，其中X為炔撐fc2_0。
42.權(quán)利要求41的化合物，其中X為-Cε C-。
43.根據(jù)權(quán)利要求39-42中任一項的化合物，其中η為0。
44.根據(jù)權(quán)利要求1-31中任一項的化合物，其中&為下式的基團(tuán)
45.權(quán)利要求44的化合物，其中X為炔撐(K12)。
46.權(quán)利要求45的化合物，其中X為炔撐(C2_8)。
47.權(quán)利要求46的化合物，其中X為-Cε C-。
48.根據(jù)權(quán)利要求44-47中任一項的化合物，其中Y為-CH2-。
49.根據(jù)權(quán)利要求44-48中任一項的化合物，其中η為0。
50.根據(jù)權(quán)利要求44-49中任一項的化合物，其中m為0。
51.根據(jù)權(quán)利要求1-32中任一項的化合物，其中&為-接頭-報告基團(tuán)。
52.權(quán)利要求51的化合物，其中所述接頭為
53.權(quán)利要求52的化合物，其中X為炔撐(K12)。
54.權(quán)利要求53的化合物，其中X為炔撐(C2_8)。
55.權(quán)利要求M的化合物，其中X為-Cε C-。
56.根據(jù)權(quán)利要求52-55中任一項的化合物，其中η為0。
57.權(quán)利要求51的化合物，其中所述接頭為
58.權(quán)利要求57的化合物，其中X為炔撐(K12)。
59.權(quán)利要求58的化合物，其中X為炔撐(C2-8)。
60.權(quán)利要求59的化合物，其中1為-C三C-。
61.根據(jù)權(quán)利要求57-60中任一項的化合物，其中Y為-CH2-。
62.根據(jù)權(quán)利要求57-61中任一項的化合物，其中η為0。
63.根據(jù)權(quán)利要求57-62中任一項的化合物，其中m為0。
64.權(quán)利要求51的化合物，其中所述接頭為
65.權(quán)利要求64的化合物，其中X為炔撐(K12)。
66.權(quán)利要求65的化合物，其中X為炔撐(C2-8)。
67.權(quán)利要求66的化合物，其中X為-Cε C-。
68.根據(jù)權(quán)利要求64-67中任一項的化合物，其中Y為-CH2-。
69.根據(jù)權(quán)利要求64-68中任一項的化合物，其中η為0。
70.根據(jù)權(quán)利要求64-69中任一項的化合物，其中m為0。
71.根據(jù)權(quán)利要求51-70中任一項的化合物，其中所述報告基團(tuán)是基于染料的報告基團(tuán)，其中所述染料為咕噸、熒光素、羅丹明、B0DIPY、花菁、香豆素、芘、酞菁、藻膽蛋白、ALEXA FLU0R. 350,ALEXA FLUOR. 405、ALEXA FLUOR. 430、ALEXA FLUOR. 488、ALEXA FLUOR 514、ALEXA FLUOR 532、ALEXA FLUOR546、ALEXA FLUOR555、ALEXA FLUOR 568、 ALEXA FLUOR 568,ALEXA FLUOR594、ALEXA FLUOR610、ALEXA FLUOR633、ALEXA FLUOR. 647、ALEXA FLUOR. 660、ALEXA FLUOR. 680、ALEXA FLUOR. 700、ALEXA FLUOR 750，或方酸菁染料。
72.根據(jù)權(quán)利要求51-70中任一項的化合物，其中所述報告基團(tuán)為
73.
74.
75.
76.
77.
78.
79.根據(jù)權(quán)利要求1-72中任一項的化合物，其中&為氫。根據(jù)權(quán)利要求1-72中任一項的化合物，其中&為烷氧基或其取代形式t權(quán)利要求74的化合物，其中&為烷氧基M)。權(quán)利要求75的化合物，其中&為烷氧基M)。權(quán)利要求76的化合物，其中&為烷氧基fc。)。權(quán)利要求77的化合物，其中&為甲氧基。根據(jù)權(quán)利要求1-72中任一項的化合物，其中&為下式的基團(tuán)其中 X為
80.權(quán)利要求79的化合物，其中X為炔撐(K12)。
81.權(quán)利要求80的化合物，其中X為炔撐fc2_0。
82.權(quán)利要求81的化合物，其中X為-Cε C-。
83.根據(jù)權(quán)利要求79-82中任一項的化合物，其中η為O。
84.根據(jù)權(quán)利要求1-72中任一項的化合物，其中&為下式的基團(tuán)
85.權(quán)利要求84的化合物，其中X為炔撐(K12)。
86.權(quán)利要求85的化合物，其中X為炔撐(C2-8)。
87.權(quán)利要求86的化合物，其中X為-Cε C-。
88.根據(jù)權(quán)利要求84-87中任一項的化合物，其中Y為-CH2-。
89.根據(jù)權(quán)利要求84-88中任一項的化合物，其中η為0。
90.根據(jù)權(quán)利要求84-89中任一項的化合物，其中m為0。
91.根據(jù)權(quán)利要求1-72中任一項的化合物，其中&為-接頭-報告基團(tuán)。
92.權(quán)利要求91的化合物，其中所述接頭為
93.權(quán)利要求92的化合物，其中X為炔撐(K12)。
94.權(quán)利要求93的化合物，其中X為炔撐(C2_8)。
95.權(quán)利要求94的化合物，其中X為-Cε C-。
96.根據(jù)權(quán)利要求92-95中任一項的化合物，其中η為0。
97.權(quán)利要求91的化合物，其中所述接頭為
98.權(quán)利要求97的化合物，其中X為炔撐(K12)。
99.權(quán)利要求98的化合物，其中X為炔撐(C2-8)。
100.權(quán)利要求99的化合物，其中X為-Cε C-。
101.根據(jù)權(quán)利要求97-100中任一項的化合物，其中Y為-CH2-。
102.根據(jù)權(quán)利要求97-101中任一項的化合物，其中η為0。
103.根據(jù)權(quán)利要求97-102中任一項的化合物，其中m為0。
104.權(quán)利要求91的化合物，其中所述接頭為
105.權(quán)利要求104的化合物，其中X為炔撐(《12)。
106.權(quán)利要求105的化合物，其中X為炔撐fc2i。
107.權(quán)利要求106的化合物，其中X為-Cε C-。
108.根據(jù)權(quán)利要求104-107中任一項的化合物，其中Y為-CH2-。
109.根據(jù)權(quán)利要求104-108中任一項的化合物，其中η為0。
110.根據(jù)權(quán)利要求104-109中任一項的化合物，其中m為0。
111.根據(jù)權(quán)利要求91-110中任一項的化合物，其中所述報告基團(tuán)是基于染料的報告基團(tuán)，其中所述染料為咕噸、熒光素、羅丹明、B0DIPY、花菁、香豆素、芘、酞菁、藻膽蛋白、 ALEXA FLUOR 350,ALEXA FLUOR 405,ALEXA FLUOR 430、ALEXA FLUOR488、ALEXA FLUOR 514、ALEXA FLUOR 532、ALEXA FLUOR 546、ALEXA FLUOR 555、ALEXA FLUOR 568、ALEXA FLUOR 568、ALEXA FLUOR 594、ALEXA FLUOR 610、ALEXA FLUOR L 633、 ALEXA FLUOR 647、ALEXA FLUOR660、ALEXA FLUOR680、ALEXA FLUOR700、ALEXA FLUOR750，或方酸菁染料。
112.根據(jù)權(quán)利要求91-110中任一項的化合物，其中所述報告基團(tuán)為
113.根據(jù)權(quán)利要求1-112中任一項的化合物，其中R7為氫。
114.根據(jù)權(quán)利要求1-113中任一項的化合物，其中&為氫。
115.根據(jù)權(quán)利要求1-113中任一項的化合物，其中&為硝基。
116.根據(jù)權(quán)利要求1-113中任一項的化合物，其中&為烷基或其取代形式。
117.權(quán)利要求116的化合物，其中&為烷基(《8)。
118.權(quán)利要求117的化合物，其中&為烷基(《6)。
119.權(quán)利要求118的化合物，其中&為烷基(《3)。
120.權(quán)利要求119的化合物，其中化為甲基。
121.根據(jù)權(quán)利要求1-120中任一項的化合物，其中&為氫。
122.根據(jù)權(quán)利要求1-120中任一項的化合物，其中&為硝基。
123.根據(jù)權(quán)利要求1-120中任一項的化合物，其中&為烷基或其取代形式。
124.權(quán)利要求123的化合物，其中&為烷基(《8)。
125.權(quán)利要求124的化合物，其中&為烷基(?！?。
126.權(quán)利要求125的化合物，其中&選自甲基、乙基、正丙基、異丙基和叔丁基。
127.權(quán)利要求126的化合物，其中&為甲基。
128.權(quán)利要求125的化合物，其中&為烷基(μ)。
129.權(quán)利要求128的化合物，其中&為烷基te_5)。
130.權(quán)利要求129的化合物，其中&為異丙基。
131.權(quán)利要求129的化合物，其中&為叔丁基。
132.根據(jù)權(quán)利要求1-120中任一項的化合物，其中&為芳基或其取代形式。
133.權(quán)利要求132的化合物，其中&為芳基(k8)。
134.權(quán)利要求133的化合物，其中&為苯基。
135.權(quán)利要求2的化合物，進(jìn)一步定義為
136.權(quán)利要求2的化合物，進(jìn)一步定義為
137.權(quán)利要求136的化合物，進(jìn)一步定義為
138.權(quán)利要求136的化合物，進(jìn)一步定義為
139.權(quán)利要求2的化合物，進(jìn)一步定義為
140.權(quán)利要求139的化合物，進(jìn)一步定義為
141.權(quán)利要求139的化合物，進(jìn)一步定義為
142.權(quán)利要求2的化合物，進(jìn)一步定義為
143.權(quán)利要求142的化合物，進(jìn)一步定義為
144.權(quán)利要求142的化合物，進(jìn)一步定義為
145.權(quán)利要求2的化合物，進(jìn)一步定義為
146.權(quán)利要求145的化合物，進(jìn)一步定義為
147.權(quán)利要求145的化合物，進(jìn)一步定義為
148.權(quán)利要求2的化合物，進(jìn)一步定義為
149.權(quán)利要求148的化合物，進(jìn)一步定義為
150.權(quán)利要求148的化合物，進(jìn)一步定義為
151.權(quán)利要求3的化合物，進(jìn)一步定義為
152.權(quán)利要求3的化合物，進(jìn)一步定義為
153.權(quán)利要求152的化合物，進(jìn)一步定義為
154.權(quán)利要求152的化合物，進(jìn)一步定義為
155.權(quán)利要求3的化合物，進(jìn)一步定義為
156.權(quán)利要求155的化合物，進(jìn)一步定義為
157.權(quán)利要求155的化合物，進(jìn)一步定義為
158.下式的化合物或其鹽、酯、水合物、溶劑化物、互變異構(gòu)體、前藥或光學(xué)異構(gòu)體
159.權(quán)利要求158的化合物，其進(jìn)一步定義為式C的化合物。
160.權(quán)利要求158的化合物，其進(jìn)一步定義為式D的化合物。
161.根據(jù)權(quán)利要求158-160中任一項的化合物，其中Z為_0_。
162.根據(jù)權(quán)利要求158-161中任一項的化合物，其中R1為羥基。
163.根據(jù)權(quán)利要求158-161中任--項的化合物，其中R1為--磷酉堯基。
164.根據(jù)權(quán)利要求158-161中任--項的化合物，其中R1為二二磷酉堯基。
165.根據(jù)權(quán)利要求158-161中任--項的化合物，其中R1為一二堯基。
166.根據(jù)權(quán)利要求158-161中任一項的化合物，其中R1為多磷酸基。
167.根據(jù)權(quán)利要求158-166中任一項的化合物，其中&為氫。
168.根據(jù)權(quán)利要求158-166中任一項的化合物，其中&為羥基。
169.根據(jù)權(quán)利要求158-168中任一項的化合物，其中R3為氫。
170.根據(jù)權(quán)利要求158-168中任一項的化合物，其中民為烷基或其取代形式。
171.權(quán)利要求170的化合物，其中R3為烷基(K8)。
172.權(quán)利要求171的化合物，其中R3為烷基(K6)。
173.權(quán)利要求172的化合物，其中民選自甲基、乙基、正丙基、異丙基和叔丁基。
174.權(quán)利要求173的化合物，其中R3為甲基。
175.權(quán)利要求172的化合物，其中R3為烷基(《ο。
176.權(quán)利要求175的化合物，其中R3為烷基(C3-5)。
177.權(quán)利要求176的化合物，其中R3為異丙基。
178.權(quán)利要求176的化合物，其中R3為叔丁基。
179.根據(jù)權(quán)利要求158-178中任一項的化合物，其中R4為氫。
180.根據(jù)權(quán)利要求158-178中任一項的化合物，其中R4為烷基或其取代形式。
181.權(quán)利要求180的化合物，其中R4為烷基(K8)。
182.權(quán)利要求181的化合物，其中R4烷基fc“)。
183.權(quán)利要求182的化合物，其中R4選自甲基、乙基、正丙基、異丙基和叔丁基。
184.權(quán)利要求183的化合物，其中R4為甲基。
185.權(quán)利要求182的化合物，其中R4為烷基(《ο。
186.權(quán)利要求185的化合物，其中R4為烷基(C3-5)。
187.權(quán)利要求186的化合物，其中R4為異丙基。
188.權(quán)利要求186的化合物，其中R4為叔丁基。
189.根據(jù)權(quán)利要求158-188中任一項的化合物，其中&為氫。
190.根據(jù)權(quán)利要求158-188中任一項的化合物，其中&為氰基。
191.根據(jù)權(quán)利要求158-188中任一項的化合物，其中&為烷氧基(《12)或其取代形式。
192.權(quán)利要求191的化合物，其中&為烷氧基fc<8)。
193.權(quán)利要求192的化合物，其中&為烷氧基fc“)。
194.權(quán)利要求193的化合物，其中&為烷氧基fc。)。
195.權(quán)利要求194的化合物，其中&為甲氧基。
196.根據(jù)權(quán)利要求158-188中任一項的化合物，其中&為下式的基團(tuán)η (V)其中 X為-0-、-S-或-NH-；或'^tW- (C S； 12)、'!^W (C S； 12)、(C S； 12)、TfW- (C S； 12)、^TfW (C S； 12)‘或任何這些基團(tuán)的取代形式；并且η為0至12的整數(shù)。
197.權(quán)利要求196的化合物，其中X為炔撐fc<12)。
198.權(quán)利要求197的化合物，其中X為炔撐(C2-&0
199.權(quán)利要求198的化合物，其中X為-Cε C-。
200.根據(jù)權(quán)利要求196-199中任一項的化合物，其中η為0。
201.根據(jù)權(quán)利要求158-188中任一項的化合物，其中&為下式的基團(tuán).O.其中 X為-0-、-S-或-NH-；或'^tW- (C S； 12)、'!^W (C S； 12)、(C S； 12)、TfW- (C S； 12)、^TfW (C S； 12)‘ 或任何這些基團(tuán)的取代形式；Y為-ο-、-NH-、烷撐或取代烷撐(K⑵； η為0至12的整數(shù)；并且 m為0至12的整數(shù)。
202.權(quán)利要求201的化合物，其中X為炔撐(《12)。
203.權(quán)利要求202的化合物，其中X為炔撐fc2i。
204.權(quán)利要求203的化合物，其中X為-Cε C-。
205.根據(jù)權(quán)利要求201-204中任一項的化合物，其中Y為_CH2_。
206.根據(jù)權(quán)利要求201-205中任一項的化合物，其中η為0。
207.根據(jù)權(quán)利要求201-206中任一項的化合物，其中m為0。
208.根據(jù)權(quán)利要求158-189中任一項的化合物，其中&為_接頭-報告基團(tuán)。
209.根據(jù)權(quán)利要求208的化合物，其中所述接頭為
210.權(quán)利要求209的化合物，其中X為炔撐(^12)。
211.權(quán)利要求210的化合物，其中X為炔撐(C2-&0
212.權(quán)利要求211的化合物，其中X為-Cε C-。
213.根據(jù)權(quán)利要求209-212中任一項的化合物，其中η為0。
214.權(quán)利要求208的化合物，其中所述接頭為
215.權(quán)利要求214的化合物，其中X為炔撐fc<12)。
216.權(quán)利要求215的化合物，其中X為炔撐fc2i。
217.權(quán)利要求216的化合物，其中X為-Cε C-。
218.根據(jù)權(quán)利要求214-217中任一項的化合物，其中Y為_CH2_。
219.根據(jù)權(quán)利要求214-218中任一項的化合物，其中η為0。
220.根據(jù)權(quán)利要求214-219中任一項的化合物，其中m為0。
221.權(quán)利要求208的化合物，其中所述接頭為
222.權(quán)利要求221的化合物，其中X為炔撐(K12)。
223.權(quán)利要求222的化合物，其中X為炔撐fc2i。
224.權(quán)利要求223的化合物，其中X為-Cε C-。
225.根據(jù)權(quán)利要求221-224中任一項的化合物，其中Y為_CH2_。
226.根據(jù)權(quán)利要求221-225中任一項的化合物，其中η為0。
227.根據(jù)權(quán)利要求221-226中任一項的化合物，其中m為0。
228.根據(jù)權(quán)利要求208-227中任一項的化合物，其中所述報告基團(tuán)是基于染料的報告基團(tuán)，其中所述染料為咕噸、熒光素、羅丹明、B0DIPY、花菁、香豆素、芘、酞菁、藻膽蛋白、 ALEXA FLUOR 350, ALEXA FLUOR405、ALEXA FLUOR 430、ALEXA FLUOR 488、ALEXA FLUOR 514、ALEXA FLUOR⑧532、ALEXA FLUOR. 546、ALEXA FLUOR 555、ALEXA FLUOR 568、ALEXA FLUOR 568、ALEXA FLUOR 594、ALEXA FLUOR 610、ALEXA FLUOR. 633、 ALEXA FLUOR. 647、ALEXA FLUOR 660、ALEXA FLUOR680、ALEXA FLUOR700、ALEXA FLUOR750，或方酸菁染料。
229.根據(jù)權(quán)利要求208-227中任一項的化合物，其中所述報告基團(tuán)為
230.根據(jù)權(quán)利要求158-229中任一項的化合物，其中&為氫。
231.根據(jù)權(quán)利要求158-2 中任一項的化合物，其中&為烷氧基(K12)或其取代形式c
232.權(quán)利要求231的化合物，其中&為烷氧基(。<8)。
233.權(quán)利要求232的化合物，其中&為烷氧基(。“)。
234.權(quán)利要求233的化合物，其中&為烷氧基(。。)。
235.權(quán)利要求234的化合物，其中&為甲氧基。
236.根據(jù)權(quán)利要求158-229中任一項的化合物，其中&為下式的基團(tuán)
237.權(quán)利要求236的化合物，其中X為炔撐(《12)。
238.權(quán)利要求237的化合物，其中X為炔撐fc2i。
239.權(quán)利要求238的化合物，其中X為-Cε C-。
240.根據(jù)權(quán)利要求236-239中任一項的化合物，其中η為0。
241.根據(jù)權(quán)利要求158-229中任一項的化合物，其中&為下式的基團(tuán)
242.權(quán)利要求Ml的化合物，其中X為炔撐(c≤12)。
243.權(quán)利要求M2的化合物，其中X為炔撐(c2-8)。
244.權(quán)利要求M3的化合物，其中X為-Cε C-。
245.根據(jù)權(quán)利要求M1-M4中任一項的化合物，其中Y為-CH2-。
246.根據(jù)權(quán)利要求M1-M5中任一項的化合物，其中η為0。
247.根據(jù)權(quán)利要求Μ1-Μ6中任一項的化合物，其中m為0。
248.根據(jù)權(quán)利要求158-229中任一項的化合物，其中&為_接頭-報告基團(tuán)。
249.權(quán)利要求對8的化合物，其中所述接頭為
250.權(quán)利要求Μ9的化合物，其中X為炔撐(《12)。
251.權(quán)利要求250的化合物，其中X為炔撐fc2i。
252.權(quán)利要求251的化合物，其中X為-Cε C-。
253.根據(jù)權(quán)利要求M9-252中任一項的化合物，其中η為0。
254.根據(jù)權(quán)利要求Μ8的化合物，其中所述接頭為
255.權(quán)利要求254的化合物，其中X為炔撐(《12)。
256.權(quán)利要求255的化合物，其中X為炔撐fc2i。
257.權(quán)利要求256的化合物，其中X為-Cε C-。
258.根據(jù)權(quán)利要求254-257中任一項的化合物，其中Y為_CH2_。
259.根據(jù)權(quán)利要求254-258中任一項的化合物，其中η為0。
260.根據(jù)權(quán)利要求254-259中任一項的化合物，其中m為0。
261.根據(jù)權(quán)利要求M8的化合物，其中所述接頭為
262.權(quán)利要求的化合物，其中X為炔撐(《12)。
263.權(quán)利要求沈2的化合物，其中X為炔撐fc2i。
264.權(quán)利要求沈3的化合物，其中X為-CΕ C-。
265.根據(jù)權(quán)利要求沈1力64中任一項的化合物，其中Y為-CH2-。
266.根據(jù)權(quán)利要求沈1力65中任一項的化合物，其中η為0。
267.根據(jù)權(quán)利要求沈1力66中任一項的化合物，其中m為0。
268.根據(jù)權(quán)利要求M8467中任一項的化合物，其中所述報告基團(tuán)是基于染料的報告基團(tuán)，其中所述染料為咕噸、熒光素、羅丹明、B0DIPY、花菁、香豆素、芘、酞菁、藻膽蛋白、 ALEXA FLUOR 350,ALEXA FLUOR405、ALEXA FLUOR430、ALEXA FLUOR 488、ALEXA FLUOR. 514、ALEXA FLUOR. 532、ALEXA FLUOR. 546、ALEXA FLUOR 555、ALEXA FLUOR 568、ALEXA FLUOR 568、ALEXA FLUOR 594、ALEXA FLUOR 610、ALEXA FLUOR 633、 ALEXA FLUOR 647、ALEXA FLUOR(g) 660、ALEXA FLUOR 680、ALEXA FLUOR (g) 700、ALEXA FLUOR750，或方酸菁染料。
269.根據(jù)權(quán)利要求M8467中任一項的化合物，其中所述報告基因為
270.根據(jù)權(quán)利要求158469中任一項的化合物，其中R7為氫。
271.根據(jù)權(quán)利要求158-270中任一項的化合物，其中&為氫。
272.根據(jù)權(quán)利要求158-270中任一項的化合物，其中&為硝基。
273.根據(jù)權(quán)利要求158-270中任一項的化合物，其中&為烷基或其取代形式。
274.權(quán)利要求273的化合物，其中&為烷基(《8)。
275.權(quán)利要求274的化合物，其中&為烷基(?！?。
276.權(quán)利要求275的化合物，其中&為烷基fc。)。
277.權(quán)利要求276的化合物，其中&為甲基。
278.根據(jù)權(quán)利要求158-277中任一項的化合物，其中&不是氫。
279.根據(jù)權(quán)利要求158-277中任一項的化合物，其中&為硝基。
280.根據(jù)權(quán)利要求158-277中任一項的化合物，其中&為烷基或其取代形式。
281.權(quán)利要求觀0的化合物，其中&為烷基(《8)。
282.權(quán)利要求的化合物，其中&為烷基(《6)。
283.權(quán)利要求觀2的化合物，其中&選自甲基、乙基、正丙基、異丙基和叔丁基。
284.權(quán)利要求觀3的化合物，其中&為甲基。
285.權(quán)利要求282的化合物，其中&為烷基(μ)。
286.權(quán)利要求觀5的化合物，其中&為烷基te_5)。
287.權(quán)利要求觀6的化合物，其中&為異丙基。
288.權(quán)利要求觀6的化合物，其中&為叔丁基。
289.根據(jù)權(quán)利要求158-277中任一項的化合物，其中&為芳基或其取代形式。
290.權(quán)利要求觀9的化合物，其中&為芳基(《8)。
291.權(quán)利要求四0的化合物，其中&為苯基。
292.權(quán)利要求158的化合物，進(jìn)一步定義為
293.權(quán)利要求158的化合物，進(jìn)一步定義為
294.權(quán)利要求158的化合物，進(jìn)一步定義為
295.權(quán)利要求158的化合物，進(jìn)一步定義為
296.選自下式的化合物或其鹽
297.權(quán)利要求四6的化合物，進(jìn)一步定義為選自以下的非對映體或任何這些非對映體的鹽
298.其中所述化合物基本不含其它光學(xué)異構(gòu)體。 298.選自下式的化合物或其鹽
299.權(quán)利要求四8的化合物，進(jìn)一步定義為選自以下的非對映體或任何這些非對映體的鹽
300.根據(jù)權(quán)利要求1499中任一項的化合物，其中所述化合物為鹽。
301.權(quán)利要求300的化合物，其中所述鹽包含一價陽離子。
302.權(quán)利要求301的化合物，其中所述一價陽離子為鋰。
303.權(quán)利要求301的化合物，其中所述一價陽離子為鈉。
304.權(quán)利要求301的化合物，其中所述一價陽離子為鉀。
305.權(quán)利要求300的化合物，其中所述鹽包含二價陽離子。
306.權(quán)利要求305的化合物，其中所述二價陽離子為鈣、鎂或錳(II)。
307.權(quán)利要求300的化合物，其中所述鹽包含選自銨、三正丁基銨和(HOCH2)3CNH3+的陽離子。
308.一種對靶標(biāo)核酸進(jìn)行測序的方法，其包括如下步驟 (i)使引物的5’端附著于固體表面；( )使靶標(biāo)核酸與所述附著于固體表面的引物雜交；(iii)添加根據(jù)權(quán)利要求1-307中任一項的化合物，前提是在存在多于一種堿基類型時，每種堿基被附著于不同的報告基團(tuán)上；(iv)向引物/靶標(biāo)核酸雜交復(fù)合物中添加核酸復(fù)制酶，以將步驟(iii)所述組合物摻入延伸中的引物鏈中，其中所摻入的步驟(iii)所述組合物以約70%至約100%的效率終止聚合酶反應(yīng)；(ν)清洗所述固體表面以除去未摻入的組分；(vi)檢測所摻入的報告基團(tuán)，以鑒定所摻入的步驟(iii)所述組合物。(vii)進(jìn)行切割步驟，以除去終止性結(jié)構(gòu)部分，產(chǎn)生具有天然堿基的已延伸引物；(viii)清洗所述固體表面以除去被切下的終止性基團(tuán)；和(ix)重復(fù)步驟(iii)至(viii)—次或多次，以鑒定靶標(biāo)核酸中的多個堿基。
309.一種對靶標(biāo)核酸進(jìn)行測序的方法，其包括如下步驟(i)使靶標(biāo)核酸的5’端附著于固體表面；( )使引物與所述附著于固體表面的靶標(biāo)核酸雜交；(iii)添加根據(jù)權(quán)利要求1-307中任一項的化合物，前提是在存在多于一種堿基類型時，每種堿基被附著于不同的報告基團(tuán)上；(iv)向引物/靶標(biāo)核酸雜交復(fù)合物中加入核酸復(fù)制酶，以將步驟(iii)所述組合物摻入延伸的引物鏈中，其中所摻入的步驟(iii)所述組合物以約70%至約100%的效率終止聚合酶反應(yīng)；(ν)清洗所述固體表面以除去未摻入的組分；(vi)檢測所摻入的報告基團(tuán)，以鑒定所摻入的步驟(iii)所述組合物；(vii)任選地加入一種或多種化合物以使未延伸的引物永久加帽；(viii)進(jìn)行切割步驟以除去終止性結(jié)構(gòu)部分，產(chǎn)生帶有天然堿基的延伸引物；(ix)清洗所述固體表面以除去被切下的終止性基團(tuán)；和(x)重復(fù)步驟(iii)至(ix)—次或多次，以鑒定靶標(biāo)核酸中的多個堿基。
310.根據(jù)權(quán)利要求308或309中任一項的方法，其中所述化合物由核酸復(fù)制酶摻入，所述酶為DNA聚合酶。
311.權(quán)利要求310的方法，其中所述DNA聚合酶選自TaqDNA聚合酶、Klenow (exo-) DNA 聚合酶、Bst DNA 聚合酶、VENT (exo-)DNA 聚合酶(克隆自 Thermococcus Iitoralis 的 DNA 聚合酶 A，含有 D141A 和 E143A 突變),Pfu (exo-) DNA 聚合酶和 DEEPVENT (exo_) DNA 聚合酶(克隆自Pyrococcus物種GB-D的DNA聚合酶A，含有D141A和E143A突變)。
312.權(quán)利要求310的方法，其中所述DNA聚合酶選自AMPLITAQ DNA聚合酶、FS(含有 G46D 和 F667Y 突變的 iTaq DNA 聚合酶)、THERMOSEQUENASE DNA 聚合酶(含有 F667Y 突變的 Taq DNA聚合酶)、THERMOSEQUENASE II DNA聚合酶(THERMOSEQUENASE DNA聚合酶與T. acidophilum焦磷酸酶的混合物)、THERMINAT0R DNA聚合酶(克隆自Thermococcus 物種 9° N-7 的 DNA 聚合酶 A，含有 D141A、E143A 和 A485L 突變)、THERMINAT0R II DNA 聚合酶(額外含有Y409V突變的THERMINAT0R DNA聚合酶)和VENT (exo_) A488L DNA聚合酶(含有A488L突變的VENT (exo_) DNA聚合酶)。
313.根據(jù)權(quán)利要求308-312中任一項的方法，其中對所述終止性結(jié)構(gòu)部分的切割為化學(xué)切割、光切割、電化學(xué)切割或酶切割。
314.權(quán)利要求313的方法，其中所述化學(xué)切割使用催化劑或化學(xué)計量試劑進(jìn)行。
315.權(quán)利要求314的方法，其中所述催化劑是均相或非均相的。
316.權(quán)利要求315的方法，其中所述非均相催化劑包含鈀。
317.權(quán)利要求315的方法，其中所述均相催化劑包含鈀。
318.權(quán)利要求315-317中任一項的方法，其中85%至100%的可光切割終止性結(jié)構(gòu)部分通過光切割而被去除。
319.權(quán)利要求314的方法，其中使用波長為300nm至400nm的光進(jìn)行所述光切割。
320.權(quán)利要求319的方法，其中85%至100%的可光切割終止性結(jié)構(gòu)部分通過光切割而被去除。
321.使用根據(jù)權(quán)利要求1-307中任一項所述化合物進(jìn)行Mnger測序或Sanger型測序
322.使用根據(jù)權(quán)利要求1-307中任一項所述化合物進(jìn)行焦磷酸測序或焦磷酸型測序的方法。
全文摘要
本發(fā)明總體而言涉及標(biāo)記和未標(biāo)記的可切割終止性基團(tuán)以及用于DNA測序和其它類型DNA分析的方法。更具體地，本發(fā)明部分涉及帶有可化學(xué)切割、可光切割、可酶切割或非可光切割基團(tuán)的核苷酸和核苷，以及將其用于DNA測序的方法及其在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/68GK102264917SQ200980131339
公開日2011年11月30日 申請日期2009年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月11日
發(fā)明者吳衛(wèi)東, 布賴恩·P·斯圖皮, 弗拉迪斯拉夫·A·利托什, 梅根·N·赫什, 邁克爾·L·梅茨克 申請人:激光基因公司