專(zhuān)利名稱(chēng)：用于哺乳動(dòng)物干細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的生物相容性材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供具有影響細(xì)胞功能和胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)的表面結(jié)構(gòu)和組成成分的生物相容性材料。第一個(gè)方面，本發(fā)明提供具有用作促進(jìn)未分化的多能干細(xì)胞生長(zhǎng)或用作促進(jìn)干細(xì)胞均一分化性生長(zhǎng)的組成成分和表面結(jié)構(gòu)的生物相容性材料。第二方面，本發(fā)明提供體內(nèi)和離體影響細(xì)胞功能，特別是與基因誘導(dǎo)、細(xì)胞分化和骨組織形成有關(guān)的細(xì)胞功能的表面結(jié)構(gòu)和組成成分的生物相容性材料。
背景技術(shù)：
關(guān)于本發(fā)明的第一個(gè)方面，在許多應(yīng)用中，例如未分化的哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞的產(chǎn)生和/或其均一分化性生長(zhǎng)，提高選定的細(xì)胞功能是一項(xiàng)重要任務(wù)。特別是哺乳動(dòng)物胚胎干[ES]細(xì)胞的治療性應(yīng)用引起了人們極大的關(guān)注，越來(lái)越需要制備未分化的哺乳動(dòng)物 ES細(xì)胞以及引導(dǎo)并控制其分化的方法。因此，需要有助于/促進(jìn)這些過(guò)程的合適微環(huán)境。 因此需要ES細(xì)胞可在其表面附著、生長(zhǎng)和/或分化和/或進(jìn)一步執(zhí)行各種生物功能的生物相容性材料以滿足各種治療目的。其治療可受益于這類(lèi)材料的病癥包括退變性疾病、癌癥和肌肉骨骼器官創(chuàng)傷，都為公共衛(wèi)生方面帶來(lái)了越來(lái)越多的問(wèn)題。對(duì)ES細(xì)胞培養(yǎng)方案有3個(gè)主要的要求。第一，在ES細(xì)胞培養(yǎng)期間，細(xì)胞必須接受來(lái)自培養(yǎng)基的可溶性因子和來(lái)自生長(zhǎng)支持體的適當(dāng)刺激以維持多能性。第二，應(yīng)當(dāng)保持染色體完整性。第三，為了利于哺乳動(dòng)物ES細(xì)胞用于醫(yī)學(xué)目的，細(xì)胞絕不能與來(lái)源于其他物種的生物材料接觸，因?yàn)楫惙N污染物在移植到患者體內(nèi)時(shí)很可能引起免疫原性問(wèn)題?，F(xiàn)有的培養(yǎng)方案一般依賴(lài)于使用動(dòng)物來(lái)源的生物材料，其中ES細(xì)胞在一層飼養(yǎng)細(xì)胞和血清上生長(zhǎng)。已經(jīng)披露了用于鼠ES細(xì)胞的無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞和無(wú)血清的培養(yǎng)條件，例如使用涂布明膠的培養(yǎng)皿結(jié)合補(bǔ)充了白血病抑制因子(LIF)的培養(yǎng)基，但是這些培養(yǎng)系統(tǒng)費(fèi)用昂貴，而且并不總能產(chǎn)生適于所有治療形式的ES細(xì)胞。此外，未來(lái)的醫(yī)學(xué)治療的目標(biāo)在于應(yīng)用分化的ES細(xì)胞移植入患者體內(nèi)。為此目的必須確保所有ES細(xì)胞的均一分化，因?yàn)橹踩胛镏写嬖诘奈捶只?xì)胞可能在患者體外引起畸胎瘤，對(duì)于現(xiàn)有分化方案這仍然是個(gè)問(wèn)題。綜上所述，非常需要開(kāi)發(fā)無(wú)異種物的ES細(xì)胞培養(yǎng)條件，即其中細(xì)胞保持多能性和染色體完整性的條件以及其中細(xì)胞以均一的、受控方式進(jìn)行分化的條件。關(guān)于本發(fā)明的第二個(gè)方面，在各種應(yīng)用中，提高選定的細(xì)胞功能(例如開(kāi)發(fā)合適的植入物)是一項(xiàng)重要的任務(wù)。需要活細(xì)胞可在其上面附著、生長(zhǎng)和/或分化和/或進(jìn)一步執(zhí)行各種生物功能的生物相容性材料用于各自治療目的。退變性疾病、癌癥和肌肉骨骼器官創(chuàng)傷為公共衛(wèi)生方面帶來(lái)越來(lái)越多的問(wèn)題。僅脊柱病癥就累及成年人口的30%，65歲以上人群中40%有骨關(guān)節(jié)炎癥狀。全球每年進(jìn)行 130萬(wàn)例以上的關(guān)節(jié)異質(zhì)成形術(shù)以治療衰弱性末期關(guān)節(jié)炎。由于沒(méi)有可接受的防止骨關(guān)節(jié)炎的療法，因此預(yù)計(jì)在接下來(lái)的幾十年內(nèi)，由于西方人口老齡化而進(jìn)行的關(guān)節(jié)成形術(shù)的數(shù)目將急劇上升。目前在歐洲和美國(guó)，全部衛(wèi)生保健費(fèi)用的25%以上都與肌肉骨骼病癥有關(guān)， 在美國(guó)治療這類(lèi)病癥的預(yù)算(2540億美元)是例如用于研究和教育的資源總額的兩倍。
這些疾病的主要外科治療依靠使用金屬醫(yī)療植入物結(jié)合骨或骨替代物。為了獲得良好的臨床效果，必須將植入物成功地整合到骨組織中。在過(guò)去幾十年間，在這個(gè)領(lǐng)域已經(jīng)取得了重大進(jìn)展和結(jié)果，但是植入物隨時(shí)間松脫仍是成功長(zhǎng)期關(guān)節(jié)置換的一個(gè)重大問(wèn)題。 僅現(xiàn)有的植入物表面不能夠橋接較大的骨缺損和保持長(zhǎng)期穩(wěn)定性。使用從患者自身取出的骨移植物來(lái)解決這些問(wèn)題繼發(fā)15-30%的高供區(qū)病損。多達(dá)20%進(jìn)行髖關(guān)節(jié)置換的患者在最初手術(shù)的10-15年內(nèi)在修復(fù)區(qū)周?chē)l(fā)生骨損失，在脊柱融合術(shù)中，20-30%的患者的融合不佳。此外，因?yàn)樵诓痪玫膶?lái)患者群將包括大量較年青的患者，預(yù)計(jì)有關(guān)長(zhǎng)期無(wú)菌植入物松脫的問(wèn)題會(huì)急劇增加。因此，就生命質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)性?xún)烧叨?，改進(jìn)骨組織中的植入物性能將具有深遠(yuǎn)的影響。WHO已經(jīng)認(rèn)識(shí)到了這一點(diǎn)，并把2000-2010年定為“骨與關(guān)節(jié)十年行動(dòng)(Bone and Joint Decade) ” (http: //www. bone jointdecade. org/)，這一倡議也得到了丹麥衛(wèi)生部的認(rèn)可。體內(nèi)植入物的生物相容性/生物整合極其復(fù)雜，包括傳統(tǒng)上屬于醫(yī)學(xué)科學(xué)、表面科學(xué)、材料科學(xué)和分子生物技術(shù)的方法。當(dāng)把植入物置入組織中時(shí)，便立即開(kāi)始了對(duì)表面的競(jìng)爭(zhēng)。在植入物嵌入機(jī)體后幾毫秒內(nèi)，便在植入物表面上形成由來(lái)自生理液體中的水、蛋白質(zhì)和其它生物分子組成的生物層。隨后，由于生物層中的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的刺激，組織周?chē)募?xì)胞遷移到植入物附近區(qū)域。從而通過(guò)這個(gè)生物層介導(dǎo)了植入物表面與細(xì)胞之間的相互作用。植入物表面的性質(zhì)對(duì)此層性質(zhì)的影響非常強(qiáng)，需要了解并控制這種影響以?xún)?yōu)化生物相容性。同樣重要的是細(xì)胞的性質(zhì)，例如其通過(guò)信號(hào)分子遍及胞外基質(zhì)的溝通能力。在骨愈合期間，許多生物活性信號(hào)分子控制骨生成，而且發(fā)現(xiàn)一些蛋白質(zhì)能夠刺激骨向植入物的修復(fù)。無(wú)論植入物是否以足夠的機(jī)械強(qiáng)度成功地錨定在患者骨內(nèi)，或者不論針對(duì)植入物的炎性反應(yīng)是否發(fā)生，所有這些機(jī)制都引起組織對(duì)植入物的反應(yīng)和影響，這最終將導(dǎo)致無(wú)菌性松脫和手術(shù)失敗。需要骨組織細(xì)胞可在其上面附著和/或生長(zhǎng)以及進(jìn)一步執(zhí)行各種生物功能的生物相容性材料用于治療目的，特別是在包括引入植入物(例如假體和骨替代物)的外科治療。這類(lèi)治療要獲得成功的結(jié)果面臨著巨大的挑戰(zhàn)，因?yàn)橹踩胛锉仨毷菇M織在植入物部位再生，同時(shí)避免成為機(jī)體自身強(qiáng)大排斥機(jī)制的目標(biāo)。植入物的臨床成功取決于植入物與宿主組織之間的緊鄰界面上的細(xì)胞行為。因此該領(lǐng)域發(fā)展的關(guān)鍵要素取決于在制備這些植入物中生物相容性材料的鑒定和用途。骨組織包括骨祖細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞類(lèi)型。骨髓基質(zhì)細(xì)胞(MSC)是產(chǎn)生骨祖細(xì)胞和其它細(xì)胞類(lèi)型這兩者的多能干細(xì)胞。骨祖細(xì)胞可分化并形成成骨細(xì)胞，特別在響應(yīng)骨再生時(shí)。由骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的骨成形蛋白(BMP和其它生長(zhǎng)激素)用于募集骨祖細(xì)胞并刺激它們成熟成為成骨細(xì)胞。成骨細(xì)胞分泌例如TGF-β BMP、其它激素和生長(zhǎng)因子等，其既可用作骨祖細(xì)胞的趨化引誘物，又可刺激成骨細(xì)胞的成熟并誘導(dǎo)骨基質(zhì)的形成。成骨細(xì)胞合成并分泌有機(jī)骨基質(zhì)(像膠原纖維、蛋白聚糖、骨鈣蛋白、骨粘連蛋白和骨橋蛋白)，因此成骨細(xì)胞在礦化骨基質(zhì)的沉積中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在骨礦化期間，成骨細(xì)胞表達(dá)堿性磷酸酶以及多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)激素。在正在進(jìn)行的開(kāi)發(fā)改進(jìn)的生物相容性材料中，需要鑒定其結(jié)構(gòu)與移植手術(shù)相容并誘導(dǎo)骨再生的材料。
此外，在最近幾年，胚胎干細(xì)胞的治療性應(yīng)用引起了人們極大的關(guān)注，越來(lái)越需要引導(dǎo)并控制胚胎干細(xì)胞的分化。因此，需要有助于/促進(jìn)這些過(guò)程的合適的微環(huán)境。發(fā)明概述本發(fā)明的第一個(gè)方面基于這樣的認(rèn)識(shí)，在機(jī)體或細(xì)胞培養(yǎng)物中各干細(xì)胞在微米和納米結(jié)構(gòu)水平上接觸其周?chē)M織或組織培養(yǎng)物表面構(gòu)造，其中通過(guò)提供具有微米級(jí)特征的界定表面形貌的生物相容性材料或結(jié)構(gòu)來(lái)滿足上述需要，所述材料或結(jié)構(gòu)可用于構(gòu)建細(xì)胞或組織培養(yǎng)物表面和/或裝置以用于手術(shù)性治療/治療性治療。這類(lèi)干細(xì)胞的實(shí)例是胚胎干細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)干細(xì)胞是指能夠使未分化細(xì)胞生長(zhǎng)以產(chǎn)生多能干細(xì)胞以及使分化細(xì)胞生長(zhǎng)的任何細(xì)胞種類(lèi)。術(shù)語(yǔ)多能干細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物源的干細(xì)胞，例如嚙齒動(dòng)物或人干細(xì)胞。本發(fā)明特別提供多能哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞，包括種系傳遞的多能胚胎干細(xì)胞。制備具有所需表面形貌的結(jié)構(gòu)(其可以完全是人工的或可以模擬實(shí)際觀察到的表面構(gòu)造)需要能夠界定微米級(jí)或納米級(jí)尺寸的特征的技術(shù)。本發(fā)明利用微米及納米技術(shù)中目前開(kāi)發(fā)的工具和技術(shù)，使得可以設(shè)計(jì)和構(gòu)建其表面構(gòu)造具有微米或納米級(jí)的橫向特征大小(a lateral feature size)的結(jié)構(gòu)。可以通過(guò)例如通過(guò)鐵蛋白的膠體蝕刻法 (colloidal lithography)，隨后除去離子點(diǎn)之后留下的有機(jī)相，來(lái)獲得這種特征尺寸。特別是應(yīng)用電子束蝕刻法和光刻法可制備界線十分清晰以及可在相關(guān)應(yīng)用中精確重現(xiàn)的表面形貌。特別是研究發(fā)現(xiàn)，由表面伸出來(lái)、間隔開(kāi)的突出物的規(guī)則形式對(duì)促進(jìn)未分化干細(xì)胞的生長(zhǎng)以及其均一分化性生長(zhǎng)特別有效。發(fā)現(xiàn)突出物的尺寸和突出物之間間隙的尺寸是相關(guān)聯(lián)的參數(shù)。因此，一方面，本發(fā)明涉及使用細(xì)胞或組織培養(yǎng)容器促進(jìn)一種或多種未分化多能哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)，所述一種或多種細(xì)胞能夠種系傳遞，所述容器具有在使用期間暴露于培養(yǎng)物的表面，其中至少部分表面為生物相容性材料，其中至少部分生物相容性材料的暴露表面具有納米和/或微米級(jí)形貌結(jié)構(gòu)，所述形貌結(jié)構(gòu)包含排列在規(guī)則二維網(wǎng)格格點(diǎn)上的大量突出物，其特征在于突出物的橫截面積等于或小于所述結(jié)構(gòu)總面積的25%，所述面積以所述結(jié)構(gòu)暴露表面平面測(cè)得，其中突出物的密度等于或大于1個(gè)突出物/65 μ m2， 且其中所述形貌結(jié)構(gòu)的每個(gè)突出物的垂直高度/深度尺寸等于或大于1. 6 μ m，又或者等于或大于3. 0 μ m ；優(yōu)選介于2. 0 μ m-3. 0 μ m之間，更優(yōu)選2. 4 μ m。突出物可具有橫截面，最小橫截面徑介于0. 1 μ m和4. 0 μ m之間，或介于0. 5 μ m 和1.5μπι之間，且其中任何突出物與其最近鄰?fù)怀鑫镏g的間隙的水平尺寸(d;Y)可介于約0. 5 μ m-8. 0 μ m之間，或介于約1 μ m_6 μ m之間，或介于約2 μ m_6 μ m之間，或介于約 1 μ m-4 μ m之間。沿至少一維的相鄰格點(diǎn)之間的最小距離一般小于8. 0 μ m，或介于0. 5 μ m 禾口 6· Ομπι之間。突出物可具有相同的橫截面幾何形狀或至少兩種不同的橫截面幾何形狀，其可具有不同的橫截面積。突出物的橫向截面可具有由周緣定義的形狀和/或選自以下的幾何形狀環(huán)形、凹形、凸形、圓形、星形、正方形、長(zhǎng)方形、六邊形和多邊形或其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，不同橫截面幾何形狀的突出物以交替方式排列在規(guī)則二維網(wǎng)格上。至少部分的容器表面可涂覆選自鉭、鈦、鉬或其氧化物的材料。所述表面的至少一部分可包含選自以下的聚合物聚苯乙烯、聚己酸內(nèi)酯聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、 脫乙酰殼多糖或其組合。表面還可含有選自以下的化合物多肽、碳水化合物、脂質(zhì)、生長(zhǎng)激素、抗體、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、多糖、脂質(zhì)、有機(jī)化合物和無(wú)機(jī)化合物，其中化合物可吸附在容器的暴露表面或以化學(xué)方式與容器的暴露表面連接。合適的生長(zhǎng)激素包括 BMP、EGF 樣、TGF- β、IGF 禾口 LIF。細(xì)胞或組織培養(yǎng)容器還可進(jìn)一步通過(guò)例如納米晶金剛石、等離子體聚合、氧等離子體或氮等離子體進(jìn)行化學(xué)官能化。本發(fā)明還提供用于制備本發(fā)明的細(xì)胞或組織培養(yǎng)容器的印模(stamp)或掩模 (mask)，容器至少部分由生物相容性材料制備，而印模適于將形貌表面結(jié)構(gòu)壓印入或提供給生物相容性材料的表面。本發(fā)明還提供用于促進(jìn)未分化多能哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)的具有上述特征的細(xì)胞或組織培養(yǎng)容器，其中所述形貌結(jié)構(gòu)的每個(gè)突出物的垂直高度/深度尺寸約為 2. 4 μ m0另一方面，本發(fā)明提供促進(jìn)一種或多種未分化多能哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，所述一種或多種能夠種系傳遞，所述方法包括使細(xì)胞與具有暴露于干細(xì)胞的表面的細(xì)胞或組織培養(yǎng)容器接觸，其中至少部分表面為生物相容性材料，其中至少部分生物相容性材料的暴露表面具有納米和/或微米級(jí)形貌結(jié)構(gòu)，所述形貌結(jié)構(gòu)包含排列在規(guī)則二維網(wǎng)格格點(diǎn)上的大量突出物，其中選擇所述結(jié)構(gòu)以促進(jìn)未分化哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞的生長(zhǎng)，其特征在于突出物的橫截面積等于或小于所述結(jié)構(gòu)總面積的25%，所述面積以所述結(jié)構(gòu)暴露表面平面測(cè)量，其中突出物的密度等于或大于1個(gè)突出物/65 μ m2，且其中所述形貌結(jié)構(gòu)的每個(gè)突出物的垂直高度/深度尺寸為等于或大于1. 6 μ m，等于或大于3. 0 μ m，或介于 2. 0μ -3. Ομ 之間，或約 2. 4μπ 。按照本發(fā)明的這個(gè)方面，突出物可具有橫截面，且最小橫截面徑介于0. 1 μ m和 4.0 μ m之間，或介于0. 5 μ m和1. 5 μ m之間；任何突出物與其最近鄰?fù)怀鑫镏g的間隙的水平尺寸(d;Y)可介于約0. 5μ -8. Ομ 之間或介于約1μ -4μπ 之間。沿至少一維的相鄰格點(diǎn)之間的最小距離可小于8. 0 μ m，或者介于0. 5 μ m禾Π 6. 0 μ m之間。此外，所述結(jié)構(gòu)可包括至少兩種不同的由周緣定義的形狀和/或選自以下幾何形狀的突出物環(huán)形、圓形、星形、正方形、長(zhǎng)方形、六邊形和多邊形或其組合，所述形狀具有不同的橫截面積。不同橫截面幾何形狀的突出物可以交替方式排列在規(guī)則二維網(wǎng)格上。此外，所述表面的至少一部分可以是涂鉭和/或涂鈦的表面，且所述表面的至少一部分可由聚合物組成，聚合物包括聚苯乙烯、聚己酸內(nèi)酯聚乳酸或脫乙酰殼多糖。表面上的其它化合物可包括以下的一種或多種多肽、碳水化合物、脂質(zhì)、生長(zhǎng)激素、抗體、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、多糖、脂質(zhì)、有機(jī)化合物和無(wú)機(jī)化合物，其中所述化合物吸附在容器的表面層上或者與容器的表面層化學(xué)連接、固定化或絡(luò)合。合適的生長(zhǎng)激素包括BMP、EGF 樣、TGF- β、IGF和白血病抑制因子或其組合。此外，細(xì)胞或組織培養(yǎng)容器可通過(guò)例如納米晶金剛石、等離子體聚合、氧等離子體或氮等離子體進(jìn)行化學(xué)官能化。另一方面，本發(fā)明涉及促進(jìn)哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞的均一分化性生長(zhǎng)從而有利于產(chǎn)生分化細(xì)胞群的細(xì)胞或組織培養(yǎng)容器的用途，分化細(xì)胞群中未分化細(xì)胞的數(shù)目顯著降低，使得當(dāng)與現(xiàn)有分化方案相比時(shí)，在治療中使用分化細(xì)胞(例如植入物)使得未分化細(xì)胞可能給患者帶來(lái)畸胎瘤的風(fēng)險(xiǎn)降低。因此，本發(fā)明提供一種容器，所述容器具有在使用期間暴露于培養(yǎng)物的表面，其中至少部分表面為生物相容性材料，其中至少部分生物相容性材料的暴露表面具有納米和/或微米級(jí)形貌結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)包含排列在規(guī)則二維網(wǎng)格格點(diǎn)上的大量突出物，其特征在于突出物具有橫截面和介于1. 0 μ m-8. 0 μ m之間的橫截面徑，其中任何突出物與其最近鄰?fù)怀鑫镏g的最大間隙的水平尺寸(d;Y)介于1.0μπι-2.0μπι之間，且其中所述形貌結(jié)構(gòu)的每個(gè)突出物的垂直高度/深度尺寸等于或小于1. 0 μ m，優(yōu)選介于0. 6 μ m-1. 0 μ m之間，更優(yōu)選約0. 6 μ m。本發(fā)明中，使用細(xì)胞或組織培養(yǎng)容器可供產(chǎn)生其中未分化細(xì)胞的數(shù)目顯著降低的分化細(xì)胞群，當(dāng)與現(xiàn)有細(xì)胞分化方案相比時(shí)，在植入物中使用如此產(chǎn)生的細(xì)胞使得移植細(xì)胞可能給患者帶來(lái)畸胎瘤的風(fēng)險(xiǎn)降低。此外，一個(gè)或多個(gè)突出部分的橫向截面可具有由周緣定義的形狀和/或選自以下的幾何形狀環(huán)形、凹形、凸形、圓形、星形、正方形、長(zhǎng)方形、六邊形或多邊形。此外，表面可包括具有正方形橫向截面的突出部分和具有長(zhǎng)方形橫向截面的突出部分，其中突出部分的第一橫截面徑為1.0 μ m，突出部分的第二橫截面徑介于 Ι.Ομ m-8. Oym之間，或介于1. 0 μ m-6. Oym之間，且其中突出部分的垂直高度/深度尺寸等于或小于1. 0 μ m，優(yōu)選介于0. 6 μ m-1. Oym之間，更優(yōu)選約0. 6 μ m。此外，所述表面的至少一部分可以是涂鉭和/或涂鈦的表面，且所述表面的至少一部分可包含選自以下的聚合物聚苯乙烯、聚己酸內(nèi)酯聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、脫乙酰殼多糖或其組合。表面還可含有選自以下的化合物多肽、碳水化合物、脂質(zhì)、生長(zhǎng)激素、抗體、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、多糖、脂質(zhì)、有機(jī)化合物和無(wú)機(jī)化合物，其中所述化合物吸附在容器的暴露表面上。另一方面，本發(fā)明涉及促進(jìn)哺乳動(dòng)物胚胎細(xì)胞均一分化性生長(zhǎng)的方法，所述方法包括使細(xì)胞與具有暴露于干細(xì)胞的表面的細(xì)胞或組織培養(yǎng)容器接觸，其中至少部分表面為生物相容性材料，其中至少部分生物相容性材料的暴露表面具有納米和/或微米級(jí)形貌結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)包含排列在規(guī)則二維網(wǎng)格格點(diǎn)上的大量突出物，其特征在于突出物具有橫截面和介于1.0 μ m-8. 0 μ m之間的橫截面徑，其中任何突出物與其最近鄰?fù)怀鑫镏g的最大間隙的水平尺寸(d;Y)介于Ι.Ομ m-2.0 μ m之間，且其中每個(gè)突出物的垂直高度/深度尺寸等于或小于1. 0 μ m，優(yōu)選介于0. 6 μ m-1. Oym之間，更優(yōu)選約0. 6 μ m。按照這個(gè)方面，一個(gè)或多個(gè)突出部分的橫向截面可具有由周緣定義的形狀和/或選自以下的幾何形狀環(huán)形、圓形、正方形和長(zhǎng)方形。此外，表面可包括具有正方形橫向截面的突出部分和具有長(zhǎng)方形橫向截面的突出部分，其中突出部分的第一橫截面徑為1.0 μ m，突出部分的第二橫截面徑介于 Ι.Ομ m-8. Oym之間，或介于Ι.Ομ m-6. Oym之間，且其中突出部分的垂直高度/深度尺寸等于或小于1. 0 μ m，優(yōu)選介于0. 6 μ m-1. Oym之間，更優(yōu)選約0. 6 μ m。此外，所述表面的至少一部分可以是涂鉭和/或涂鈦的表面，且所述表面的至少一部分可包含選自以下的聚合物聚苯乙烯、聚己酸內(nèi)酯聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、脫乙酰殼多糖或其組合。表面還可含有選自以下的化合物多肽、碳水化合物、脂質(zhì)、生長(zhǎng)激素、抗體、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、多糖、脂質(zhì)、有機(jī)化合物和無(wú)機(jī)化合物，其中所述化合物吸附在容器的暴露表面上。
本發(fā)明的第二個(gè)方面基于這樣的認(rèn)識(shí)，即在機(jī)體或細(xì)胞培養(yǎng)物中各個(gè)細(xì)胞在微米和納米結(jié)構(gòu)水平上接觸其周?chē)M織或組織培養(yǎng)物表面構(gòu)造，這樣的需要通過(guò)提供具有微米級(jí)特征的界定表面形貌的生物相容性材料或結(jié)構(gòu)來(lái)滿足，所述材料或結(jié)構(gòu)可用于構(gòu)建細(xì)胞或組織培養(yǎng)物表面和/或植入物和裝置以用于手術(shù)性治療/治療性治療。這類(lèi)細(xì)胞的實(shí)例是成骨細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)成骨細(xì)胞是指能夠形成骨的任何種類(lèi)的細(xì)胞， 包括天然細(xì)胞類(lèi)型和/或修飾細(xì)胞類(lèi)型，例如通過(guò)遺傳技術(shù)修飾。其它實(shí)例包括胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)元。制備具有所需表面形貌的結(jié)構(gòu)(其可以完全是人工的或可以模擬實(shí)際觀察到的表面構(gòu)造)需要能夠界定具有微米級(jí)或納米級(jí)尺寸的特征的技術(shù)。具體來(lái)說(shuō)，已經(jīng)證明當(dāng)這類(lèi)生物相容性材料表面的至少一部分的特征在于微米級(jí)形貌結(jié)構(gòu)時(shí)，各種不同細(xì)胞類(lèi)型中的至少一種的多種細(xì)胞功能得到顯著改進(jìn)。特別是發(fā)現(xiàn)由表面延伸出來(lái)的間隔開(kāi)的突出物的規(guī)則形式對(duì)于促進(jìn)上述細(xì)胞功能特別有效。本發(fā)明提供用于骨組織植入的醫(yī)學(xué)植入物，醫(yī)學(xué)植入物包含表面，其中至少部分表面為生物相容性材料，其中生物相容性材料的表面的至少一部分的特征在于包含排列在規(guī)則二維網(wǎng)格格點(diǎn)上的大量突出物的納米和/或微米級(jí)形貌結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)能夠通過(guò)在成骨細(xì)胞中表達(dá)骨橋蛋白和骨鈣蛋白而促進(jìn)骨生成，其中突出物具有最小橫截面徑為 Ι.Ομ m-2. Oym的橫截面，其中沿至少一維的相鄰格點(diǎn)之間的距離介于2. 0 μ m和9. 0 μ m 之間，其中形貌結(jié)構(gòu)的各個(gè)突出物的垂直高度/深度尺寸等于或大于1. 60 μ m，優(yōu)選約 2. 4 μ m0在醫(yī)學(xué)植入物的又一個(gè)方面，任何突出物與其最近鄰?fù)怀鑫镏g的最大間隙的水平尺寸(d;Y)可介于約1.0μπι-6.0μπι之間。此外，橫截面的橫截面徑可約為1 μ m，任何突出物與其最近鄰?fù)怀鑫镏g的最小間隙的水平尺寸(d;Y)可約為Ι.Ομπι。在醫(yī)學(xué)植入物的又一個(gè)方面，所述結(jié)構(gòu)可包括具有至少兩種不同的橫截面幾何形狀的突出物，例如環(huán)形、凹形、凸形、圓形、正方形和長(zhǎng)方形或其組合；其可具有不同的橫截面積，其中不同橫截面幾何形狀的突出物可以交替方式排列在規(guī)則二維網(wǎng)格上。在醫(yī)學(xué)植入物的又一個(gè)方面，突出物可位于二維規(guī)則網(wǎng)格的格點(diǎn)上，使得只有子集部分格點(diǎn)被突出物覆蓋。此外，突出物可以平行排列，其中相鄰?fù)怀鑫镏g中心至中心的距離在相鄰排中不同。此外，所述周期性形貌結(jié)構(gòu)的特征中心可置于網(wǎng)格常數(shù)為a和b的二維長(zhǎng)方形網(wǎng)格的格點(diǎn)上，其中網(wǎng)格為正方形網(wǎng)格，每個(gè)方向的網(wǎng)格常數(shù)(a = b)的間距介于2_8μπι之間，或者網(wǎng)格為長(zhǎng)方形，第一方向的網(wǎng)格常數(shù)(a)的間距介于2_8μπι之間， 第二方向的網(wǎng)格常數(shù)(b)的間距介于1_4μπι之間。在醫(yī)學(xué)植入物的又一個(gè)方面，所述表面的至少一部分是涂鉭和/或涂鈦的表面或其任何氧化物的表面；和/或所述表面的至少一部分由生物可降解聚合物(像聚乳酸或聚乳酸-羥基乙酸共聚物)組成。此外，所述表面還包含選自以下的吸附的化合物多肽、碳水化合物、脂質(zhì)、生長(zhǎng)激素、抗體、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、多糖、脂質(zhì)、有機(jī)化合物和無(wú)機(jī)化合物。合適的生長(zhǎng)激素包括BMP、EGF樣、TGF-β和IGF。本發(fā)明的醫(yī)學(xué)植入物可以為手術(shù)植入物，例如用于治療患有疾病(例如牙科疾病、矯形病癥或肺心病)的人或動(dòng)物的牙科植入物、矯形植入物、支架、心臟瓣膜。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)醫(yī)療裝置的印?；蜓谀?，醫(yī)療裝置至少部分由生物相容性材料制備，印模適于將形貌表面結(jié)構(gòu)印壓入或提供給所述生物相容性材料的表面。本發(fā)明的又一個(gè)方面涉及在細(xì)胞培養(yǎng)期間促進(jìn)分化細(xì)胞的基因表達(dá)的細(xì)胞或組織培養(yǎng)容器的用途，容器具有在使用期間暴露于細(xì)胞培養(yǎng)物的表面，其中至少部分表面為生物相容性材料，其中生物相容性材料的表面的至少一部分的特征在于納米和/或微米級(jí)形貌結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含大量突出物排列在規(guī)則二維網(wǎng)格的格點(diǎn)上，其中突出物具有最小橫截面徑為1. 0 μ m-2. 0 μ m的橫截面，其中沿至少一維的相鄰格點(diǎn)之間的距離介于2. 0 μ m和 9. 0 μ m之間，其中形貌結(jié)構(gòu)的各個(gè)突出物的垂直高度/深度尺寸等于或大于1. 60 μ m,優(yōu)選約 2. 4 μ m。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于制備醫(yī)學(xué)植入物的生物相容性涂層材料，其中生物相容性涂層材料包含上述生物相容性材料。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供通過(guò)在成骨細(xì)胞中表達(dá)骨橋蛋白和骨鈣蛋白而促進(jìn)骨生成的方法，所述方法包括使細(xì)胞與生物相容性材料接觸，其中生物相容性材料的表面的至少一部分的特征在于納米和/或微米級(jí)形貌結(jié)構(gòu)，其包含大量突出物排列在規(guī)則二維網(wǎng)格的格點(diǎn)上，其中突出物具有最小橫截面徑為1.0μπι-2.0μπι的橫截面，其中沿至少一維的相鄰格點(diǎn)之間的距離介于2. 0 μ m和8. 0 μ m之間，其中形貌結(jié)構(gòu)的各個(gè)突出物的垂直高度/深度尺寸等于或大于1. 60 μ m,優(yōu)選約2. 4 μ m。附圖簡(jiǎn)述下面將結(jié)合實(shí)施方案并參照附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更全面地說(shuō)明，其中

圖1圖示一種篩選工具的實(shí)例-所謂的BioSurface Structure Array(BSSA)圓片(wafer)的頂視圖，用于鑒定促進(jìn)/提高細(xì)胞功能(例如成骨細(xì)胞的礦化或胚胎干細(xì)胞、 成人干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞等干細(xì)胞的生長(zhǎng)/分化或神經(jīng)元的生長(zhǎng))的形貌結(jié)構(gòu)。圖2圖示圖1篩選工具沿A-B線的剖視圖。圖3圖示形貌結(jié)構(gòu)的頂視圖(圖3a)和剖視圖(圖北)，顯示交替形式的槽寬 Χ(μπ )和脊寬 Υ(μ )。圖4圖示形貌結(jié)構(gòu)的頂視圖(圖4a)和剖視圖(圖4b)，包括正方形孔和預(yù)定間距。圖5圖示形貌結(jié)構(gòu)的頂視圖(圖5a)和剖視圖(圖5b、圖5c)，包括X ( μ m) χ Y(ym)的長(zhǎng)方形孔，間隔脊寬為X μπι。圖6圖示包含預(yù)定尺寸和預(yù)定間距的柱(pillar)的形貌結(jié)構(gòu)的頂視圖(圖6a) 和剖視圖(圖6b)。圖7圖示包含交替的正方形孔和柱的形貌結(jié)構(gòu)的頂視圖。圖8圖示形貌結(jié)構(gòu)的頂視示意圖，其中每個(gè)突出部分(柱)的中心位于二維網(wǎng)格 (例如具有預(yù)定網(wǎng)格常數(shù)的六邊形、長(zhǎng)方形或正方形網(wǎng)格)的格點(diǎn)上，這些結(jié)構(gòu)用來(lái)測(cè)定未分化或分化模式的胚胎干細(xì)胞的生長(zhǎng)。圖9圖示具有微米級(jí)結(jié)構(gòu)的暴露表面的組織培養(yǎng)皿的剖視圖。圖10圖示在飼養(yǎng)細(xì)胞中(左圖)或在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞但補(bǔ)充了明膠的培養(yǎng)基中 (右圖)生長(zhǎng)兩天的KH2ES細(xì)胞的集落形態(tài)和分化狀態(tài)。標(biāo)出了未分化的和分化的ES細(xì)胞集落的實(shí)例。DICjIOx0
圖11圖示接種在包含一式三份結(jié)構(gòu)高度各為0.6 μ m、l. 6 μ m和2. 4μπι的鉭形貌結(jié)構(gòu)庫(kù)的BSSA圓片上的CJ7 (下排)或ΚΗ2 (上排)ES細(xì)胞。圖12圖示在Fl. 2、F4. 1和K8各結(jié)構(gòu)的BSSA圓片上培養(yǎng)3天后被固定和AP活性染色的CJ7 (左圖)和KH2 (右圖)ES細(xì)胞。NS 非結(jié)構(gòu)化正方形，其中圓片上結(jié)構(gòu)的高度/ 深度為0. 6 μ m、1. 6 μ m或2. 4 μ m。不同的背景色彩是由于鉭結(jié)構(gòu)上的光反射而引起的。直線比例尺:160μπι，5χ。圖13圖示對(duì)自動(dòng)集落計(jì)數(shù)的評(píng)價(jià)。對(duì)具有三種不同結(jié)構(gòu)高度(0.6μπι、1.6μπι和 2.4ym)的選定結(jié)構(gòu)進(jìn)行未分化KH2ES細(xì)胞集落的自動(dòng)(Auto)和手工(Man)計(jì)數(shù)。值為一式三份的平均值。根據(jù)集落大小進(jìn)行自動(dòng)計(jì)數(shù)。根據(jù)集落形態(tài)和AP染色強(qiáng)度進(jìn)行手工計(jì)數(shù)。圖14圖示在BSSA圓片上培養(yǎng)3天后通過(guò)自動(dòng)計(jì)數(shù)(3個(gè)值的平均值)檢出的未分化CJ7和KH2ES細(xì)胞集落的數(shù)目。A-J結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)按結(jié)構(gòu)尺寸X和Y排序。K結(jié)構(gòu)用按T 值排序的獨(dú)立表格表示。不同的色度用于不同的結(jié)構(gòu)高度0. 6 μ m、1.6 μ m和2.4 μ m。NS
非結(jié)構(gòu)化。圖15圖示ES細(xì)胞集落數(shù)與ES細(xì)胞在其上面生長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)的尺寸。對(duì)于三種結(jié)構(gòu)高度/深度(0. 6 μ m、1. 6 μ m和2. 4 μ m)每一種，合并各個(gè)ES細(xì)胞系CJ7和KH2從具有相同X和Y尺寸的結(jié)構(gòu)A-J得到的數(shù)據(jù)。每條曲線代表一個(gè)固定的X值，水平軸為Y值。垂直軸給出平均集落數(shù)。圖16圖示ES細(xì)胞集落數(shù)與ES細(xì)胞在其上面生長(zhǎng)的圓片結(jié)構(gòu)的高度/深度尺寸。 水平軸給出BSSA圓片上結(jié)構(gòu)的高度/深度(μ m)，垂直軸給出圓片上檢出的ES細(xì)胞總集落數(shù)。顯示了兩個(gè)細(xì)胞系CJ7和KH2—式三份的實(shí)驗(yàn)平均值。圖17圖示通過(guò)在以下任一個(gè)中連續(xù)傳代而生長(zhǎng)的CJ7和KH2ES細(xì)胞的微分干涉相差(DIC)圖像生物相容性鉭表面結(jié)構(gòu)F1.2、F4. 1，高度/深度為2.4μπι;包含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基；涂覆明膠的培養(yǎng)皿(僅CJ7細(xì)胞)；或非結(jié)構(gòu)化(NS)鉭(僅ΚΗ2細(xì)胞)。CJ7細(xì)胞在6次傳代期間擴(kuò)增，ΚΗ2細(xì)胞在10次傳代期間擴(kuò)增(圖示第7傳代)。對(duì)CJ7細(xì)胞的 0ct4(使用抗0ct4抗體)和Nanog(使用抗Nanog抗體)的表達(dá)以及對(duì)核(DAPI)進(jìn)行染色。對(duì)KH2細(xì)胞的0ct4表達(dá)和核(DAPI)進(jìn)行染色。10x。圖18圖示在移植術(shù)或種系傳遞中使用ES細(xì)胞的示意圖。從胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離出ES細(xì)胞。培養(yǎng)中這些細(xì)胞可以無(wú)限擴(kuò)增并且是多能的它們具有分化成全部三種胚層的各種細(xì)胞類(lèi)型的能力。因此對(duì)其在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用有著很高的期望。ES細(xì)胞的另一個(gè)重要用途是用于在胚泡期重新導(dǎo)入哺乳動(dòng)物胚胎(例如鼠胚胎)中。當(dāng)把含有ES細(xì)胞的胚泡植入假孕小鼠中時(shí)，多能ES細(xì)胞可在該小鼠的第一代子代的不同組織中發(fā)育。然后高品質(zhì)ES細(xì)胞有利于種系，因此可以產(chǎn)生完全由ES細(xì)胞傳遞而來(lái)的第二代小鼠。圖19表格表示在以下之一中連續(xù)傳代后CJ7細(xì)胞的種系潛力生物相容性表面結(jié)構(gòu)Fl. 2或F4. 1 ；涂覆明膠的平板；或包含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。圖20圖示基于在BSSA圓片上培養(yǎng)3天后的自動(dòng)測(cè)量值(3個(gè)值的平均值)的CJ7 和KH2ES細(xì)胞集落的分化指數(shù)(分化指數(shù)=DAPI總面積-ES細(xì)胞集落總面積)。A-J結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)按結(jié)構(gòu)尺寸X和Y排序。K結(jié)構(gòu)用按T值排序的獨(dú)立表格表示。由不同結(jié)構(gòu)高度 (0.6μπ 、1.6μπ^Π 2. 4μπ )得到的值均用不同的量表表示。
圖21圖示ES細(xì)胞集落數(shù)與分化指數(shù)。給出從圖14和圖20所示數(shù)據(jù)推導(dǎo)的一式三份CJ7和KH2ES細(xì)胞的平均值。不同的結(jié)構(gòu)高度(0.6μπι、1.6μπ^Π2.4μπι)用不同的色度表示。水平軸給出分化指數(shù)，垂直軸給出ES細(xì)胞集落數(shù)。圖22圖示包括在BSSA圓片中的形貌結(jié)構(gòu)的頂視示意圖，其中每個(gè)突出部分的中心(柱)位于例如帶有預(yù)定網(wǎng)格常數(shù)的六邊形、長(zhǎng)方形或正方形網(wǎng)格的二維網(wǎng)格的格點(diǎn)上。圖23圖示用于礦化分析的圓片設(shè)計(jì)A 系列A-J ；正方形和柱的不同重復(fù)。各系列含有結(jié)構(gòu)的水平尺寸⑴(Pm)及結(jié)構(gòu)之間的間隙(Υ)(μπι)的16種不同組合。系列K; “鯊魚(yú)皮”結(jié)構(gòu)水平尺寸的8種不同重復(fù)，各結(jié)構(gòu)間的間隙相同(iym)。B:左上圖圓片上系列A-K的位置。圓片中間的白色區(qū)是未結(jié)構(gòu)化的對(duì)照區(qū)。右上圖和中間兩張圖在A中所述的BSSA圓片結(jié)構(gòu)上的3種不同垂直高度尺寸(Z = 0. 6 μ m、 Z = 1.6μπι和Z = 2. 4μπι)上誘導(dǎo)礦化。下面兩張圖重復(fù)兩種不同高度(Ζ = 1.6μπι和Z = 2.4ym)的上述實(shí)驗(yàn)。注意各系列，結(jié)構(gòu)2和結(jié)構(gòu)3總是位于結(jié)構(gòu)15和16之上，且小面積的非結(jié)構(gòu)化對(duì)照表面將各個(gè)結(jié)構(gòu)分隔開(kāi)來(lái)。將MC3T3細(xì)胞接種在BSSA圓片上，誘導(dǎo)礦化達(dá)3周，隨后用茜素紅染色以檢測(cè)礦化(鈣)。C :Β中最后兩張圖選定區(qū)域的放大圖。上面三行(Z= 1.6 μ m)；選定區(qū)域包括覆蓋結(jié)構(gòu)2、3、15和16和分隔各個(gè)結(jié)構(gòu)(系列A-J)的未結(jié)構(gòu)化的對(duì)照表面(交叉)。第4行 (Z= 1.6 μ m);上面為1(1，1(2、1(3，1(4、1(5，1(6和1(7，1(8，下面為8554圓片邊緣的未結(jié)構(gòu)化表面。第5-8行(Ζ = 2. 4μπι)為與Z= 1. 6 μ m相同的區(qū)域。注意由系列A、C、E和I組成的上排(每個(gè)第2行的結(jié)構(gòu)特征都直接位于第1行的每個(gè)第二結(jié)構(gòu)的下方)；第2行由系列B、D、G和J組成(每個(gè)第2行的結(jié)構(gòu)特征向左移位0. 5X(間隙+特征尺寸)；第3行由系列F和H組成(每個(gè)結(jié)構(gòu)特征都直接位于彼此下方)。D 用兩片圓片(Z= 1.6 μ m和Z = 2.4 μ m)的實(shí)驗(yàn)定量測(cè)定的相對(duì)礦化度。合并系列A-J具有相同尺寸和間隙的全部結(jié)構(gòu)。合并系列K的所有尺寸(T = 1-8)。圖M圖示接種在BSSA圓片上的MC3T3細(xì)胞的增殖，所述圓片具有如圖23中定義的不同高度/深度的表面結(jié)構(gòu)突出部分左圖對(duì)于接種后所有時(shí)間點(diǎn)及圓片上的所有結(jié)構(gòu)，突出部分的高度/深度尺寸Z =1.6μπι(深色)和Z = 2.411111(淺色)表示細(xì)胞數(shù)(Ζ軸)。右圖對(duì)于Ζ = 2.4μπι(淺色)，接種后96小時(shí)的細(xì)胞數(shù)(Ζ軸)是尺寸(X軸)和間隙(Y軸)的函數(shù)。合并系列A-J具有相同X值和Y值的全部數(shù)據(jù)。兩張圖中的對(duì)照數(shù)據(jù)相當(dāng)于細(xì)胞生長(zhǎng)在具有平整表面的圓片的區(qū)域上。圖25圖示接種在垂直距離為Z = 2. 4 μ m的系列A、K或?qū)φ毡砻娼Y(jié)構(gòu)的BSSA圓片(如圖23中定義)上的MC3T3細(xì)胞的細(xì)胞大小、礦化及OPN和OC的表達(dá)。垂直圖第1列圖示通過(guò)肌動(dòng)蛋白和黏著斑蛋白重疊染色檢測(cè)的圓片上的細(xì)胞 (IOX)。垂直圖第2-5列圖示接種在BSSA圓片上后的MC3T3細(xì)胞；生長(zhǎng)兩周；隨后固定并進(jìn)行骨橋蛋白(0ΡΝ，綠色)、骨鈣蛋白(0C，紅色)和DAPI (藍(lán)色)染色。在0PN、0C和DAPI 染色的熒光顯微術(shù)檢測(cè)后，將圓片用茜素紅染色(垂直圖第2列)。水平圖第1-4行具有X =Iym且間隙⑴分別為1^111、211111、411111禾口611111的特征尺寸。水平圖第5-8行具有X=2 μ m且間隙(Y)分別為1 μ m、2 μ m、4 μ m禾口 6 μ m的特征尺寸。水平圖第9_12行具有X =4μπι且間隙⑴分另丨」為1口111、2口111、4口111禾口6口111的特征尺寸。水平圖第13-16行具有X =6μπι且間隙(Y)分別為1口111、2口111、4口111禾口6口111的特征尺寸。水平圖第17和18行分別具有鯊魚(yú)皮結(jié)構(gòu)Kl (Τ = 1 μ m)和非結(jié)構(gòu)化表面。圖2-5 所有圖像包括分隔不同結(jié)構(gòu)的 BSSA圓片的未結(jié)構(gòu)化部分(各圖的左1/5部分)。圖26圖示在BSSA圓片上誘導(dǎo)2周后MC3T3細(xì)胞的礦化、0ΡΝ, OC的表達(dá)和DAPI 染色，其中圓片具有表面結(jié)構(gòu)系列A-J、K和對(duì)照，其中結(jié)構(gòu)高度尺寸為Z = 2. 4 μ m(如圖23 中定義)。圖像是包含結(jié)構(gòu)間相交區(qū)域的放大圖(系列A-J的2、3、15和16)和(K 1-8的 1-8和對(duì)照區(qū))。熒光顯微圖像表示接種在BSSA圓片上的MC3T3細(xì)胞；生長(zhǎng)兩周；隨后固定及對(duì)0ΡΝ(綠色)、OC(紅色)和DAPI (藍(lán)色)染色，隨后用茜草紅(Alizianred)染色。水平行1-10:其中(X，Y) = 1，2、1，4、6，4和6，6的結(jié)構(gòu)的圖像，具有從系列A(頂端行)開(kāi)始至J(底端行)的各結(jié)構(gòu)相交的未結(jié)構(gòu)化表面。水平行11-14:從BSSA圓片邊緣的未結(jié)構(gòu)化表面上方的Κ1，Κ2開(kāi)始到未結(jié)構(gòu)化表面(末行)上方的Κ7，Κ8結(jié)束的K結(jié)構(gòu)以及未結(jié)構(gòu)化表面的圖像。DAPI信道第9行的黑色區(qū)是由于顯微鏡的自動(dòng)照片采集程序在改變?yōu)V光鏡時(shí)出現(xiàn)機(jī)械故障所致。圖27圖示附著在BSSA圓片(如圖23中定義)上的MC3T3細(xì)胞的面積。在附著后一天定量MC3T3細(xì)胞的平均細(xì)胞面積，定量方法是用被肌動(dòng)蛋白/黏著斑蛋白重疊覆蓋的面積除以細(xì)胞數(shù)(DAPI染色)。合并系列A-J結(jié)構(gòu)之間具有相同尺寸⑴和間隙⑴的所有結(jié)構(gòu)。實(shí)心柱和交叉影線柱兩次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。圖28圖示在具有垂直距離Z = 2. 4μ m的系列A表面結(jié)構(gòu)的BSSA圓片(如圖23 中定義)上誘導(dǎo)3周后MC3T3細(xì)胞的礦化、0ΡΝ, OC的表達(dá)和DAPI染色。熒光顯微圖像顯示接種在BSSA圓片上后；生長(zhǎng)3周；然后固定和進(jìn)行骨橋蛋白 (0ΡΝ，綠色)、骨鈣蛋白(0C，紅色)和DAPI (藍(lán)色)染色；隨后用茜素紅染色(垂直圖第1 列)的MC3T3。水平圖第1-4行具有X = 1 μ m和間隙⑴分別為1μπι、2μπι、4μπ^Π6μπι 的特征尺寸。水平圖第5-8行具有X = 2μπ 禾口間隙(Y)分別為1μπ 、2μπ 、4μπ^Π6μπ 的特征尺寸。水平圖第9-12行具有X = 4 μ m和間隙(Y)分別為1 μ m、2 μ m、4 μ m禾口 6 μ m 的特征尺寸。水平圖第13-16行具有X = 6μπι和間隙⑴分另1」為1口111、2口111、4口111禾口6口111 的特征尺寸。圖四圖示用于綿羊成骨試驗(yàn)中的樣品架。圖30顯示具有高度/深度為2. 4μ m的特征的生物相容性表面F(l，4)上人胚胎干細(xì)胞(hESC)集落隨時(shí)間的生長(zhǎng)。使細(xì)胞在第0天傳代，每天拍照達(dá)5天。圖30a圖示表面上所有集落的概觀(0. 8x)。圖30b圖示一個(gè)選定的hESC集落的形態(tài)改變時(shí)程(8x)。圖31圖示具有高度/深度為2.4μπι的特征的表面F(l，2)上人胚胎干細(xì)胞集落隨時(shí)間的生長(zhǎng)。使細(xì)胞在第0天傳代，每天拍照達(dá)5天。圖31a圖示表面上所有集落的概觀(0. 8x)。圖31b圖示一個(gè)選定的hESC集落的形態(tài)改變時(shí)程(8x)。圖32圖示生長(zhǎng)在納米表面上的人胚胎干細(xì)胞集落與生長(zhǎng)在GeltrexTM基質(zhì) (Invitrogen)上的相同細(xì)胞的比較，GeltrexTM基質(zhì)是還原生長(zhǎng)因子(reduced growth factor, RGF)基底膜提取物的可溶形式。圖33圖示生長(zhǎng)在具有高度/深度為2. 4 μ m的特征的表面F(l，4)上的細(xì)胞的免疫熒光、DAPI和相位圖像。圖34圖示生長(zhǎng)在具有高度/深度為2. 4 μ m的特征的表面F(l，2)上的細(xì)胞的免疫熒光、DAPI和相位圖像。發(fā)明詳述本發(fā)明的第一方面這個(gè)方面涉及使大量多能哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞以未分化狀態(tài)生長(zhǎng)隨后誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化成所需要的細(xì)胞類(lèi)型的需要。一旦分化成某一特定的細(xì)胞類(lèi)型，這些特定的細(xì)胞類(lèi)型便可用于許多不同的應(yīng)用，例如藥物篩選、細(xì)胞替代療法、糖尿病、軟骨損傷等。本發(fā)明基于這樣的認(rèn)識(shí)，即方向性生長(zhǎng)和/或分化的細(xì)胞功能受細(xì)胞微環(huán)境的強(qiáng)烈影響。因此，一般認(rèn)為未分化胚胎干細(xì)胞的生長(zhǎng)及其隨后的分化可取決于細(xì)胞可附著的合適結(jié)構(gòu)的提供。具體地講，本發(fā)明認(rèn)識(shí)到，細(xì)胞微環(huán)境表面的二維和三維結(jié)構(gòu)或形貌是上述過(guò)程的決定性因素。有無(wú)數(shù)不同的可能的微環(huán)境。因此，一方面，本發(fā)明涉及提供其表面形貌產(chǎn)生促進(jìn)多能哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞以未分化狀態(tài)生長(zhǎng)的特定微環(huán)境的生物相容性材料。本發(fā)明的第二個(gè)方面提供其表面形貌促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和/或分化的生物相容性材料。由于蛋白質(zhì)和細(xì)胞的尺寸由納米到微米不等，因此這些是提供與生物相容性材料的問(wèn)題有關(guān)的長(zhǎng)度尺度。I.測(cè)試和選擇適于ES細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)分化的生物相容性材料的方法。采用提供不同候選形貌結(jié)構(gòu)的篩選工具/測(cè)定法可以篩選具有不同表面形貌的材料來(lái)鑒定本發(fā)明的生物相容性材料或結(jié)構(gòu)。適于篩選形貌結(jié)構(gòu)的篩選工具的實(shí)例包括所謂的BioSurface Structure Array (BSSA)圓片。圖1圖示這類(lèi)BioSurface Structure Array圓片的實(shí)例的頂視圖。 BSSA圓片1包含60個(gè)測(cè)試區(qū)。多個(gè)測(cè)試區(qū)2留作“空白”，即它們不被加工以具有結(jié)構(gòu)化表面。因此，測(cè)試區(qū)2的表面基本上是平整的。因此在用BSS篩選工具的每個(gè)平行篩選試驗(yàn)中都固定包括了對(duì)照實(shí)驗(yàn)。規(guī)定為Si，S2. . .，S54的其余測(cè)試區(qū)包含如本文所述的各個(gè)結(jié)構(gòu)化表面。測(cè)試區(qū)為正方形，尺寸IOmm χ 10mm。用作鑒定誘導(dǎo)/提高細(xì)胞功能(例如生長(zhǎng)和分化)的結(jié)構(gòu)的篩選工具的圓片可通過(guò)多種生產(chǎn)技術(shù)制備。其制備方法的實(shí)例包括一種或多種本領(lǐng)域已知的下列技術(shù)·光刻方法光刻法是一種將幾何形狀/圖案形式從光掩模轉(zhuǎn)印至需要結(jié)構(gòu)化的表面(例如圓片表面)上的已知方法。已知具有約1微米至IOOnm以下的最小橫向特征尺寸的光刻設(shè)備。光刻法參見(jiàn)例如S. M. Semiconductor Devices, Physics and Technology，第■^片反，John Wiley & Sons 2002，第 12 章Lithography and Etching;以及載于 Plummer, Deal, Griffin :Silicon VLSI Technology, Fundamentals, Practice, and Modeling, Prentice Hall 2000,第 5 章Lithography?！る娮邮g刻法基本上，可采用電子束蝕刻法以與光用于光刻法中完全一樣的方式來(lái)暴露光致抗蝕劑。電子束蝕刻法具有高達(dá)約5nm的特別高的分辨率。·熱壓印熱壓印使用主印模將微米和納米級(jí)結(jié)構(gòu)壓印在聚合物基底上。該方法使用各種聚合物材料可供主印模產(chǎn)生許多完全圖案化的基底。熱壓印提供低成本、多用途的制備方法，非常適于從研究與開(kāi)發(fā)應(yīng)用到大量生產(chǎn)用途的BSSA的制備?？色@得高長(zhǎng)寬比與極高均勻度的大型圓片(例如8英寸或12英寸圓片)上的微米和納米級(jí)結(jié)構(gòu)。20nm以下的特征尺寸是可能的?？梢酝ㄟ^(guò)例如電子束蝕刻技術(shù)來(lái)制備主印模。 可能涉及生產(chǎn)生物相容性材料或結(jié)構(gòu)的生產(chǎn)步驟或工藝的其它實(shí)例包括納米壓印蝕刻法、激光消融、化學(xué)浸蝕、等離子噴涂、磨料噴射、雕刻、刮擦、微細(xì)加工等。圖2圖示圖1圓片的剖視圖。圖加圖示標(biāo)為A-B直線的完整圓片寬度的橫截面。 圖2b圖示一個(gè)測(cè)試區(qū)一部分表面的放大圖。圓片1具有包括圖案化襯底層21 (例如硅層) 和表面層23的多層結(jié)構(gòu)。圓片的表面是圖案化的(例如通過(guò)光刻法)，以在各個(gè)測(cè)試區(qū)Si， S2，...，SM表面上提供不同的圖案。結(jié)構(gòu)具有深度/高度H。在光刻法中，高度H是可通過(guò)蝕刻過(guò)程控制的。圖案化表面被一層薄的二氧化硅層22和/或以下不同生物相容性材料的表面層23覆蓋例如鉭或任何其它金屬、金屬氧化物、金屬氮化物、金屬碳化物、金剛石、 類(lèi)金剛石碳、半導(dǎo)體、半導(dǎo)體氧化物/氮化物、絕緣體、聚合物、共聚物。測(cè)試區(qū)之間有無(wú)結(jié)構(gòu)的“空白”邊區(qū)，即邊區(qū)未被加工成具有結(jié)構(gòu)化表面。在這種情況下，空白邊區(qū)寬為0. 3mm。 空白邊有助于結(jié)構(gòu)的直觀排列和鑒定?？瞻走呥€用作緊鄰各測(cè)試正方形的小的對(duì)照表面。注意圖2是示意圖，并未按比例繪制。尤其是垂直尺寸可放大以提高可讀性。II.本發(fā)明的生物相容性材料的化學(xué)組成生物相容性材料或結(jié)構(gòu)的實(shí)施方案可為各種形式，例如-醫(yī)學(xué)植入物或用于制備醫(yī)學(xué)植入物的生物相容性涂層材料，-具有暴露于細(xì)胞培養(yǎng)物的表面的組織培養(yǎng)皿/培養(yǎng)瓶，其中暴露表面具有支持所需細(xì)胞功能(例如未分化或分化狀態(tài)的胚胎干細(xì)胞的生長(zhǎng))的結(jié)構(gòu)，-組織培養(yǎng)物表面或例如改進(jìn)以在表面上呈現(xiàn)這些結(jié)構(gòu)或這些結(jié)構(gòu)藍(lán)圖 (blueprint)的組織培養(yǎng)塑料制品。在這方面，組織培養(yǎng)塑料制品是指可用于制備體外細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)表面的任何聚合物。生物相容性材料或結(jié)構(gòu)的實(shí)施方案可包含襯底層和任選表面層。用于制備生物相容性材料或結(jié)構(gòu)的合適原材料包括任何半導(dǎo)體(摻雜或未摻雜)、單一金屬、金屬氧化物、金屬氮化物、合金、陶瓷、聚合物、共聚物、復(fù)合材料、遞藥系統(tǒng)、 具有生物活性分子的聚合物、其它生物活性化合物或其任何組合。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，表面層包含對(duì)于ES細(xì)胞體外和/或植入患者后的生長(zhǎng)有足夠生物相容性的材料。表面層的實(shí)例包括金屬表面沉積物，例如鉭、鈦、Ti-Al-V合金、 金、鉻、金屬氧化物、半導(dǎo)體氧化物、金屬氮化物、半導(dǎo)體氮化物、聚合物、生物聚合物或其它合金。植入物的優(yōu)選的表面組成成分包括鉭、鈦、鉬或其氧化物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，至少部分表面層包含選自以下的聚合物聚苯乙烯、 聚己酸內(nèi)酯聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、脫乙酰殼多糖或其組合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞或組織培養(yǎng)容器通過(guò)例如納米晶金剛石、等離子體聚合、氧等離子體或氮等離子體進(jìn)行化學(xué)官能化。在一些實(shí)施方案中，生物相容性材料或結(jié)構(gòu)包含其它組分，例如一種或多種可沉積或吸附在所述材料或結(jié)構(gòu)的暴露表面或表面層上的生物活性化合物。例如所述化合物可選自抗體、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、多糖、脂質(zhì)、生長(zhǎng)激素、有機(jī)化合物和無(wú)機(jī)化合物。優(yōu)選選自以下的一種或多種生長(zhǎng)激素吸附于容器的表面層或與容器的表面層化學(xué)連接、固定化或絡(luò)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白[BMP]、表皮生長(zhǎng)因子[EGF]、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β [TGF- β ]、胰島素樣生長(zhǎng)因子IGF和白血病抑制因子[LIF]。
III.本發(fā)明的生物相容性材料的結(jié)構(gòu)性質(zhì)生物相容性材料或結(jié)構(gòu)的全部或部分表面(其可為上述的各種形式)包含在由該材料或結(jié)構(gòu)的表面界定的平面內(nèi)一維或多維的微米級(jí)特征。本文使用的術(shù)語(yǔ)微米級(jí)和微米大小是指在約Iym和約1000 μ m范圍內(nèi)的長(zhǎng)度尺度。本文使用的術(shù)語(yǔ)納米級(jí)是指在約Inm 和約lOOOnm、特別是在約Inm和約IOOnm范圍內(nèi)的長(zhǎng)度尺度。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述特征是結(jié)構(gòu)/形貌特征，例如由生物相容性材料的表面延伸出來(lái)的突出物。微米級(jí)特征可在至少一個(gè)橫向方向上具有水平尺寸，其中所述尺寸選自以下一種間距介于約Ιμπι和約20 μ m之間、介于約1-10 μ m之間、介于約10-20 μ m之間、介于約 1 μ m-2 μ m之間、介于約2 μ m_4 μ m之間、介于約4 μ m_6 μ m之間、介于約6 μ m_8 μ m之間、 介于約8μπι-10μπι之間、介于約10-12 μ m之間、介于約12-14 μ m之間、介于約14-16 μ m 之間、介于約16-18μπι之間、介于約18-20μπι之間。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選至少一個(gè)水平尺寸介于0. 1μπι-4μπι之間。因此，從某一特征的橫截面區(qū)域內(nèi)的任一指定點(diǎn)到該橫截面區(qū)域邊緣的最短距離等于或小于4 μ m。水平尺寸在與表面基本平行或至少與表面基本正切的方向上測(cè)量。任何微米級(jí)特征與其最近鄰之間的最大距離或間隙可在至少一個(gè)橫向方向上具有水平尺寸，其中所述尺寸選自以下的間距之一介于約0.5口!11-1口111之間、介于約 1μ -2μπ 之間、介于約2μ -4μπ 之間、介于約4μ -6μπ 之間、介于約6μ -8μπ 之間、介于約8μ -10μπ 之間、介于約10μ -12μπ 之間、介于約12 μ m_14 μ m之間、介于約14μπι-16μπι之間。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，優(yōu)選水平尺寸介于0.5 μ m-8 μ m之間。生物相容性材料表面上微米級(jí)特征的分布優(yōu)選是沿一個(gè)或多個(gè)橫向方向呈周期性，可通過(guò)具有選自以下一種間隔的橫向間距尺寸的周期函數(shù)來(lái)描述介于約1 μ m-2 μ m之間、介于約 2口111-4口111之間、介于約4口111-6口111之間、介于約6口111-胸111之間、介于約10μπι-16μπι之間、介于約16μπι-20μπι之間、介于約20μπι-Μμπι之間。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，間距尺寸小于8. 0 μ m，更優(yōu)選介于0. 5 μ m-6. 0 μ m之間。微米級(jí)特征的周期函數(shù)可具有沿一個(gè)方向較小的周期或具有在不同方向上的例如2、3、10或以上的因素的較大周期。生物相容性材料的表面上的任意一個(gè)微米級(jí)特征可定義為周期性的周期結(jié)構(gòu)。因此，周期結(jié)構(gòu)某一特征的水平尺寸可定義為周期形狀/函數(shù)的周期，即所述結(jié)構(gòu)沿其重復(fù)其形狀的最短間距的長(zhǎng)度。微米級(jí)特征的深度/高度，即其在從生物相容性材料的表面突出出來(lái)的方向上的線性尺寸可為納米或微米大小，即結(jié)構(gòu)可具有Inm-IO μ m或選自以下間距范圍的高度/深度介于約0. 07μπι-0. 6μπι之間、介于0. 6μπι-1. 6μπι之間、介于約1. 6_3. Ομπι之間、介于約3μπ -10μπ 之間。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)構(gòu)(例如突出物)具有為以下的垂直高度/深度尺寸等于或大于1. 6 μ m、等于或大于3. 0 μ m、優(yōu)選介于2. 0 μ m-3. 0 μ m 之間或約2.4 μ m。這個(gè)實(shí)施方案特別適于促進(jìn)多能干細(xì)胞的無(wú)分化生長(zhǎng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所有特征(突出物)的垂直高度/深度尺寸都等于或小于ι. ο μ m、優(yōu)選介于 0. 6 μ m-1. 0 μ m之間、更優(yōu)選約0. 6 μ m。這個(gè)實(shí)施方案特別適于促進(jìn)干細(xì)胞的分化。任意一種微米大小特征的橫向橫截面優(yōu)選為幾何形狀的，例如正方形、長(zhǎng)方形、六邊形、多邊形或星形。特征的頂面和/或側(cè)面優(yōu)選基本上是平整的。然而，微米大小特征的表面還可包括納米級(jí)特征以在微米和納米兩種尺度上獲得形貌協(xié)同效應(yīng)。這可以通過(guò)例如下列方法獲得化學(xué)浸蝕(例如通過(guò)NaOH或檸檬酸)、離子蝕刻、膠體蝕刻(例如通過(guò)聚苯乙烯珠、巴克球(bucky ball)或蛋白質(zhì))、掠入射物理氣相沉積涂層、CVD涂層或等離子噴涂。生物相容性材料的表面上的特征可具有相同或不同的形狀。優(yōu)選生物相容性材料的表面上的特征為幾何形狀(例如正方形、長(zhǎng)方形、六邊形、星形或多邊形)。一般來(lái)說(shuō)，二維周期結(jié)構(gòu)的定義可包括格子單位(unit cell)和位于格子單位中的重復(fù)單元，所述格子單位在所述表面的平面上具有預(yù)定形狀(例如正方形、長(zhǎng)方形、六邊形等)；所述重復(fù)單元定義在格子單位中的詳細(xì)結(jié)構(gòu)(基礎(chǔ))，例如孔或突出物，例如正方形柱、多邊形柱、環(huán)形柱等。格子單位限定的位置定義了重復(fù)單元距離，而重復(fù)單元界定預(yù)定的形狀和尺寸。這些格子單位位置可由相應(yīng)的二維向量界定。因此，網(wǎng)格結(jié)構(gòu)由格子單位沿表面界定的二維方向平移而形成，特別是相應(yīng)的多個(gè)格子單位尺寸。在一個(gè)實(shí)施方案中， 每個(gè)特征的中間位置可定義為向量ν = nlVl+n2V2，其中V1和V2在表面上是線性獨(dú)立向量， H1和n2都為整數(shù)。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)特征的中心位于二維網(wǎng)格(例如具有預(yù)定網(wǎng)格常數(shù)的六邊形、長(zhǎng)方形或正方形網(wǎng)格)的格點(diǎn)上(圖8A、圖8B)。在一些實(shí)施方案中，全部特征覆蓋這類(lèi)網(wǎng)格的全部格點(diǎn)，而在其它實(shí)施方案中，不是網(wǎng)格上的全部格點(diǎn)都被特征覆蓋。例如，在一些實(shí)施方案中，在每隔一行的格點(diǎn)中，每隔一個(gè)格點(diǎn)可被特征覆蓋。在其它實(shí)施方案中，在每第二、第三、第四或更高次行中，每第二、 第三、第四或更高次的格點(diǎn)留為空白。在一些實(shí)施方案中，形貌結(jié)構(gòu)可包括大量不同的特征，例如規(guī)則排列/圖案的多種不同的特征，例如周期性排列，例如交替呈行的2個(gè)、3個(gè)或更多個(gè)不同特征。這類(lèi)圖案的實(shí)例包括包含以交替行排列的具有正方形橫截面的特征和具有圓形橫截面的特征的結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，特征排成行和/或排。在一些實(shí)施方案中，每行中的特征具有相同的間距，而在其它實(shí)施方案中，間距可在整個(gè)行中有所不同和/或在行與行間有所不同。同樣，行與行間的距離可以是所有行均相同，或者行與行間有所不同。在一些實(shí)施方案中，某一行中的一些或所有結(jié)構(gòu)可相對(duì)于同一行中相應(yīng)的近鄰結(jié)構(gòu)旋轉(zhuǎn)。在一些實(shí)施方案中，某一行中的一些或所有結(jié)構(gòu)可相對(duì)于其相鄰行中相應(yīng)的近鄰結(jié)構(gòu)旋轉(zhuǎn)。在一些實(shí)施方案中，在所有橫向方向上的特征的水平尺寸都介于Iym和約10 μ m 之間。這類(lèi)特征的實(shí)例包括具有大致為正方形或圓形橫截面的突出物。在其它實(shí)施方案中， 一個(gè)方向的特征的水平尺寸介于Iym和約IOym之間，而另一個(gè)方向的水平尺寸較大。生物相容性材料的實(shí)例是具有微結(jié)構(gòu)的生物相容性材料，所述微結(jié)構(gòu)具有以下形貌特征的表面正方形柱的二維周期結(jié)構(gòu)，尺寸為2μπι χ 2 μ m，間距為6 μ m(圖6)。圖8A-K圖示形貌結(jié)構(gòu)實(shí)例的頂視圖，形貌結(jié)構(gòu)具有大致呈圓形、正方形或長(zhǎng)方形橫截面的突出物/柱的形式的特征。每個(gè)特征在至少一個(gè)方向上具有水平徑X，相鄰行和列中特征之間的間隙距離表示為Y。在圖8A、C、E、F和I中，Y等于任何特征與其最鄰近特征之間的間隙尺寸，相當(dāng)于間距X+Y。在圖8B、D、G、H和J中，與最鄰近特征的間隙距離對(duì)于不同特征是不同的，以圖8B的特征1201、1202和1203為例說(shuō)明。特征1201以特征1202 為其最近鄰；因此間隙尺寸為Y。然而，特征1203以特征1201和1202為其最近鄰特征，具有稍稍不同的間隙尺寸d。因此，在圖8B、D、G、H和J中，行與行之間的間距不同。在包括特征1201的行中，間距為X+Y，而在包括特征1203的行中的間距為2(X+Y)。雖然其它高度是可行的，但用于以下實(shí)例中的結(jié)構(gòu)具有0. 6 μ m、1. 6 μ m或2. 4 μ m之一的特征高度。在圖8的實(shí)例中，每個(gè)特征的中心位于網(wǎng)格常數(shù)為a和b的二維長(zhǎng)方形網(wǎng)格相應(yīng)的格點(diǎn)上，見(jiàn)圖8A和B。然而，在圖8A-E、H-I中，不是所有格點(diǎn)實(shí)際上都被特征覆蓋，而在圖8F和K中，所有格點(diǎn)都被特征覆蓋。在圖8A、C、E、F和I中，網(wǎng)格是網(wǎng)格常數(shù)為a = b =(X+Y)的正方形網(wǎng)格。在圖8B、D、G、H和J中，網(wǎng)格為長(zhǎng)方形，網(wǎng)格常數(shù)為a = X+Y，b = (X+Y)/2。在圖81(中，網(wǎng)格常數(shù)為3 = 2乂^ = 3.5乂。對(duì)于選定的X值和Y值，按照?qǐng)D8A-H 制備了圓片，其中(X，Y) (μπι)選自(X，Y) = (1，1)、(1,2), (1,4), (1,6), (2，1)、(2,2), (2，4)、(2，6)、(4，1)、(4，2)、(4，4)、(4，6)、(6，1)、(6，2)、(6，4)、(6，6)。對(duì)于選定的 X 值和Y值，按照?qǐng)D8Κ制備了圓片，其中Χ(μπι)選自X= 1、2、3、4、5、6、7、8。因此，對(duì)于圖8Α、 C、E、F和I的正方形網(wǎng)格，網(wǎng)格上的網(wǎng)格常數(shù)a和b為a = b = 2-12 μ m。對(duì)于圖8B、D、G、 H和J的長(zhǎng)方形網(wǎng)格，方向a的網(wǎng)格常數(shù)的間距介于2-12μπι之間，方向b的網(wǎng)格常數(shù)的間距介于1-6 μ m之間。對(duì)于圖8K的網(wǎng)格，網(wǎng)格常數(shù)b保持間距在3. 5-28 μ m之間，網(wǎng)格常數(shù) a保持間距在2-16 μ m之間。為了鑒定上述結(jié)構(gòu)X和Y各自不同的值，將本說(shuō)明書(shū)圖8A所示結(jié)構(gòu)稱(chēng)為AX. Y，其中X和Y是指上述X和Y的尺寸。因此，結(jié)構(gòu)AX. Y包括具有直徑為X μ m的圓形橫截面的突出物/柱。突出物平行排列，其中每隔一行的相鄰?fù)怀鑫镩g的間隙尺寸為Y μπι，而其余行中突出物間的間隙尺寸為OY+X)ym。相鄰行突出物之間的間隙尺寸為Y μ m0相鄰行中的突出物彼此排成一線。同樣，圖8Β中所示結(jié)構(gòu)稱(chēng)為BX. Y。因此，結(jié)構(gòu)BX. Y包括具有直徑為X ym的圓形橫截面的突出物/柱。突出物平行排列，其中每隔一行的相鄰?fù)怀鑫镩g的間隙尺寸為 Y μ m，而其余行中突出物間的間隙尺寸為(2Y+X) μπι。相鄰行突出物之間的間隙尺寸為Y μπι。間隙尺寸為ΟΥ+Χ) μ m的行中的突出物與其相鄰行的突出物之間的間隙中心排成一線。圖8C所示結(jié)構(gòu)稱(chēng)為CX. Y。因此，結(jié)構(gòu)CX. Y包括具有線性尺寸為X μ m的正方形橫截面的突出物/柱。突出物平行排列，其中正方形的各邊與行/列的方向一致，且其中每隔一行的相鄰?fù)怀鑫镩g的間隙尺寸為Y μπι，而其余行中突出物間的間隙尺寸為(2Υ+Χ) μπι。相鄰行突出物之間的間隙尺寸為Y μm0相鄰行中的突出物彼此排成一線。圖8D所示結(jié)構(gòu)稱(chēng)為DX. Y。因此，結(jié)構(gòu)DX. Y包括具有線性尺寸為X μ m的正方形橫截面的突出物/柱。突出物平行排列，其中正方形的各邊與行/列的方向一致，且其中每隔一行的相鄰?fù)怀鑫镩g的間隙尺寸為Y ym，而其余行中突出物間的間隙尺寸為(2Y+X) μπι。相鄰行突出物之間的間隙尺寸為Y μ Hi0間隙尺寸為(2Υ+Χ) μπι的行中的突出物與其相應(yīng)的相鄰行突出物間的間隙中心排成一線。圖8Ε所示結(jié)構(gòu)稱(chēng)為EX. Y。因此，結(jié)構(gòu)EX. Y包括具有直徑為X μ m的圓形橫截面的突出物/柱以及具有線性尺寸為X μm的正方形橫截面的突出物/柱。突出物交替地平行排列，每隔一行為圓形突出物，正方形突出物位于其余行中。圓形突出物行中相鄰?fù)怀鑫镩g的間隙尺寸為Yym，而其余行中的正方形突出物間的間隙尺寸為(2Υ+Χ)μπι。相鄰行突出物之間的間隙尺寸為Y ym。相鄰行中的突出物彼此排成一線。所示結(jié)構(gòu)圖8F稱(chēng)為FX. Y。因此，結(jié)構(gòu)FX. Y包括具有直徑為X μ m的圓形橫截面的突出物/柱以及具有線性尺寸為Χμ m的正方形橫截面的突出物/柱。突出物交替地平行排列，每隔一行為圓形突出物，正方形突出物位于其余行中。各行內(nèi)突出物之間的間隙尺寸和相鄰行間的間隙尺寸為γ μ m0相鄰行中的突出物彼此排成一線。圖8G所示結(jié)構(gòu)稱(chēng)為GX. Y。因此，結(jié)構(gòu)GX. Y包括具有直徑為X μ m的圓形橫截面的突出物/柱以及具有線性尺寸為X μm的正方形橫截面的突出物/柱。突出物交替平行排列，每隔一行為圓形突出物，其余行為正方形突出物。圓形突出物行中相鄰?fù)怀鑫镩g的間隙尺寸為Υμπι，而其余行中的正方形突出物間的間隙尺寸為(2Υ+Χ)μπι。相鄰行突出物之間的間隙尺寸為Y U m0間隙尺寸為(2Υ+Χ) μ m的正方形行中的突出物與其相應(yīng)的相鄰行中的圓形突出物間之間的間隙中心排成一線。圖8H所示結(jié)構(gòu)稱(chēng)為HX. Y。因此，結(jié)構(gòu)HX. Y包括具有直徑為Χμ m的圓形橫截面的突出物/柱以及具有線性尺寸為X μm的正方形橫截面的突出物/柱。突出物交替平行排列，每隔一行為圓形突出物，正方形突出物位于其余行中。各行內(nèi)突出物之間的間隙尺寸和相鄰行間的間隙尺寸為Yym。相鄰行中的突出物彼此排成一線。正方形突出物與其相應(yīng)的相鄰行的圓形突出物之間的間隙中心排成一線。圖81所示結(jié)構(gòu)稱(chēng)為IX. Y。因此，結(jié)構(gòu)IX. Y包括具有直徑為X μ m的圓形橫截面的突出物/柱以及具有線性尺寸為X μm的正方形橫截面的突出物/柱。突出物交替平行排列，每隔一行為圓形突出物，正方形突出物位于其余行中。正方形突出物行中相鄰?fù)怀鑫镏g的間隙尺寸為Yym，而其余行中的圓形突出物之間的間隙尺寸為(2Υ+Χ)μπι。相鄰行突出物之間的間隙尺寸為Y μ m。相鄰行中的突出物彼此排成一線。圖8J所示結(jié)構(gòu)稱(chēng)為JX. Y。因此，結(jié)構(gòu)JX. Y包括具有直徑為X μ m的圓形橫截面的突出物/柱以及具有線性尺寸為X μm的正方形橫截面的突出物/柱。突出物交替平行排列，每隔一行為圓形突出物，正方形突出物位于其余行中。正方形突出物行中相鄰?fù)怀鑫镏g的間隙尺寸為Y ym，而其余行中的圓形突出物之間的間隙尺寸為(2Y+X) μπι。相鄰行突出物之間的間隙尺寸為Yum。間隙尺寸為ΟΥ+Χ) μ m的行中的圓形突出物與其相應(yīng)的相鄰行的正方形突出物之間的間隙中心排成一線。因此，在上述實(shí)例中，最近鄰特征之間的最小間隙尺寸為Y ym，最近鄰特征之間最小中心-中心之間的距離為Χ+Υμ m。圖8K所示結(jié)構(gòu)稱(chēng)為KX。結(jié)構(gòu)KX包含多組長(zhǎng)方形橫截面的長(zhǎng)形突出物(脊)。脊具有不同的長(zhǎng)度，并彼此平行排列。每組的脊排列形成長(zhǎng)方形形狀，使得每組都包括最長(zhǎng)脊作為中脊。中脊的每側(cè)排列了隨距中脊的距離增加而逐漸變得更短的一系列脊。因此長(zhǎng)方形形狀KX包括一連串的長(zhǎng)度為X μπι、2Χμπι、3Χμπι、4Χ μ 、3Χ μ m、2X μ m、X μ m的脊。脊寬為X μ m0脊之間的距離為Xym。脊組以預(yù)定方式排列，使得脊沿行放置，其中每行包括兩個(gè)長(zhǎng)度交替的脊行的第一種類(lèi)型包括長(zhǎng)度為Χμ m和4Χμ m的交替脊。行的第二種類(lèi)型包括長(zhǎng)度為2Χμπι和3X ym的交替脊。脊的整體圖案類(lèi)似于鯊魚(yú)皮結(jié)構(gòu)。下面將結(jié)合實(shí)例描述其它優(yōu)選的結(jié)構(gòu)。IV.在成形的3D表面上合成本發(fā)明的生物相容性形貌改進(jìn)表面的方法?？赏ㄟ^(guò)多種生產(chǎn)技術(shù)制備對(duì)ES細(xì)胞有生物相容性的容器的表面，例如一種或多種下列技術(shù)-印模壓印(Dieimprinting)通過(guò)使用硬質(zhì)模(例如SiC或SiN模)可在其它硬質(zhì)材料上直接產(chǎn)生圖案，像通過(guò)壓印的植入金屬。作為原版的印模，通常通過(guò)結(jié)合電子束蝕刻法和反應(yīng)性離子蝕刻法來(lái)制備。已經(jīng)證明，可將寬低至40nm的大批納米結(jié)構(gòu)印制在像鋁一樣的軟金屬上(S. W. Pang, Τ. Tamamura, Μ. Nakao, Α. Ozawa, H. Masuda, J. Vac. Sci. Technology B 16 (3) (1998) 1145)。更準(zhǔn)確地講，當(dāng)在像Al、Ti、鈦合金、不銹鋼、Ta等一樣的其它硬質(zhì)基底上壓印時(shí)，需要在像SiC或SiN —樣非常硬的材料上制成印模圖案，否則印模將受損，甚至遭破壞。印模壓印當(dāng)然還可用于像聚合物一樣較軟的材料。因?yàn)橄馭iC 或SiN 一樣的材料難以干蝕刻，因此需要制備包含例如Cr而不僅僅是光致抗蝕劑的蝕刻掩模。掩模可按以下方式制備在耐蝕膜上經(jīng)電子束蝕刻然后顯影(通常在乙酸鹽等有機(jī)溶劑中)來(lái)產(chǎn)生橫向圖案。這使得耐蝕膜圖案留在表面上。耐蝕膜圖案用約IOOnm Cr層的 PVD沉積物覆蓋，并使用標(biāo)準(zhǔn)耐蝕膜脫膜劑溶解耐蝕膜而最終揭開(kāi)。硬質(zhì)印模材料的干蝕刻可以在反應(yīng)性離子蝕刻系統(tǒng)中進(jìn)行。結(jié)構(gòu)的厚度受離子蝕刻時(shí)間控制。Cr掩模最終可在硝酸鈰水溶液中去除。此時(shí)硬質(zhì)印模已準(zhǔn)備好在合成生物相容性形貌改進(jìn)表面的表面上壓印。印模可通過(guò)液壓壓制在表面的選定區(qū)域上，從而將微米圖案和納米圖案印在生物材料的選定區(qū)域上。施加的壓力通?？蔀閹坠珖嵆掷m(xù)10-30秒鐘?？赏ㄟ^(guò)使印模大小的區(qū)域連續(xù)圖案化來(lái)使若干區(qū)域圖案化。印模大小通常為10x10mm2直到40x40mm2。這種微米印刷和納米印刷方法非常適于在例如Ti、鈦合金、鉭或不銹鋼產(chǎn)生的成形3D植入物上的選定區(qū)域圖案化。當(dāng)然它還可用于不太硬的材料，如聚合材料/涂料。-通過(guò)滾動(dòng)印模壓印。該方法基本上與印模壓印相同，然而，這里的印模不是扁平的而通常是一個(gè)圓筒。這種印模滾筒是通過(guò)上述印模壓印中所述的光刻法或電子束蝕刻法 /反應(yīng)性離子蝕刻法進(jìn)行微米結(jié)構(gòu)化和納米結(jié)構(gòu)化的?？紤]弧形表面，需要修改設(shè)置。此時(shí)可將滾筒印模通過(guò)液壓壓制在植入物的表面，而將印模滾筒壓在生物材料的選定區(qū)域并在上面滾動(dòng)，從而壓印出微米和/或納米結(jié)構(gòu)。植入物材料在此同樣像Ti、Ti-合金、鉭或不銹鋼一樣可以是硬質(zhì)的，但是并非必需如此，因此該方法也適于例如聚合物。-通過(guò)膠體蝕刻法圖案化在此，通過(guò)使膠體微粒(例如聚苯乙烯或鐵蛋白)沉積而使表面納米圖案化是可行的，這類(lèi)似于近程有序圖案。這些微?？梢杂米骼缰苽渲奈g刻掩模、在表面上制備突出物的形貌模板或例如納米金屬簇的沉積(例如通過(guò)鐵蛋白的金屬中心)。-通過(guò)超短激光脈沖的激光圖案化該項(xiàng)技術(shù)可用于高精密圖案化。特別是燒蝕工藝強(qiáng)的非線性導(dǎo)致材料切除有界線清晰的閾值，且這已被用來(lái)證實(shí)甚至衍射極限以下的 g 豐勾的？ (P. P. Pronko, S. K. Dutta, J. Squier, J. V. Rudd, D. Du, G. Mourou =Optical Communication 114, (1995)106)。-通過(guò)超短激光脈沖的激光圖案化還可與石英球的預(yù)沉積聯(lián)用(K.Vestentoft， J. A. Olesen,B. H. Christensen,P. Balling =Appl. Phys A80, (2005)493)來(lái)制備大陣列的納米大小的孔。更準(zhǔn)確地講，將石英球?qū)映练e在表面上通常但并非一定產(chǎn)生密集的陣列。通過(guò)超短脈沖的未聚焦激光束掃描具有石英球的表面，有可能產(chǎn)生大面積的平行結(jié)構(gòu)，因?yàn)槭⑶蛴米骶劢辜す馐莫?dú)立透鏡。-激光掃描束干涉蝕刻法(InterferenceLithography)這種低成本方法可用于在大的表面面積上制備周期和準(zhǔn)周期及空間相干圖案。該方法利用兩個(gè)或更多個(gè)相干平面波陣面之間的干涉(S. Kuiper7H. van Wolferen7G. van Ri jn, Journal of Micromechanicsand Microengineeringll(1), (2001)33)。V.用于培養(yǎng)組織或細(xì)胞的包括具有微米級(jí)表面結(jié)構(gòu)的暴露表面的裝置圖9圖示具有微米級(jí)結(jié)構(gòu)暴露表面的組織培養(yǎng)皿的剖視示意圖。培養(yǎng)皿301包括具有底部303和側(cè)壁302的向上開(kāi)口的容器。在使用時(shí)，上表面304暴露于細(xì)胞培養(yǎng)物或組織，從而為培養(yǎng)物提供微環(huán)境。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，暴露表面304具有選定用以促進(jìn)本文所述的預(yù)定細(xì)胞功能的微米級(jí)形貌結(jié)構(gòu)?？捎靡韵禄衔锢缤ㄟ^(guò)熱壓印或通過(guò)注射成型，或者通過(guò)本領(lǐng)域已知的和/或本文所述的任何其它合適的方法由合適的印模或藍(lán)圖產(chǎn)生大量的這類(lèi)表面例如聚合物，如聚苯乙烯、不同類(lèi)型的聚己酸內(nèi)酯、聚甲基丙烯酸甲酯、 硅酮包括聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚(D，L-丙交酯-乙交酯共聚物)、聚乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯醇、透明質(zhì)酸型聚合物、聚環(huán)氧乙烷、聚對(duì)苯二甲酸丁二醇酯、甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿、mr-I T85、mr-I 7030、聚(雙(三氟乙氧基)磷腈 (poly (bis (trifluoroethoxy)phosphazenes)、天然聚合物包括修飾多糖(例如淀粉、纖維素和脫乙酰殼多糖)及上述化合物的混合物和共聚物。表面304可以是底部303的上表面或位于培養(yǎng)皿的底部303上方的獨(dú)立組件(例如圓盤(pán))的上表面。例如，這類(lèi)組織培養(yǎng)皿 /培養(yǎng)瓶或具有被選用來(lái)支持未分化狀態(tài)的胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)的任何表面可用來(lái)使大量胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)，其在稍后的發(fā)育中可被誘導(dǎo)分化成所需要的細(xì)胞類(lèi)型。一旦分化成特定的細(xì)胞類(lèi)型，則這些特定的細(xì)胞類(lèi)型可用于藥物篩選和/或細(xì)胞替代療法。表面304還可以單獨(dú)的組織培養(yǎng)塑料制品的形式提供，其經(jīng)過(guò)改進(jìn)以在表面上顯示特定的結(jié)構(gòu)或這些結(jié)構(gòu)藍(lán)圖。例如，單獨(dú)的組織培養(yǎng)塑料制品可以是可移動(dòng)地插入培養(yǎng)皿301中。在這方面，術(shù)語(yǔ)組織培養(yǎng)塑料制品是指包括可以用來(lái)制備可用于細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞的體外生長(zhǎng)的表面的任何聚合物/金屬涂料/材料。
實(shí)施例實(shí)施例1包含測(cè)試區(qū)的13x3鉭陣列的BSSA圓片的制備厚度為525士25 μ m的單面拋光硅片提供了用于生物相容性材料制備的底層。圓片為η型圓片，電阻系數(shù)為l-20ohm cm。按照下列方案，在SF6/02放電下，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)光刻法和反應(yīng)性離子蝕刻法將微米型圖案印制在硅片的拋光面上1.圓片用氫氟酸緩沖液(BHF，BHF是濃HF (49% )、水和緩沖鹽、NH4F的溶液，比率約1 6 4)預(yù)蝕刻30秒鐘，然后在氮?dú)饬飨赂稍铮?.圓片然后用 1. 5μπι厚的光致抗蝕劑AZ5214(Hoechst Celanese Corporation, NJ，US，化學(xué)組成可參見(jiàn)由Hoechst Celanese Corporation提供的材料安全數(shù)據(jù)表 (MATERIAL SAFETY DATA SHEET, MSDS))層旋涂。于約 90°C預(yù)烘干 120 秒鐘，和3.在AL6-2型EVC整直器中，將涂覆光致抗蝕劑的圓片通過(guò)合適的掩模暴露于紫外線5秒鐘，使之顯影50-60秒鐘，然后于120°C后烘1分鐘，和4.然后將涂覆光致抗蝕劑的圓片圖案化用BHF短暫蝕刻約30秒鐘，然后以約 0. 30 μ m/分鐘的速度進(jìn)行反應(yīng)性離子蝕刻(RIE)，用丙酮脫去耐蝕膜接著進(jìn)行RCA清洗。 RCA清洗過(guò)程相繼采用的三個(gè)主要步驟用5 1 IH2O H2O2 NH4OH溶液(SCl)除去不溶性有機(jī)污染物。使用稀的50 IH2O HF溶液，除去由于(I)所致而可能蓄積金屬污染物的薄的二氧化硅層。使用6 1 1 H2O H2O2 HCl的溶液(SC2)除去離子和重金屬原子污染物。5.圖案化圓片然后與熱生長(zhǎng)于1000°C 15分鐘的20nm SiO2層一起通過(guò)干氧化而鈍化。6.通過(guò)濺射沉積將250nm鉭層沉積于圖案化圓片的表面。制備包括168結(jié)構(gòu)化正方形的圓片，且一個(gè)對(duì)照非結(jié)構(gòu)化正方形作為測(cè)試區(qū)，其中各區(qū)都具有一個(gè)特定的橫向形貌，按照實(shí)施例1制備指定結(jié)構(gòu)A_K[圖8A-K]。結(jié)構(gòu)圖案 A-J中的每一個(gè)用圓片上的16個(gè)正方形表示，但具有用(X，Y)規(guī)定的不同尺寸。對(duì)結(jié)構(gòu)圖案A的原理進(jìn)行了說(shuō)明。K結(jié)構(gòu)用不同尺寸的8個(gè)正方形表示，所述尺寸以參數(shù)T限定。X、 Y和T的單位為μπι。按照這些規(guī)定參數(shù)制備圓片，其中橫向形貌的深度規(guī)定為0.6μπι、 1· 6μπι禾口 2· 4μπι?！?“ΑΧ/Υ”圖3所示的行結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)包括寬X(ym)的槽41和寬Υ(μπι)的脊 42。因此，圖3的行結(jié)構(gòu)只沿一維具有微米大小特征。在實(shí)施例1中，區(qū)域Α(2，2)包括槽寬 2 μ m和脊寬2 μ m的行結(jié)構(gòu)，區(qū)域A (4，4)包括槽寬4 μ m和脊寬4 μ m的行結(jié)構(gòu)，區(qū)域A (4， 2)包括槽寬4 μ m和脊寬2 μ m的行結(jié)構(gòu)。ZBXzT':圖4所示的正方形-孔結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)包括尺寸為Χ( μπι) χ X(ym)的正方形孔/凹穴51，其間距為X+Y，即脊網(wǎng)52寬為Y。因此，圖4結(jié)構(gòu)在測(cè)試區(qū)表面的平面中具有二維數(shù)的微米大小特征。在實(shí)施例1中，區(qū)域B (4，4)包括尺寸4μπιΧ4μπι和間距8μπι 的正方形孔。· “ΚΧ/Υ” 圖5所示的包含被脊分隔開(kāi)的長(zhǎng)方形孔/凹穴的結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)包括長(zhǎng)方形孔61，尺寸X(μ m)χγ(μ m)，被寬為X(ym)的脊62分隔開(kāi)。ZDXzT':包含圖6所示的突出物/柱的結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)包含具有正方形橫截面的突出物/柱71，尺寸為乂&111)1乂&111)，間距為乂+￥。因此區(qū)域0(2，4)包括柱尺寸為2 μ mx2 μ m 和間距為6 μ m的正方形-柱結(jié)構(gòu)。*“CX”:圖7所示的正方形-孔/柱結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)具有棋盤(pán)外觀，孔81和突出物/ 柱82，兩者都具有尺寸為X ( μ m) Χχ ( μ m)的正方形的形狀。要了解的是，上述制備方法還可適用于具有其它形式和測(cè)試區(qū)尺寸以及其它結(jié)構(gòu)類(lèi)型的圓片。同一制備方法可用于許多不同的圓片，其中測(cè)試區(qū)和特定表面結(jié)構(gòu)的布局由圓片所暴露的掩模決定。實(shí)施例2用于促進(jìn)多能小鼠胚胎干(EQ細(xì)胞生長(zhǎng)的生物相容性表面的鑒定使未分化的鼠ES細(xì)胞在界線清晰的致密集落中生長(zhǎng)(圖10)。當(dāng)集落變平并展開(kāi)時(shí)，ES細(xì)胞非常可能已開(kāi)始分化。因此，集落形態(tài)是明顯的，且是普遍認(rèn)可的多能性標(biāo)志物。非常確定的胞內(nèi)多能性標(biāo)志物的實(shí)例是轉(zhuǎn)錄因子0ct4和Nanog以及堿性磷酸酶(AP)。以1.3-5xl06個(gè)細(xì)胞/plO培養(yǎng)皿的密度將ES細(xì)胞(KH2細(xì)胞和CJ7細(xì)胞)接種在按實(shí)施例1制備的鉭BSSA圓片上(圖11)。將細(xì)胞在5% C02、90%空氣濕度和37°C的條件下培養(yǎng)3天。使細(xì)胞在補(bǔ)充了 15(% 03、21111谷氨酰胺、5(^/1111青霉素、50 μ g/ml鏈霉素、 非必需氨基酸、ΙΟΟμΜ β-巰基乙醇和核苷但不存在飼養(yǎng)細(xì)胞層的DMEM中生長(zhǎng)。此外，ES 細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基補(bǔ)充了白血病抑制生長(zhǎng)因子(LIF) 1000U/ml,以助于維持ES細(xì)胞的未分化表型。培養(yǎng)3天后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶(AP)活性染色(藍(lán)色)，這為未分化鼠ES細(xì)胞提供陽(yáng)性標(biāo)志物。對(duì)于兩個(gè)細(xì)胞系，不同結(jié)構(gòu)之間的集落形態(tài)存在明顯的差異(圖12)?？偟膩?lái)講， 在所述結(jié)構(gòu)上，CJ7細(xì)胞比KH2細(xì)胞容易分化，但卻有著相關(guān)的共同特征在2. 4μ m結(jié)構(gòu)高度的Fl. 2上形成的集落形成界線清晰的具有AP活性的圓形集落。在相同的結(jié)構(gòu)高度上， F4. 1上的集落易變平并損失AP染色強(qiáng)度。生長(zhǎng)在K8結(jié)構(gòu)上的集落是長(zhǎng)形的，并且AP染色強(qiáng)度減弱。尤其對(duì)于CJ7細(xì)胞，這種效應(yīng)隨結(jié)構(gòu)高度降低而增強(qiáng)。對(duì)于其它結(jié)構(gòu)，當(dāng)結(jié)構(gòu)高度降低時(shí)集落數(shù)減少。結(jié)構(gòu)高度降低還趨于增加集落大小和減少AP染色。兩個(gè)細(xì)胞系對(duì) NS正方形的反應(yīng)不同CJ7集落開(kāi)始分化，而KH2集落與其在結(jié)構(gòu)化正方形上的生長(zhǎng)形態(tài)相比，范圍小、界線清晰且數(shù)目減少。由于分析了大量的生物相容性結(jié)構(gòu)，因此使用集落數(shù)自動(dòng)計(jì)數(shù)對(duì)ES細(xì)胞生長(zhǎng)模式進(jìn)行了量化。根據(jù)集落形態(tài)和AP染色強(qiáng)度，對(duì)該方法與手工計(jì)數(shù)進(jìn)行了比較。未分化KH2ES集落的手工和自動(dòng)計(jì)數(shù)的比較(圖13)表明，自動(dòng)計(jì)數(shù)一向過(guò)高估計(jì)集落數(shù)。然而，(自動(dòng)計(jì)數(shù)數(shù)目)/(手工計(jì)數(shù)數(shù)目)之比相對(duì)穩(wěn)定1. 5 士 0.3。顯然自動(dòng)計(jì)數(shù)檢測(cè)在各個(gè)結(jié)構(gòu)上發(fā)育的集落數(shù)的特征與用手工計(jì)數(shù)檢測(cè)的那些特征一致。對(duì)于CJ7 細(xì)胞，手工計(jì)數(shù)和自動(dòng)計(jì)數(shù)之間有同樣良好的關(guān)聯(lián)性。這就證實(shí)了自動(dòng)計(jì)數(shù)方法適于鑒定產(chǎn)生例如高集落數(shù)的生物相容性結(jié)構(gòu)。此外，計(jì)算輸出還估算了被未分化ES細(xì)胞集落覆蓋的總面積(ES細(xì)胞集落總面積)和被細(xì)胞覆蓋的總面積(DAPI總面積)。為此，將ES細(xì)胞用4'，6- 二脒基-2-苯基吲哚[DAPI]染色，DAPI是一種與DNA牢固結(jié)合并且能跨過(guò)完整細(xì)胞膜的熒光染料，因此用于對(duì)活細(xì)胞和固定細(xì)胞進(jìn)行染色。被DAPI染色的細(xì)胞用紫外線激活后通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)。當(dāng)DAPI與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)，其最大吸收位于358nm，其最大發(fā)射位于461nm，看上去為藍(lán)/青色。然后使用自動(dòng)計(jì)數(shù)對(duì)從圖11描述的實(shí)驗(yàn)中獲得的結(jié)果進(jìn)行量化。由于在不同結(jié)構(gòu)高度上集落數(shù)的變化頗大，因此對(duì)于圖14的不同高度，有必要應(yīng)用不同的色度，其中色度越暗，集落數(shù)就越大。集落數(shù)一般隨X尺寸的減小而增加。在其中尺寸為Υ = 2μπι或 4μπι且X=Iym或2μπι的結(jié)構(gòu)上，獲得最大集落數(shù)，而當(dāng)Y=I且Χ = 2μπι、4μπι或6μπι 時(shí)獲得最小的集落數(shù)。所有K結(jié)構(gòu)上觀察到低水平的集落數(shù)。不同的受測(cè)生物相容性表面結(jié)構(gòu)的作用還可參見(jiàn)圖15。具有小的最小橫截面徑 (小X)的突出物的表面結(jié)構(gòu)產(chǎn)生最大的ES細(xì)胞集落數(shù)，而較大X值的突出物產(chǎn)生較少的集落數(shù)。此外，該圖表明，其中尺寸Y = 2 μ m或4 μ m的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生最多的集落數(shù)，這取決于X 的值。因此就Y值(結(jié)構(gòu)中柱間的距離)而言，我們鑒定出集落形成的局部最優(yōu)值。據(jù)推斷，在X尺寸小于1 μ m的結(jié)構(gòu)集落數(shù)將進(jìn)一步增加。觀察圖15發(fā)現(xiàn)，對(duì)未分化ES細(xì)胞增殖的不利條件與少于1個(gè)突出物/65 μ m2的表面結(jié)構(gòu)和其中突出物的面積超過(guò)表面總面積25%的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)。因此得出結(jié)論，未分化ES細(xì)胞的最佳增殖與滿足這兩個(gè)條件的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)。圖16圖示結(jié)構(gòu)高度與CJ7和ΚΗ2細(xì)胞系的ES細(xì)胞集落數(shù)之間的關(guān)系。垂直軸上給出的是整片圓片的ES細(xì)胞集落總數(shù)。集落數(shù)隨結(jié)構(gòu)高度明顯增加，這種效應(yīng)可見(jiàn)于這兩個(gè)細(xì)胞系。全部數(shù)據(jù)分析顯示，X = 1、Y = 2或4和結(jié)構(gòu)高度2. 4 μ m的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生最大集落數(shù)。
實(shí)施例3在生物相容性表面上進(jìn)行連續(xù)傳代期間保持小鼠胚胎干(EQ細(xì)胞的多能性和生長(zhǎng)形態(tài)之前的實(shí)施例證實(shí)，具有不同的表面結(jié)構(gòu)的生物相容性表面可用于促進(jìn)高的ES 集落數(shù)(例如結(jié)構(gòu)F1. 2)或促進(jìn)低的ES集落數(shù)(例如結(jié)構(gòu)F4. 1)。在CJ7和KH2ES細(xì)胞的連續(xù)傳代中研究了這些結(jié)構(gòu)對(duì)ES細(xì)胞生長(zhǎng)的持續(xù)作用。在每次傳代后，將ES細(xì)胞固定， 并使用0ct4和Nanog的特異性抗體分析0ct4和Nanog表達(dá)。ES細(xì)胞CJ7和KH2分別在 Fl. 2 (F1. 2的尺寸為X = 1 ;Y = 2)或F4. 1 (F4. 1的尺寸為X = 4 ;Y = 1)上傳代6次和10 次后，仍表達(dá)多能性標(biāo)志物。在最后一次傳代中，CJ7和ΚΗ2細(xì)胞還表達(dá)堿性磷酸酶。在傳代期間，在Fl. 2結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生的ES集落保持致密和界線清晰的形態(tài)，在F4. 1形成的集落也保持其形態(tài)。總之，這些結(jié)果表明所述結(jié)構(gòu)對(duì)ES細(xì)胞集落形成的作用在傳代期間得到保持。實(shí)施例4通過(guò)在生物相容性表面上連續(xù)傳代獲得的小鼠胚胎干(EQ細(xì)胞的種系潛力表示用于ES細(xì)胞種系傳遞方案的步驟的示意圖見(jiàn)圖18。在體外連續(xù)傳代后，采用圖18描繪的胚泡注射方案測(cè)定了 CJ7ES細(xì)胞的種系潛力。使CJ7細(xì)胞在以下之一中進(jìn)行傳代生物相容性表面結(jié)構(gòu)Fl. 2、F4. 1 ；涂覆明膠的培養(yǎng)板；或補(bǔ)充了飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基 (按照實(shí)施例幻。然后將得自傳代后收獲的各個(gè)細(xì)胞群的CJ7細(xì)胞注射入胚泡中，將胚泡植入代孕母體中。在其子代嵌合雄性幼仔中進(jìn)行選擇用于育種。在Fl. 2或在包含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基上傳代的CJ7細(xì)胞保持種系潛力，而在F4. 1或涂覆明膠的培養(yǎng)板上傳代的細(xì)胞未觀察到種系潛力，這表明至少在F 1. 2結(jié)構(gòu)上傳代的細(xì)胞保持種系能力。實(shí)施例5用于促進(jìn)小鼠胚胎干(EQ細(xì)胞均一分化性生長(zhǎng)的生物相容性表面的鑒定觀察到體外生長(zhǎng)的ES集落變平和展開(kāi)，這就表示ES細(xì)胞分化(圖10)。因此，集落形態(tài)是明顯的，且是普遍認(rèn)可的多能性和分化的標(biāo)志物?；贒API總覆蓋面積減去屬于 ES集落的面積的分化指數(shù)，提供由給定生物相容性結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)的ES細(xì)胞分化程度的測(cè)量值。因此，分化指數(shù)被用來(lái)測(cè)定按照實(shí)施例2生長(zhǎng)在BSSA圓片上的ES細(xì)胞。圖20 給出測(cè)定的分化指數(shù)，其中較暗的色度相當(dāng)于較高的分化指數(shù)。對(duì)于受測(cè)試的所有類(lèi)型的表面結(jié)構(gòu)，尺寸X值的增加導(dǎo)致分化指數(shù)增加(X = 6 > X = 4 > X = 2 > X = 1)。同樣， Y = 1的結(jié)構(gòu)和K結(jié)構(gòu)具有相對(duì)高的分化指數(shù)，分化指數(shù)大致上隨結(jié)構(gòu)高度的降低而增加 (0. 6 μ m > 1. 6 μ m > 2. 4 μ m)。進(jìn)一步觀察到，產(chǎn)生高集落數(shù)的表面結(jié)構(gòu)具有低分化指數(shù)， 且低集落數(shù)的結(jié)構(gòu)具有高分化指數(shù)(圖21)。生長(zhǎng)在高度為0. 6 μ m的結(jié)構(gòu)上的細(xì)胞獲得最低集落數(shù)和最大分化指數(shù)。實(shí)施例6在生物相容性表面上培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的研究引言人胚胎干(hEQ細(xì)胞是多能細(xì)胞，來(lái)源于人胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，一般在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mEF)飼養(yǎng)層上培養(yǎng)。使用細(xì)長(zhǎng)的巴氏吸管通過(guò)手工顯微切割hES集落，隨后接種在新鮮的mEF飼養(yǎng)層上而常規(guī)實(shí)現(xiàn)未分化細(xì)胞的傳代。這種方法非常費(fèi)力而且耗時(shí)，并
27不適于大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)。開(kāi)發(fā)其中hES細(xì)胞可以在動(dòng)物飼養(yǎng)層不存在時(shí)也能擴(kuò)增的培養(yǎng)技術(shù)是在人細(xì)胞療法和高通量藥物開(kāi)發(fā)中使用hES細(xì)胞的先決條件。為了滿足這些需要，將hES細(xì)胞培養(yǎng)在形貌結(jié)構(gòu)化表面上，以確定這些表面是否可支持hES生長(zhǎng)，培養(yǎng)在這些表面上的hES細(xì)胞是否維持其多能性，以及在后續(xù)傳代后當(dāng)培養(yǎng)在生物相容性表面上時(shí)hES細(xì)胞是否繼續(xù)生長(zhǎng)并維持多能性。方法根據(jù)之前通過(guò)BioSurface Structure Array (BSSA)圓片對(duì)不同表面的篩選(參見(jiàn)圖1)，對(duì)于mES培養(yǎng)，選擇4種表面培養(yǎng)hES細(xì)胞，即F (1，2)、F (1，4)、F (4，1)、G (4，1)， 其中各微結(jié)構(gòu)化表面特征(突出部分)的高度/深度為2.4μπι。初步實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，hES 細(xì)胞(King' s College London細(xì)胞系)在表面F(1，4)和F(l，2)上生長(zhǎng)得更好，因此集中研究這兩個(gè)表面。使未分化的hES細(xì)胞(KCL-OO》培養(yǎng)物在含有10% ES級(jí)FBS的培養(yǎng)基中于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mEF)飼養(yǎng)層上維持。從mEF飼養(yǎng)層手工切割未分化的集落， 將約5-6片接種至每個(gè)生物相容性表面上。結(jié)果細(xì)胞附著首先，檢查細(xì)胞確定它們是否可附著在表面上。為此，將未分化的hES細(xì)胞層手工切成小片，并接種在相應(yīng)的表面上。結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞次日能夠很好地定居在表面F(l，4)和 F(l, 2)兩者上。兩種表面的附著能力的比較表明，與表面F(l，2)相比，表面F(l，4)上附著較多的細(xì)胞集落。此外，還在KnockOut血清替代品(KOSR)而不是血清中對(duì)細(xì)胞集落進(jìn)行了測(cè)試。為此，將hES細(xì)胞集落在KOSR的mEF飼養(yǎng)層上培養(yǎng)4次傳代，然后轉(zhuǎn)移至F(1，2) 和F(l，4)表面上。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，次日細(xì)胞集落無(wú)法有效地在表面F(l，4)或F(Id)上定居。 然而，與表面F(Id)相比，相對(duì)較大量的集落附著在表面F(l，4)上。這就表明，表面F(l， 4)的細(xì)胞附著比表面F(l，2)的相對(duì)更有效，但是當(dāng)培養(yǎng)在血清中時(shí)，細(xì)胞附著在表面上的情況比在KOSR中要好得多。細(xì)胞生長(zhǎng)為了確定hES細(xì)胞是否可在表面上增殖，將細(xì)胞集落接種在表面上，并在2ml含有 10%胎牛血清(FBQ的hES培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每隔一天更換培養(yǎng)基，并且在此期間補(bǔ)充lml。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在FBS血清存在下，細(xì)胞集落在兩個(gè)表面F(l，4)和F(Id)上都生長(zhǎng)得很好。如圖30和圖31所示，hES集落能夠在表面上擴(kuò)增。各集落的大小一般每天增加 30-40%。生長(zhǎng)在表面的hES細(xì)胞集落的形態(tài)與生長(zhǎng)在Geltrex (Invitrogen)上的細(xì)胞集落十分相似(圖32)。hES細(xì)胞多能性的維持為了確定hES細(xì)胞是否能夠在表面上維持其多能性，使細(xì)胞生長(zhǎng)1周，然后在4% PFA中固定，并用抗0ct4(0Ctamer-4)抗體染色。圖像見(jiàn)圖33和圖34。所有的細(xì)胞核用DAPI染色。0ct4是位于未分化hES細(xì)胞核上的轉(zhuǎn)錄因子。圖33 和圖34顯示50-70%的細(xì)胞在表面上培養(yǎng)1周后對(duì)0ct4呈免疫陽(yáng)性。這就表明，大多數(shù)細(xì)胞能夠維持其在表面上的多能性。小結(jié)綜上所述，hES細(xì)胞在特征高度/深度為2. 4μπι的微表面F (1，4)和F (1，2)可以
28生長(zhǎng)得非常好，并維持其多能性，正如0ct4表達(dá)所證實(shí)的一樣。細(xì)胞可通過(guò)膠原酶IV消化而傳代，然而這會(huì)妨礙細(xì)胞生長(zhǎng)。本發(fā)明的第二方面。這個(gè)方面涉及需要成功整合到骨組織以獲得良好臨床效果的植入物。在過(guò)去的幾十年間這方面已取得了重大的進(jìn)展和結(jié)果，但是植入物隨時(shí)間松脫仍是長(zhǎng)期關(guān)節(jié)置換是否成功的重大問(wèn)題。具有可促進(jìn)成骨細(xì)胞中骨橋蛋白和骨鈣蛋白表達(dá)的表面的植入物或裝置可根據(jù)其應(yīng)用而改進(jìn)治療結(jié)果。因此，本發(fā)明提供生物相容性材料或結(jié)構(gòu)，其通過(guò)骨形成細(xì)胞(包括成骨細(xì)胞)的骨橋蛋白和骨鈣蛋白表達(dá)而支持骨生成。矯形植入物具有有限的壽命，當(dāng)植入物和骨組織之間的附著不良時(shí)可導(dǎo)致植入物脫位。因此，本發(fā)明還提供植入物表面，其支持成骨細(xì)胞表達(dá)骨橋蛋白和骨鈣蛋白，從而改進(jìn)植入物的生物相容性。本發(fā)明基于這樣的認(rèn)識(shí)，即指導(dǎo)基因表達(dá)、生長(zhǎng)和/或分化的細(xì)胞功能在很大程度上受細(xì)胞微環(huán)境的影響。因此，一般認(rèn)為體內(nèi)和體外骨細(xì)胞的基因表達(dá)可取決于細(xì)胞可附著的合適結(jié)構(gòu)的提供。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明認(rèn)識(shí)到，細(xì)胞微環(huán)境的表面二維和三維構(gòu)造或形貌是上述過(guò)程的決定性因素。有無(wú)數(shù)不同的可能的微環(huán)境。因此，一方面，本發(fā)明涉及生物相容性材料的提供，生物相容性材料的表面形貌產(chǎn)生可促進(jìn)成骨細(xì)胞表達(dá)骨橋蛋白和骨鈣蛋白并導(dǎo)致植入物更好地整合至其余骨的特定微環(huán)境。可受表面形貌影響的其它細(xì)胞功能包括細(xì)胞生長(zhǎng)、擴(kuò)增、分離、遷移、分化、去分化、胞內(nèi)外組構(gòu)等。由于蛋白質(zhì)和細(xì)胞的尺寸范圍為納米或微米，因此這些是與提供生物相容性材料的問(wèn)題有關(guān)的長(zhǎng)度尺度。I.證實(shí)生物相容性性質(zhì)和本發(fā)明的生物相容性材料促進(jìn)細(xì)胞功能(例如促進(jìn)礦化)的方法?？刹捎锰峁┎煌蜻x形貌結(jié)構(gòu)的篩選工具/測(cè)定法，通過(guò)具有不同的表面形貌篩選材料來(lái)鑒定本發(fā)明的生物相容性材料或結(jié)構(gòu)。具體地講，應(yīng)用例如茜素紅染色(實(shí)施例2)、von Kossa染色(von Kossa, J(1901) “ Ueber die im Organismus kuenstlich erzeugbaren Verkalkungen. “ Beitr Pathol Anat AIIg Pathol四163-202)、異位成骨(實(shí)施例3)和體內(nèi)骨生成/骨長(zhǎng)入(實(shí)施例4)等礦化測(cè)定法，提供了表明本發(fā)明的生物相容性材料的性質(zhì)和用于選擇促進(jìn)礦化的合適形貌結(jié)構(gòu)的工具。 適于篩選形貌結(jié)構(gòu)的篩選工具的實(shí)例包括所謂的BioSurface Structure Array (BSSA)圓片。圖1是圖示這類(lèi)BioSurface Structure Array圓片的實(shí)例的頂視圖。 BSSA圓片1包含60個(gè)測(cè)試區(qū)。多個(gè)測(cè)試區(qū)2留作“空白”，即不被加工成具有結(jié)構(gòu)化表面。 因此，測(cè)試區(qū)2的表面基本上是平整的。因此在具有BSSA篩選工具的每個(gè)平行篩選試驗(yàn)中都固定包括了對(duì)照實(shí)驗(yàn)。規(guī)定為Si，S2. . .，S54的其余測(cè)試區(qū)包含如本文所述的各個(gè)結(jié)構(gòu)化表面。測(cè)試區(qū)是正方形，尺寸lOmmxlOmm。用作鑒定誘導(dǎo)/提高細(xì)胞功能(例如礦化、生長(zhǎng)和基因表達(dá))的結(jié)構(gòu)的篩選工具的圓片可通過(guò)多種生產(chǎn)技術(shù)制備。其制備方法的實(shí)例包括一種或多種本領(lǐng)域已知的下列技術(shù)·光刻方法光刻法是其中將幾何形狀/圖案從光掩模轉(zhuǎn)印至待結(jié)構(gòu)化的表面 (例如圓片的表面)上的已知方法。已知具有范圍為約1微米至IOOnm以下的最小橫向
29特征尺寸的光刻設(shè)備。光刻法參見(jiàn)例如S. M. Semiconductor Devices, Physics and Technology，第■^片反，John Wiley & Sons 2002，第 12 M Lithography and Etching;以及載于 Plummer, Deal, Griffin :Silicon VLSI Technology, Fundamentals, Practice, and Modeling, Prentice Hall 2000,第 5 章Lithography?！る娮邮g刻法基本上，可采用電子束蝕刻法以與光用于光刻法中完全一樣的方式來(lái)暴露光致抗蝕劑。電子束蝕刻法具有高達(dá)約5nm的特別高的分辨率?！釅河釅河∈褂弥饔∧⑽⒚缀图{米級(jí)結(jié)構(gòu)壓印在聚合物基底上。該方法使用各種聚合物材料可供主印模產(chǎn)生許多完全圖案化的基底。熱壓印提供低成本、多用途的制備方法，非常適于從研究與開(kāi)發(fā)應(yīng)用到大量生產(chǎn)用途的BSSA的制備?？色@得高長(zhǎng)寬比與極高均勻度的大型圓片(例如8英寸或12英寸圓片)上的微米和納米級(jí)結(jié)構(gòu)。20nm以下的特征尺寸是可能的?？梢酝ㄟ^(guò)例如電子束蝕刻技術(shù)來(lái)制備主印模。 可能涉及生產(chǎn)生物相容性材料或結(jié)構(gòu)的生產(chǎn)步驟或工藝的其它實(shí)例包括納米壓印蝕刻法、激光消融、化學(xué)浸蝕、等離子噴涂、磨料噴射、雕刻、刮擦、微細(xì)加工等。圖2圖示圖1圓片的剖視圖。圖加圖示標(biāo)為A-B直線的完整圓片寬度的橫截面。 圖2b圖示一個(gè)測(cè)試區(qū)一部分表面的放大圖。圓片1具有包括圖案化襯底層21 (例如硅層) 和表面層23的多層結(jié)構(gòu)。圓片的表面是圖案化的(例如通過(guò)光刻法)，以在各個(gè)測(cè)試區(qū)Si， S2，...，SM表面上提供不同的圖案。結(jié)構(gòu)具有深度/高度H。在光刻法中，高度H是可通過(guò)蝕刻過(guò)程控制的。圖案化表面被一層薄的二氧化硅層22和/或以下不同生物相容性材料的表面層23覆蓋例如鉭或任何其它金屬、金屬氧化物、金屬氮化物、金屬碳化物、金剛石、類(lèi)金剛石碳、半導(dǎo)體、半導(dǎo)體氧化物/氮化物、絕緣體、聚合物、共聚物。測(cè)試區(qū)之間有無(wú)結(jié)構(gòu)的“空白”邊區(qū)，即邊區(qū)未被加工成具有結(jié)構(gòu)化表面。在這種情況下，空白邊區(qū)寬為 0.3mm?？瞻走呅杏兄诮Y(jié)構(gòu)的直觀排列和鑒定?？瞻走呥€用作緊鄰各測(cè)試正方形的小的對(duì)照表面。注意圖2是示意圖，并未按比例繪制。尤其是垂直尺寸可放大以提高可讀性。II.本發(fā)明的生物相容性材料的化學(xué)組成生物相容性材料或結(jié)構(gòu)的實(shí)施方案可呈多種形式，例如-醫(yī)學(xué)植入物或用于制備醫(yī)學(xué)植入物的生物相容性涂層材料，-具有暴露于細(xì)胞培養(yǎng)物的表面的組織培養(yǎng)皿/培養(yǎng)瓶，其中暴露表面具有支持所需細(xì)胞功能(例如未分化狀態(tài)的神經(jīng)元或胚胎干細(xì)胞的生長(zhǎng)或分化)的結(jié)構(gòu)，-組織培養(yǎng)物表面或例如已被改進(jìn)以呈現(xiàn)這些結(jié)構(gòu)或表面上這些結(jié)構(gòu)的藍(lán)圖的組織培養(yǎng)塑料制品。在這方面，組織培養(yǎng)塑料制品是指可用于制備細(xì)胞培養(yǎng)體外細(xì)胞的生長(zhǎng)表面的任何聚合物。生物相容性材料或結(jié)構(gòu)的實(shí)施方案可包含襯底層和任選表面層。用于制備生物相容性材料或結(jié)構(gòu)的合適原材料包括任何半導(dǎo)體(摻雜或未摻雜)、單一金屬、金屬氧化物、金屬氮化物、合金、陶瓷、聚合物、共聚物、復(fù)合材料、遞藥系統(tǒng)、 具有生物活性分子的聚合物、其它生物活性化合物或其任何組合。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，表面層包含有足夠的生物相容性以提高成骨細(xì)胞礦化的材料。表面層的實(shí)例包括金屬表面沉積物，例如鉭、鈦、Ti-Al-V合金、金、鉻、金屬氧化物、 半導(dǎo)體氧化物、金屬氮化物、半導(dǎo)體氮化物、聚合物、生物聚合物或其它合金。植入物的優(yōu)選
30的表面組成成分包括鉭或鈦。在一些實(shí)施方案中，生物相容性材料或結(jié)構(gòu)包含其它組分，例如一種或多種可沉積或吸附在所述材料或結(jié)構(gòu)的暴露表面或表面層上的生物活性化合物。例如所述化合物可選自抗體、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、多糖、脂質(zhì)、生長(zhǎng)激素、有機(jī)化合物和無(wú)機(jī)化合物。優(yōu)選選自81^丄6 樣36 -0的生長(zhǎng)激素吸附于生物相容性材料的表面或與生物相容性材料的表面結(jié)合。III.本發(fā)明的生物相容性材料的結(jié)構(gòu)性質(zhì)生物相容性材料或結(jié)構(gòu)的全部或部分表面(其可呈上述的多種形式)包含在由該材料或結(jié)構(gòu)的表面界定的平面內(nèi)一維或多維的微米級(jí)特征。本文使用的術(shù)語(yǔ)微米級(jí)和微米大小是指在約Iym和約1000 μ m范圍內(nèi)的長(zhǎng)度尺度。本文使用的術(shù)語(yǔ)納米級(jí)是指在約Inm 和約lOOOnm、特別是在約Inm和約IOOnm范圍內(nèi)的長(zhǎng)度尺度。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，特征是結(jié)構(gòu)/形貌特征，例如由生物相容性材料的表面延伸出來(lái)的突出物。生物相容性材料的表面可包括在至少一個(gè)橫向方向上具有水平尺寸的微米級(jí)特征，該水平尺寸基本上在與表面平行或至少基本上與表面正切的方向上測(cè)量。該水平尺寸選自以下的間距介于約Ιμπι和約20 μ m之間、介于約1_10μπι之間、介于約10-20 μ m 之間、介于約1μπι-2μπι之間、介于約2μπι-4μπι之間、介于約4μπι-6μπι之間、介于約 6口111-8“111之間、介于約8“111-1(^111之間、介于約10-12 μ m之間、介于約12-14 μ m之間、介于約14-16 μ m之間、介于約16-18 μ m之間、介于約18-20 μ m之間。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，突出物具有最小橫截面徑為1. 0 μ m-2. 0 μ m 的橫截面。生物相容性材料的表面上微米級(jí)特征的分布優(yōu)選是沿一個(gè)或多個(gè)橫向方向呈周期性的，可通過(guò)具有選自以下一種間隔的橫向間距尺寸的周期函數(shù)來(lái)描述介于約 1 μ m-2 μ m之間、介于約2 μ m_4 μ m之間、介于約4 μ m_6 μ m之間、介于約6 μ m_10 μ m之間、 介于約10μ -16μπ 之間、介于約16μ -20μπ 之間、介于約20μ -24μπ 之間。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在沿至少一維的相鄰格點(diǎn)之間的距離介于 2· Ομ 禾P 9· Ομ 之間。任何微米級(jí)特征與其最近鄰特征之間的最大距離或間隙在至少一個(gè)橫向方向上具有水平尺寸，其中所述尺寸選自以下的間距介于約0.5口!11-1口111之間，介于約 1μ -2μπ 之間，介于約2μ -4μπ 之間，介于約4μ -6μπ 之間，介于約6μ -8μπ 之間，介于約8μ -10μπ 之間，介于約10μ -12μπ 之間，介于約12 μ m_14 μ m之間，介于約 14 μ m-16 μ m til]。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，任何突出物與其最近鄰?fù)怀鑫镏g的最大間隙的水平尺寸(d ；Y)介于約1. 0 μ m-6. 0 μ m之間。更優(yōu)選橫截面的橫截面徑約為1 μ m，且任何突出物與其最近鄰?fù)怀鑫镏g的最小間隙的水平尺寸(d ；Y)約為Ι.Ομπι。微米級(jí)特征的周期函數(shù)可具有沿一個(gè)方向的較小周期或具有在不同方向上的2、 3、10或以上因素的較大周期。生物相容性材料的表面上的任意一個(gè)微米級(jí)特征可定義為周期性周期結(jié)構(gòu)。因此，周期結(jié)構(gòu)某一特征的水平尺寸可定義為周期形狀/函數(shù)的周期，即所述結(jié)構(gòu)沿其重復(fù)其形狀的最短間距的長(zhǎng)度。
微米級(jí)特征的深度/高度，即其在從生物相容性材料的表面突出出來(lái)的方向上的線性尺寸可為納米或微米級(jí)，即結(jié)構(gòu)可具有范圍為Inm-IO μ m的高度/深度。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，形貌結(jié)構(gòu)的各個(gè)突出物的垂直高度/深度尺寸等于或大于1. 60 μ m,優(yōu)選約2. 4 μ m。任意一種微米級(jí)特征的橫向橫截面優(yōu)選為幾何形狀的，例如正方形、長(zhǎng)方形、六邊形、多邊形或星形。特征的頂面或側(cè)面優(yōu)選基本上是平整的。然而，微米級(jí)特征的表面還可包括納米級(jí)特征以在微米和納米兩種尺度上獲得形貌協(xié)同效應(yīng)。這可以通過(guò)例如化學(xué)浸蝕(例如通過(guò)NaOH或檸檬酸)、離子蝕刻、膠體蝕刻(例如通過(guò)聚苯乙烯珠、巴克球或蛋白質(zhì))、掠入射物理氣相沉積涂層、CVD涂層或等離子噴涂獲得。生物相容性材料的表面上的特征可具有相同或不同的形狀。優(yōu)選生物相容性材料的表面上的特征為幾何形狀(例如正方形、長(zhǎng)方形、六邊形、星形或多邊形)。在一些實(shí)施方案中，特征的橫截面形狀可從正方形、圓形等簡(jiǎn)單的幾何形狀得到， 通過(guò)例如修改正方形各個(gè)角。這類(lèi)修改的實(shí)例包括切掉和/或弄圓各個(gè)角。因此，這類(lèi)形狀一般是正方形、圓形等，但是它們稍稍偏離絕對(duì)的正方形或圓形形狀，從而引入另外的角和/或改變各邊在每個(gè)角相交的角度。一般來(lái)說(shuō)，二維周期結(jié)構(gòu)的定義可包括格子單位和位于格子單位中的重復(fù)單元， 所述格子單位在所述表面的平面上具有預(yù)定形狀(例如正方形、長(zhǎng)方形、六邊形等)；所述重復(fù)單元定義在格子單位中的詳細(xì)結(jié)構(gòu)(基礎(chǔ))，例如孔或突出物，例如正方形柱、多邊形柱、環(huán)形柱、棱錐體等。格子單位限定的位置定義了重復(fù)單元距離，而重復(fù)單元定義了預(yù)定的形狀和尺寸。這些格子單位位置可由相應(yīng)的二維向量界定。因此，網(wǎng)格結(jié)構(gòu)由格子單位沿表面界定的二維方向平移而形成，特別是相應(yīng)的多個(gè)格子單位尺寸。在一個(gè)實(shí)施方案中， 每個(gè)特征的中間位置可定義為向量v = nlVl+n2V2界定，其中V1和V2在表面上是線性獨(dú)立向量，H1和n2都為整數(shù)。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)特征的中心位于二維網(wǎng)格(例如具有預(yù)定網(wǎng)格常數(shù)的六邊形、長(zhǎng)方形或正方形網(wǎng)格)的格點(diǎn)上。在一些實(shí)施方案中，全部特征覆蓋這類(lèi)網(wǎng)格的全部格點(diǎn)，而在其它實(shí)施方案中，不是網(wǎng)格的全部格點(diǎn)都被覆蓋。例如，在一些實(shí)施方案中，在每隔一行的格點(diǎn)中，每隔一個(gè)格點(diǎn)可被特征覆蓋。在其它實(shí)施方案中，在每第二、第三、第四或更高次行中，每第二、第三、第四或更高次的格點(diǎn)留為空白。在一些實(shí)施方案中，形貌結(jié)構(gòu)可包括大量不同的特征，例如規(guī)則排列的多種不同的特征，例如周期性圖案，例如交替行排列的2個(gè)、3個(gè)或更多個(gè)不同特征。這類(lèi)圖案的實(shí)例包括包含以交替行排列的具有正方形橫截面的特征和具有圓形橫截面的特征的結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，特征排成行和/或排。在一些實(shí)施方案中，每行中的特征具有相同的間距，而在其它實(shí)施方案中，間距可在整個(gè)行中和/或在行與行間有所不同。同樣， 所有行的行與行間的距離可以相同，或行與行間有所不同。在一些實(shí)施方案中，某一行中的一些或所有結(jié)構(gòu)可相對(duì)于同一行中相應(yīng)的近鄰行結(jié)構(gòu)旋轉(zhuǎn)。在一些實(shí)施方案中，某一行中的一些或所有結(jié)構(gòu)可相對(duì)于其相鄰行中相應(yīng)的近鄰結(jié)構(gòu)旋轉(zhuǎn)。在一些實(shí)施方案中，在所有橫向方向上的特征的水平尺寸都介于Iym和約10 μ m 之間。這類(lèi)特征的實(shí)例包括具有大致為正方形或圓形橫截面的突出物。在其它實(shí)施方案中，
32在一個(gè)方向上的特征的水平尺寸介于Iym和約IOym之間，而在另一方向上的水平尺寸較大。這類(lèi)特征的實(shí)例包括長(zhǎng)形的脊、棱或孔。脊的側(cè)面基本上可以是平滑的，或者它們可包括其它的特征，例如規(guī)則順序排列的突出物和/或凹穴。因此，在一些實(shí)施方案中，這類(lèi)脊可具有類(lèi)似于一排正方形、圓形等的外觀，其與其相應(yīng)的鄰居會(huì)合/互相連接形成連續(xù)的脊。在一些實(shí)施方案中，形貌結(jié)構(gòu)特別包含在所有橫向方向上具有介于Iym和約 10 μ m的水平尺寸的特征和在僅一個(gè)方向上具有介于1 μ m和約10 μ m之間的水平尺寸的特征。這類(lèi)結(jié)構(gòu)的實(shí)例包括大致為正方形和/或圓形特征的行，其中各行被長(zhǎng)形脊分隔開(kāi)來(lái)。示形貌結(jié)構(gòu)實(shí)例的頂視圖，形貌結(jié)構(gòu)具有大致呈圓形、正方形或長(zhǎng)方形橫截面的突出物/柱的形式的特征。每個(gè)特征在至少一個(gè)方向上具有水平徑X，相鄰行和列中特征之間的間隙距離表示為Y。在圖8a、c、e、f和i中，Y等于任何特征與其最鄰近特征之間的間隙尺寸，相當(dāng)于間距X+Y。在圖^5b、d、g、h和j中，與最鄰近特征的間隙距離對(duì)于不同特征是不同的，以圖26b的特征1201、1202和1203為例說(shuō)明。特征1201以特征1202 為其最近鄰特征；因此間隙尺寸為Y。然而，特征1203以特征1201和1202為其最近鄰特征，具有稍稍不同的間隙尺寸d。因此，在圖8b、d、g、h和j中，行與行間的間距不同。在包括特征1201的行中，間距為X+Y，而在包括特征1203的行中的間距為2(X+Y)。在圖8的實(shí)例中，每個(gè)特征的中心位于網(wǎng)格常數(shù)為a和b的二維長(zhǎng)方形網(wǎng)格相應(yīng)的格點(diǎn)上，見(jiàn)圖8a和b。然而，在圖8a-e、h-i中，不是所有格點(diǎn)實(shí)際上都被特征覆蓋，而在圖8f和k中，所有格點(diǎn)都被特征覆蓋。在圖8a、c、e、f和i中，網(wǎng)格是網(wǎng)格常數(shù)為a = b =(X+Y)的正方形網(wǎng)格。在圖8b、d、g、h和j中，網(wǎng)格為長(zhǎng)方形，網(wǎng)格常數(shù)為a = X+Y，b = (X+Y)/2。在圖池中，網(wǎng)格常數(shù)為3 = 2乂^ = 3.5乂。對(duì)于選定的X值和Y值，按照?qǐng)D8a-h 制備了圓片，其中(X，Y) (μπι)選自(X，Y) = (1，1)、(1,2), (1,4), (1,6), (2，1)、(2,2), (2，4)、(2，6)、(4，1)、(4，2)、(4，4)、(4，6)、(6，1)、(6，2)、(6，4)、(6，6)。對(duì)于選定的 X 值和Y值，按照?qǐng)D池制備了圓片，其中X(ym)選自X= 1、2、3、4、5、6、7、8。因此，對(duì)于圖8a、 c、e、f和i的正方形網(wǎng)格，網(wǎng)格上的網(wǎng)格常數(shù)a禾Pb為a = b = 2-12 μ m。對(duì)于圖8b、d、g、 h和j的長(zhǎng)方形網(wǎng)格，方向a的網(wǎng)格常數(shù)的間距介于2-12 μπι之間，方向b的網(wǎng)格常數(shù)的間距介于1-6 μ m之間。對(duì)于圖8K的網(wǎng)格，網(wǎng)格常數(shù)b保持間距在3. 5- μπι之間，且網(wǎng)格常數(shù)a保持間距在2-16 μπι之間。為了鑒定上述結(jié)構(gòu)X和Y各自不同的值，將本說(shuō)明書(shū)圖8a所示結(jié)構(gòu)稱(chēng)為AX. Y，其中X和Y是指上述X和Y的尺寸。因此，結(jié)構(gòu)AX. Y包括具有直徑為X μ m的圓形橫截面的突出物/柱。突出物平行排列，其中每隔一行的相鄰?fù)怀鑫镩g的間隙尺寸為Y μπι，而其余行中突出物間的間隙尺寸為ΟΥ+Χ) μπι。相鄰行突出物之間的間隙尺寸為Y μ m0相鄰行中的突出物彼此排成一線。同樣，圖8b所示結(jié)構(gòu)稱(chēng)為BX. Y。因此，結(jié)構(gòu)BX. Y包括具有直徑為X μ m的圓形橫截面的突出物/柱。突出物平行排列，其中每隔一行的相鄰?fù)怀鑫镩g的間隙尺寸為Y μπι, 而其余行中突出物間的間隙尺寸為(2Υ+Χ) μπι。相鄰行突出物之間的間隙尺寸為Y μ m0間隙尺寸為ΟΥ+Χ) Pm的行中的突出物與其相應(yīng)的相鄰行突出物間的間隙中心排成一線。圖8c所示結(jié)構(gòu)稱(chēng)為CX. Y。因此，結(jié)構(gòu)CX. Y包括具有線性尺寸為X μ m的正方形
33橫截面的突出物/柱。突出物平行排列，其中正方形的各邊與行/列的方向一致，且其中每隔一行的相鄰?fù)怀鑫镩g的間隙尺寸為Y Pm,而其余行中突出物間的間隙尺寸為(2Y+X) μ m0相鄰行突出物之間的間隙尺寸為Y μ m0相鄰行中的突出物彼此排成一線。圖8d所示結(jié)構(gòu)稱(chēng)為DX. Y。因此，結(jié)構(gòu)DX. Y包括具有線性尺寸為X μ m的正方形橫截面的突出物/柱。突出物平行排列，其中正方形的各邊與行/列的方向一致，且其中每隔一行的相鄰?fù)怀鑫镩g的間隙尺寸為Y ym，而其余行中突出物間的間隙尺寸為(2Υ+Χ)μπι。 相鄰行突出物之間的間隙尺寸為γ μ m0間隙尺寸為ΟΥ+Χ) ym的行中的突出物與其相應(yīng)的相鄰行突出物間的間隙中心排成一線。圖8e所示結(jié)構(gòu)稱(chēng)為EX. Y。因此，結(jié)構(gòu)EX. Y包括具有直徑為X μ m的圓形橫截面的突出物/柱以及具有線性尺寸為X μm的正方形橫截面的突出物/柱。突出物交替平行排列，每隔一行為圓形突出物，正方形突出物位于其余行中。圓形突出物行中相鄰?fù)怀鑫镩g的間隙尺寸為Υμπι，而其余行中的正方形突出物間的間隙尺寸為(2Υ+Χ)μπι。相鄰行突出物之間的間隙尺寸為Y μ m0相鄰行中的突出物彼此排成一線。圖8f所示結(jié)構(gòu)稱(chēng)為FX. Y。因此，結(jié)構(gòu)FX. Y包括具有直徑為X μ m的圓形橫截面的突出物/柱以及具有線性尺寸為X μm的正方形橫截面的突出物/柱。突出物交替平行排列，每隔一行為圓形突出物，正方形突出物位于其余行中。各行內(nèi)突出物之間的間隙尺寸和相鄰行間的間隙尺寸為Y μ m0相鄰行中的突出物彼此排成一線。圖8g所示結(jié)構(gòu)稱(chēng)為GX. Y。因此，結(jié)構(gòu)GX. Y包括具有直徑為Χμ m的圓形橫截面的突出物/柱以及具有線性尺寸為X μm的正方形橫截面的突出物/柱。突出物交替地平行排列，每隔一行為圓形突出物，正方形突出物位于其余行中。圓形突出物行中相鄰?fù)怀鑫镩g的間隙尺寸為Yym，而其余行中的正方形突出物間的間隙尺寸為(2Υ+Χ)μπι。相鄰行突出物之間的間隙尺寸為Y μ Hi0間隙尺寸為ΟΥ+Χ) μ m的行中的正方形突出物與其相應(yīng)的相鄰行中的圓形突出物間的間隙中心排成一線。圖他所示結(jié)構(gòu)稱(chēng)為HX. Y。因此，結(jié)構(gòu)HX. Y包括具有直徑為Χμ m的圓形橫截面的突出物/柱以及具有線性尺寸為X μm的正方形橫截面的突出物/柱。突出物交替地平行排列，每隔一行為圓形突出物，正方形突出物位于其余行中。各行內(nèi)突出物之間和相鄰行間的間隙尺寸為Yym。相鄰行中的突出物彼此排成一線。正方形突出物與其相應(yīng)的相鄰行的圓形突出物之間的間隙中心排成一線。圖8i所示結(jié)構(gòu)稱(chēng)為IX. Y。因此，結(jié)構(gòu)IX. Y包括具有直徑為X μ m的圓形橫截面的突出物/柱以及具有線性尺寸為X μm的正方形橫截面的突出物/柱。突出物交替地平行排列，每隔一行為圓形突出物，正方形突出物位于其余行中。正方形突出物行中相鄰?fù)怀鑫镏g的間隙尺寸為Yym，而其余行中的圓形突出物之間的間隙尺寸為(2Υ+Χ)μπι。相鄰行突出物之間的間隙尺寸為γ μ m0相鄰行中的突出物彼此排成一線。圖8j所示結(jié)構(gòu)稱(chēng)為JX. Y。因此，結(jié)構(gòu)JX. Y包括具有直徑為X μ m的圓形橫截面的突出物/柱以及具有線性尺寸為X μm的正方形橫截面的突出物/柱。突出物交替地平行排列，每隔一行為圓形突出物，正方形突出物位于其余行中。正方形突出物行中相鄰?fù)怀鑫镏g的間隙尺寸為Y ym，而其余行中的圓形突出物之間的間隙尺寸為(2Y+X) μπι。相鄰行突出物之間的間隙尺寸為Y μ Hi0間隙尺寸為(2Υ+Χ) μπι的行中的圓形突出物與其相應(yīng)的相鄰行的正方形突出物之間的間隙中心排成一線。
34
因此，在上述實(shí)例中，最近鄰特征之間的最小間隙尺寸為Y ym，最近鄰特征之間最小中心-中心之間的距離為Χ+Υμ m。圖池所示結(jié)構(gòu)稱(chēng)為KX。結(jié)構(gòu)KX包含多組長(zhǎng)方形橫截面的長(zhǎng)形突出物/脊。脊具有不同的長(zhǎng)度，并彼此平行排列。每組的脊排列形成長(zhǎng)方形形狀，使得每組都包括最長(zhǎng)脊作為中脊。中脊的每側(cè)排列了隨距中脊的距離增加而逐漸變得更短的一系列脊。因此長(zhǎng)方形形狀的KX包括一連串的長(zhǎng)度為X μπκ2Χ μπκ3Χ μπκ4Χ μπκ3Χ μ 、2Χμπ 、Χ μ 的脊。脊寬為Χμπι。脊之間的距離為X ym。脊組以預(yù)定方式排列，使得脊沿行放置，其中每行包括兩個(gè)長(zhǎng)度交替的脊行的第一種類(lèi)型包括長(zhǎng)度為Xym和4X ym的交替脊。行的第二種類(lèi)型包括長(zhǎng)度為2X ym和3Χμπι的交替脊。脊的整體圖案類(lèi)似于鯊魚(yú)皮結(jié)構(gòu)。本發(fā)明最優(yōu)選的生物相容性表面的結(jié)構(gòu)的特征在于包含大量突出物排列在規(guī)則二維網(wǎng)格的格點(diǎn)上的納米和/或微米級(jí)形貌結(jié)構(gòu)，其中突出物具有最小橫截面徑為 Ι.Ομ m-2. Oym的橫截面，其中沿至少一維的相鄰格點(diǎn)之間的距離介于2. 0 μ m和9. 0 μ m 之間，其中形貌結(jié)構(gòu)的各個(gè)突出物的垂直高度/深度尺寸等于或大于1. 60 μ m，優(yōu)選約 2. 4 μ m0IV.包含本發(fā)明的生物相容性材料的植入物按照一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于骨組織植入等的醫(yī)學(xué)植入物，其中植入物表面的至少一部分的特征在于本發(fā)明的生物相容性材料，其表面的特征在于對(duì)成骨細(xì)胞有生物相容性的有界線的周期性微米級(jí)形貌結(jié)構(gòu)，在上面第II節(jié)和實(shí)施例中描述了其形貌結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的醫(yī)學(xué)植入物包括牙科植入物、矯形假體/植入物、脊柱植入物、骨替代物，其預(yù)期可用于治療骨折、退變性疾病、創(chuàng)傷和癌癥。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，植入物的整個(gè)暴露表面或用于制備植入物的生物相容性涂層材料由具有提高成骨細(xì)胞表達(dá)骨橋蛋白和骨鈣蛋白的形貌結(jié)構(gòu)的本發(fā)明的生物相容性材料組成。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，所述暴露表面的一個(gè)或多個(gè)部分由具有提高成骨細(xì)胞表達(dá)骨橋蛋白和骨鈣蛋白的形貌結(jié)構(gòu)的本發(fā)明的生物相容性材料組成。因此，它可通過(guò)選擇性地提供具有合適表面結(jié)構(gòu)的裝置而受控制，所述表面的組成部分應(yīng)以某種方式起作用(例如礦化)。在植入物將與交錯(cuò)型組織接觸的情況下，植入物的其它部分可由其它類(lèi)型的、可提高例如軟骨細(xì)胞(chrondrocytes)、上皮細(xì)胞的生物相容性的結(jié)構(gòu)制成。還可包括排斥細(xì)菌生長(zhǎng)的表面。例如牙科植入物應(yīng)予以考慮。這種植入物由5個(gè)不同的表面組成以滿足環(huán)境變化的需要1.成骨細(xì)胞中骨橋蛋白和骨鈣蛋白表達(dá)最佳，2.結(jié)締組織(成纖維細(xì)胞)的最佳生物相容性，3.上皮(上皮細(xì)胞)的最佳生物相容性，4.排斥細(xì)菌的表面，最后，5.植入人工牙的最佳表面。V.在成形的植入物3D表面上合成本發(fā)明的生物相容性形貌改進(jìn)表面的方法?？赏ㄟ^(guò)多種生產(chǎn)技術(shù)制備對(duì)成骨細(xì)胞有生物相容性并提高成骨細(xì)胞表達(dá)骨橋蛋白和骨鈣蛋白的植入物表面，例如以下一種或多種下列技術(shù)-印模壓印(Dieimprinting)通過(guò)使用硬質(zhì)模(例如SiC或SiN模)可在其它硬質(zhì)材料上直接產(chǎn)生圖案，像通過(guò)壓印的植入金屬。作為原版的印模，通常通過(guò)結(jié)合電子束蝕刻法和反應(yīng)性離子蝕刻法來(lái)制備。研究顯示，可將寬低至40nm的大批納米結(jié)構(gòu)印制在像鋁一樣的軟金屬上(S. W. Pang, Τ. Tamamura, Μ. Nakao, Α. Ozawa, H. Masuda, J. Vac. Sci. Technology B 16 (3) (1998) 1145)。更準(zhǔn)確地講，當(dāng)在像Al、Ti、鈦合金、不銹鋼、Ta等一樣的其它硬質(zhì)基底上壓印時(shí)，需要在像SiC或SiN —樣非常硬的材料上制成印模圖案，否則印模將受損，甚至遭破壞。印模壓印當(dāng)然還可用于像聚合物一樣較軟的材料。因?yàn)橄馭iC 或SiN—樣的材料難以干蝕刻，因此需要制備包含例如Cr而不僅僅是光致抗蝕劑的蝕刻掩模。掩模可按以下方式制備在耐蝕膜上經(jīng)電子束蝕刻然后顯影(通常在乙酸鹽等有機(jī)溶劑中)來(lái)產(chǎn)生橫向圖案。這使得耐蝕膜圖案留在表面上。耐蝕膜圖案用約IOOnm Cr層的 PVD沉積物覆蓋，并使用標(biāo)準(zhǔn)耐蝕膜脫膜劑溶解耐蝕膜而最終揭開(kāi)。硬質(zhì)印模材料的干蝕刻可以在反應(yīng)性離子蝕刻系統(tǒng)中進(jìn)行。結(jié)構(gòu)的厚度受離子蝕刻時(shí)間控制。Cr掩模最終可在硝酸鈰水溶液中去除。此時(shí)硬質(zhì)印模已準(zhǔn)備好在用于合成生物相容性形貌改進(jìn)表面的表面上壓印。印?？赏ㄟ^(guò)液壓壓制在表面的選定區(qū)域上，從而將微米圖案和納米圖案印在生物材料的選定區(qū)域上。施加的壓力通?？蔀閹坠珖嵆掷m(xù)10-30秒鐘?？赏ㄟ^(guò)使印模大小的區(qū)域連續(xù)圖案化來(lái)使若干區(qū)域圖案化。印模大小通常為10x10mm2直到40x40mm2。這種微米印刷和納米印刷方法非常適于在使用例如Ti、鈦合金、鉭或不銹鋼產(chǎn)生的成形3D植入物上的選定區(qū)域圖案化。當(dāng)然它還可用于不太硬的材料，如聚合材料/涂料。-通過(guò)滾動(dòng)印模壓印。該方法基本上與印模壓印相同，然而，這里的印模不是扁平的而通常是一個(gè)圓筒。這種印模滾筒是通過(guò)以上印模壓印中所述的光刻法或電子束蝕刻法 /反應(yīng)性離子蝕刻法進(jìn)行微米結(jié)構(gòu)化和納米結(jié)構(gòu)化的。考慮弧形表面，需要修改設(shè)置。此時(shí)可將滾筒印模通過(guò)液壓壓制在植入物的表面，而將印模滾筒壓在生物材料的選定區(qū)域并在上面滾動(dòng)，從而壓印出微米和/或納米結(jié)構(gòu)。植入物材料在此同樣像Ti、Ti-合金、鉭或不銹鋼一樣可以是硬質(zhì)的，但是并非必需如此，因此該方法也適于例如聚合物。-通過(guò)膠體蝕刻法圖案化在這里通過(guò)膠體微粒(例如聚苯乙烯或蛋白質(zhì)的鐵蛋白)沉積使表面納米圖案化是可行的，這類(lèi)似于近程有序圖案。這些微?？梢杂米骼缰苽渲奈g刻掩模、在表面上制備突出物的形貌模板或例如納米金屬簇的沉積(例如通過(guò)鐵蛋白的金屬中心)。-通過(guò)超短激光脈沖的激光圖案化該項(xiàng)技術(shù)可用于高精密圖案化。特別是燒蝕工藝強(qiáng)的非線性導(dǎo)致材料切除有界線清晰的閾值，并且這可用來(lái)證實(shí)甚至衍射極限以下的 g 豐勾的？ (P. P. Pronko, S. K. Dutta, J. Squier, J. V. Rudd, D. Du, G. Mourou =Optical Communicationl14, (1995)106)。-通過(guò)超短激光脈沖的激光圖案化還可與石英球的預(yù)沉積聯(lián)用(K.Vestentoft， J. A. Olesen,B. H. Christensen,P. Balling =Appl. Phys A80, (2005)493)來(lái)制備大陣列的納米孔。更準(zhǔn)確地講，將石英球?qū)映练e在表面上通常但并非一定產(chǎn)生密集的陣列。通過(guò)超短脈沖的未聚焦激光束掃描具有石英球的表面，有可能產(chǎn)生大面積的平行結(jié)構(gòu)，因?yàn)槭⑶蛴米骶劢辜す馐莫?dú)立透鏡。-激光掃描束干涉蝕刻法(InterferenceLithography)這種低成本方法可用于在大的表面面積上制備周期和準(zhǔn)周期及空間相干圖案。該方法利用兩個(gè)或更多個(gè)相干平面波陣面之間的干涉(S. Kuiper7H. van Wolferen7G. van Ri jn, Journal of Micromechanics and Microengineeringll(1), (2001)33)。VI.用于培養(yǎng)組織或細(xì)胞的包括具有微米級(jí)表面結(jié)構(gòu)的暴露表面的裝置圖9圖示具有微米級(jí)結(jié)構(gòu)暴露表面的組織培養(yǎng)皿的剖視示意圖。培養(yǎng)皿301包括具有底部303和側(cè)壁302的向上開(kāi)口的容器。在使用時(shí)，上表面304暴露于細(xì)胞培養(yǎng)物或組織，從而為培養(yǎng)物提供微環(huán)境。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，暴露表面304具有選定用以促進(jìn)本文所述的預(yù)定細(xì)胞功能的微米級(jí)形貌結(jié)構(gòu)?？捎靡韵禄衔锢缤ㄟ^(guò)熱壓印或通過(guò)注射成型，或者通過(guò)本領(lǐng)域已知的和/或本文所述的任何其它合適的方法由合適的印?；蛩{(lán)圖產(chǎn)生大量的這類(lèi)表面例如聚合物，如聚苯乙烯、不同類(lèi)型的聚己酸內(nèi)酯、聚甲基丙烯酸甲酯、 硅酮包括聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚(D，L-丙交酯-乙交酯共聚物)、聚乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯醇、透明質(zhì)酸型聚合物、聚環(huán)氧乙烷、聚對(duì)苯二甲酸丁二醇酯、甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿、mr-I T85、mr-I 7030、聚(雙(三氟乙氧基)磷腈、 天然聚合物包括修飾多糖(例如淀粉、纖維素和脫乙酰殼多糖)及上述化合物的混合物和共聚物。表面304可以是底部303的上表面或位于培養(yǎng)皿底部303上方的獨(dú)立組件(例如圓盤(pán))的上表面。表面304還可以單獨(dú)的組織培養(yǎng)塑料制品的形式提供，其經(jīng)過(guò)改進(jìn)以在表面上顯示特定的結(jié)構(gòu)或這些結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)圖。例如，單獨(dú)的組織培養(yǎng)塑料制品可以是可移動(dòng)地插入培養(yǎng)皿301中。在這方面，術(shù)語(yǔ)組織培養(yǎng)塑料制品是指包括可以用來(lái)制備可用于細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞的體外生長(zhǎng)的表面的任何聚合物/金屬涂料/材料。實(shí)施例1. 2包含169個(gè)測(cè)試區(qū)的13xl3BSSA圓片的制備厚度為525士25 μ m的單面拋光硅片G英寸)提供了用于生物相容性材料制備的底層。圓片為η型圓片，電阻系數(shù)為l-20ohm cm。按照下列方案，在SF6/02放電下，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)光刻法和反應(yīng)性離子蝕刻法將微米型圖案印制在硅片的拋光面上7.將圓片用氫氟酸緩沖液(BHF，BHF是濃HF (49% )、水和緩沖鹽、NH4F的溶液，比率約1 6 4)預(yù)蝕刻30秒鐘，然后在氮?dú)饬飨赂稍?，?.圓片然后用 1. 5μπι厚的光致抗蝕劑AZ5214(Hoechst Celanese Corporation, NJ，US，化學(xué)組成可參見(jiàn)由Hoechst Celanese Corporation提供的材料安全數(shù)據(jù)表(MSDS)) 層旋涂。于約90°C預(yù)烘干120秒鐘，和9.在AL6-2型EVC整直器中，將涂覆光致抗蝕劑的圓片通過(guò)合適的掩模暴露于紫外線5秒鐘，使之顯影50-60秒鐘，然后于120°C后烘1分鐘，和10.然后將涂覆光致抗蝕劑的圓片圖案化通過(guò)用BHF短暫蝕刻約30秒鐘，然后以約0. 30 μ m/分鐘的速度進(jìn)行反應(yīng)性離子蝕刻(RIE)，用丙酮脫去耐蝕膜接著進(jìn)行RCA清洗。RCA清洗過(guò)程相繼采用的三個(gè)主要步驟用5 1 IH2O H2O2 NH4OH溶液(SCl) 除去不溶性有機(jī)污染物。使用稀的50 IH2O HF溶液，除去由于(I)所致而可能蓄積的金屬污染物的薄的二氧化硅層。使用6 1 IH2O H2O2 HCl的溶液(SC2)除去離子和重金屬原子污染物。11.圖案化圓片然后與熱生長(zhǎng)于1000°C 15分鐘的20nm SiO2層一起通過(guò)干氧化而鈍化。12.通過(guò)濺射沉積將250nm鉭層沉積于圖案化圓片的表面。圖23B圖示一片制成圓片的頂視圖。按照實(shí)施例1. 2制備的圓片具有169個(gè)測(cè)試區(qū)，其中每個(gè)測(cè)試區(qū)具有11個(gè)不同的橫向形貌A-K之一，包含不同重復(fù)的突出部分，突出部分具有圓形、正方形或長(zhǎng)方形的橫截面形狀，如圖23A所示。圓片上形貌A-J的每一個(gè)用一系列的16個(gè)區(qū)域、具有不同尺寸組合的系列的各個(gè)成員表示(X)是每個(gè)突出部分的最小橫向橫截面尺寸，單位為ym;(Y)是突出部分之間的間隙，單位為ym。形貌K用8種不同重復(fù)的“鯊魚(yú)皮”結(jié)構(gòu)的水平尺寸表示，其中各個(gè)結(jié)構(gòu)之間的間隙為常數(shù)(Ιμπι)。形貌A-K 系列在圓片上的位置見(jiàn)圖23Β。圓片的中心區(qū)(圖23Β中的空白正方形)無(wú)結(jié)構(gòu)，提供對(duì)照區(qū)。按照這些規(guī)定參數(shù)制備一系列的圓片，其中橫向形貌的深度規(guī)定為0.60 μ m、l. 60 μ m 或 2· 40 μ m0 圖2 中，標(biāo)記每個(gè)測(cè)試區(qū)以表明其形貌表面結(jié)構(gòu)，對(duì)于形貌A，系列A-J的16個(gè)成員的尺寸說(shuō)明如下 “Al”形貌A，其中X =1 μ m, Y =1 μ m0
“A2”形貌A，其中X =1 μ m, Y =2 μ m0
“A3”形貌A，其中X =1 μ m, Y =4 μ m0
“A4”形貌A，其中X =1 μ m, Y =6 μ m0
“A5”形貌A，其中X =2ym, Y =1 μ m0
“A6”形貌A，其中X =2ym, Y =2 μ m0
“A7”形貌A，其中X =2μπι, Y =4 μ m0
“A8”形貌A，其中X =2μπι, Y =6 μ m0
“A9”形貌A，其中X =4μ m, Y =1 μ m0
“A10，’形貌A，其中X ==4μ m, Y ==2 μ m0
“All，’形貌A，其中X ==4μ m, Y ==4 μ m0
“A12，’形貌A，其中X ==4μ m, Y ==6 μ m0
“A13，’形貌A，其中X ==6 μ m, Y ==1 μ m。
“A14，’形貌A，其中X ==6 μ m, Y ==2 μ m0
“A15，’形貌A，其中X ==6 μ m, Y ==4 μ m0
“A16，’形貌A，其中X ==6 μ m, Y ==6 μ m0 系列K (鯊魚(yú)皮)的8個(gè)成員的T尺寸如下 “ΚΙ”形貌K，其中X =1μm,T =1 μ m
“Κ2”形貌K，其中X =1μm,T =2 μ m
“ΚΙ”形貌K，其中X =1μm,T =3 μ m
“ΚΙ”形貌K，其中X =1μm,T =4 μ m
“ΚΙ”形貌K，其中X =1μm,T =5 μ m
“ΚΙ”形貌K，其中X =1μm,T =6 μ m
“ΚΙ”形貌K，其中X =1μm,T =7 μ m
“ΚΓ，形貌K，其中X =1μm,T =8 μ m要了解的是，上述制備方法還可適用于具有其它形式和測(cè)試區(qū)尺寸以及其它結(jié)構(gòu)類(lèi)型的圓片(參見(jiàn)圖3-7)。同一制備方法可用于許多不同的圓片，其中測(cè)試區(qū)和特定表面結(jié)構(gòu)的布局由圓片所暴露的掩模決定。實(shí)施例2. 2篩選鑒定通過(guò)成骨細(xì)胞中骨橋蛋白和骨鈣蛋白的表達(dá)而促進(jìn)骨生成的生物相容性材料的BSSA圓片按照?qǐng)D23中的設(shè)置，將鼠成骨細(xì)胞(MC3T3-E1)接種在具有表面形貌庫(kù)的硅片上， 從其上鑒定出能夠通過(guò)成骨細(xì)胞表達(dá)骨橋蛋白和骨鈣蛋白而促進(jìn)骨生成的表面。
方法BSSA圓片結(jié)合實(shí)施例1. 2中所述，使用標(biāo)準(zhǔn)光刻法制備，并用鉭涂覆。成骨細(xì)胞細(xì)胞系、培養(yǎng)和接種方案在95%大氣和5% CO2的潮濕環(huán)境，將鼠成骨細(xì)胞(MC3T3-E1) (RIKEN 細(xì)胞庫(kù)；Tokio, Japan ；Sudo, H 等，1983，J Cell Biol96(l) 191-98)在無(wú)抗壞血酸但補(bǔ)充10%胎牛血清(Gibco)、100 μ /ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素(Gibco)的MemAlpha培養(yǎng)基(由Gibco hvitrogen提供)中于37°C維持，采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)每4天傳代。在細(xì)胞接種前，將圓片放入plO培養(yǎng)皿(Nunc)中，浸泡在70%乙醇中15分鐘滅菌，用無(wú)菌水漂洗兩次后，在無(wú)菌通風(fēng)櫥中干燥。MC3T3-E1細(xì)胞用胰蛋白酶消化，收獲，對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)定以1000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種在裝有圓片的培養(yǎng)皿中，對(duì)于細(xì)胞面積測(cè)定以6000個(gè)細(xì)胞/cm2或?qū)τ谏谴碳ひ?0，000個(gè)細(xì)胞/cm2接種在上述相同的培養(yǎng)基中。對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)定，將細(xì)胞固定并用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚[DAPI]染色或在4小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)和96小時(shí)后進(jìn)行免疫測(cè)定。DAPI是與DNA牢固結(jié)合的熒光染料，其可通過(guò)完整的細(xì)胞膜，因此可用來(lái)使活細(xì)胞和固定細(xì)胞染色。被DAPI染色的細(xì)胞用紫外線激活后通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)。當(dāng)DAPI與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)，其最大吸收位于358nm，其最大發(fā)射位于461nm，看上去為藍(lán)/青色。對(duì)于細(xì)胞面積測(cè)定，將細(xì)胞固定，24小時(shí)后進(jìn)行免疫測(cè)定。對(duì)于成骨刺激，3天后更換培養(yǎng)基為成骨培養(yǎng)基上述常用培養(yǎng)基補(bǔ)充了 50 μ g/ml抗壞血酸(Sigma)和IOmM β -甘油磷酸鹽(Sigma)。一周兩次更換成骨培養(yǎng)基直到在14天或21天固定和染色為止。免疫測(cè)定方案將細(xì)胞用磷酸緩沖鹽溶液(PBQ輕輕漂洗后，在4%低聚甲醛/PBS 中固定 15 分鐘。在 0. Triton X 100/PBS(T-PBS)中透化 10 分鐘后與 2% BSA/T-PBS 溫育2小時(shí)，使細(xì)胞與第一抗體反應(yīng)2小時(shí)。然后將細(xì)胞在T-PBS中洗滌3次，隨后加入第二抗體達(dá)1小時(shí)。同時(shí)加入DAPI (4,6- 二脒基-2-苯基吲哚)(Sigma)用于核染色和羅丹明標(biāo)記的鬼筆毒環(huán)肽(pl951Sigma)用于肌動(dòng)蛋白纖維染色。在T-PBS中洗滌3次后，將圓片用自動(dòng)熒光顯微鏡分析。用來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)的第一抗體包括二者以1 400于T-PBS稀釋的抗骨橋蛋白(AKM 2A1，鼠單克隆 IgG，Santa Cruz Biotechnology)、抗骨鈣蛋白(FL-95，兔多克隆 IgG,Santa Cruz Biotechnology)和以1 800于T-PBS稀釋的單克隆抗黏著斑蛋白(克隆hVIN-Ι鼠腹水液，Sigma)。第二抗體Alexa Flour 488-羊抗小鼠 IgG (1 400 于 T-PBS 中) (Molecular Probes, Invitrogen)和羅丹明(TRITC)綴合的驢抗兔(1 200) (Jackson ImmunoResearch)。體外礦化檢測(cè)方案在收獲細(xì)胞后或在免疫測(cè)定步驟后立即通過(guò)茜素紅染色定量圓片上的礦化/鈣沉積(以確保免疫染色的細(xì)胞與鈣沉積之間的精確相關(guān))。當(dāng)細(xì)胞立即用茜素紅染色后，細(xì)胞用冰冷的70%乙醇固定1小時(shí)，用ddH20洗滌兩次后加入40mM茜素紅溶液(Sigma A3757) 10分鐘。在ddH20中洗滌幾次后，將細(xì)胞在PBS 中溫育15分鐘，并在通風(fēng)櫥中風(fēng)干。分析染色區(qū)域，應(yīng)用Leica Qwin軟件，使用自動(dòng)熒光顯微鏡定量。當(dāng)在免疫測(cè)定后用茜素紅染色后，免疫染色的細(xì)胞用ddH20洗滌兩次后，加入茜素紅溶液。其它步驟同上。
39
結(jié)果A.通過(guò)成骨細(xì)胞促進(jìn)礦化的生物相容性表面形貌結(jié)構(gòu)的性質(zhì)將Mc3T3細(xì)胞接種在實(shí)施例1. 2和圖23定義的BSSA圓片上，并按上述設(shè)置生長(zhǎng)。 從圖23B-D可以觀察到，結(jié)構(gòu)的垂直尺寸(突出部分)對(duì)礦化具有作用，其中具有最高高度的結(jié)構(gòu)促進(jìn)最大程度的礦化Ζ = 2.4μπι>Ζ=1.6μπι>Ζ = 0.6μπι。在各個(gè)系列(A-J) 中沒(méi)有太大的差異，這就強(qiáng)調(diào)了結(jié)構(gòu)的形式和結(jié)構(gòu)之間是否有小的系統(tǒng)間隙在促進(jìn)礦化方面不太重要。合并具有相同X值和Y值的所有系列，可以從圖23D中觀察到具有較小X值和Y值的結(jié)構(gòu)促進(jìn)較多的礦化，因此對(duì)于所測(cè)試結(jié)構(gòu)的所有尺寸，1μπι>2μπι>4μπι> 6 μ m >>未結(jié)構(gòu)化表面。所有的鯊魚(yú)皮結(jié)構(gòu)具有1 μ m的間隙尺寸和不同T值的結(jié)構(gòu)尺寸， 其中一個(gè)橫截面徑的長(zhǎng)度總是為1 μ m，其它橫截面徑的長(zhǎng)度是可變的。所有鯊魚(yú)皮結(jié)構(gòu)以及系列A-J的最佳結(jié)構(gòu)都促進(jìn)礦化。注意，由系列A-J鑒定出來(lái)的尺寸中，1 μ m的間隙⑴ 和Iym結(jié)構(gòu)(X)的尺寸為礦化最佳尺寸。B.促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的生物相容性表面形貌的結(jié)構(gòu)性質(zhì)將Mc3T3細(xì)胞接種在實(shí)施例1. 2和圖23定義的BSSA圓片上，并按照上述設(shè)置生長(zhǎng)。在接種后4小時(shí)、M小時(shí)、48小時(shí)和96小時(shí)，通過(guò)計(jì)算DAPI染色的細(xì)胞的數(shù)目，計(jì)算出成骨細(xì)胞在BSSA圓片上的增殖。如圖M所示，細(xì)胞增殖隨突出部分高度而降低Z = 2. 4 μ m <z = 1.6 μ m，而突出部分的高度并不影響細(xì)胞與BSSA圓片表面附著的能力G小時(shí)的數(shù)據(jù))。對(duì)于X和Y尺寸，介于Iym和4μπι之間的間隙尺寸(Y)與X= Iym的結(jié)構(gòu)尺寸的組合導(dǎo)致增殖率最明顯的降低。因此，增加表面形貌高度(Z)對(duì)細(xì)胞增殖的負(fù)面作用與對(duì)礦化的積極作用負(fù)相關(guān)(圖23)。相比之下，鯊魚(yú)皮結(jié)構(gòu)高度的增加不會(huì)引起細(xì)胞增殖率降低。C.通過(guò)成骨細(xì)胞表達(dá)骨橋蛋白和骨鈣蛋白促進(jìn)骨生成的生物相容性表面形貌的結(jié)構(gòu)性質(zhì)將Mc3T3細(xì)胞接種在實(shí)施例1. 2定義的BSSA圓片上，垂直尺寸Z = 2. 4 μ m，誘導(dǎo)礦化2或3周。隨后將細(xì)胞固定，并對(duì)OPN(綠色)、OC(紅色)和DAPI (藍(lán)色)染色。在 OPN、OC和DAPI的熒光顯微術(shù)檢測(cè)后，圓片用茜草紅染色。在細(xì)胞接種后M小時(shí)，測(cè)定了平均細(xì)胞面積(圖25和圖27)。在成骨誘導(dǎo)2周(圖25和圖26)或3周(圖28)后測(cè)定了礦化。OPN和OC的誘導(dǎo)與礦化正相關(guān)，而礦化與細(xì)胞大小負(fù)相關(guān)(對(duì)于小的χ值X= 1 和X = 2)因此，BSSA圓片上的突出部分的X值和Y值越小，OPN和OC的誘導(dǎo)越大，礦化度越大，且細(xì)胞尺寸越??；因此對(duì)于礦化、OPN, 0C:lym> 2μπι> 4μπι> 6μπι>>未結(jié)構(gòu)化表面。對(duì)于較大的X值，觀察到隨Y值增加，細(xì)胞大小再次減小(例如6，6)。對(duì)于大的X 值和Y值，這種細(xì)胞大小的減小與礦化、OC和OPN無(wú)關(guān)聯(lián)。所有系列K鯊魚(yú)皮結(jié)構(gòu)均誘導(dǎo)礦化、OPN和OC的表達(dá)以及細(xì)胞大小至系列A-J的最佳結(jié)構(gòu)相同的程度。小結(jié)實(shí)施例對(duì)包含排列在規(guī)則二維網(wǎng)格格點(diǎn)上的大量突出物的BSSA結(jié)構(gòu)表面庫(kù)對(duì)成骨細(xì)胞性質(zhì)的影響提供了系統(tǒng)分析，所述二維網(wǎng)格包含突出物(X)的最小橫截面徑、最相鄰?fù)怀鑫?Y)之間的間隙和突出物高度(Z)的不同組合。數(shù)據(jù)表明，在誘導(dǎo)礦化方面，高度 2. 4μπι> 1.6μπι> 0. 6“111>平整未結(jié)構(gòu)化表面是較好的。這與增殖相關(guān)，其中2. 4 μ m < 1.6μπι<平整未結(jié)構(gòu)化表面。至于X值和Y值Χ值和Y值越小，OPN和OC的誘導(dǎo)越好，
40礦化越好，細(xì)胞越少和細(xì)胞尺寸越小；Ιμπ > 2μ > 4μ > 6μ >>未結(jié)構(gòu)化表面。所有鯊魚(yú)皮結(jié)構(gòu)均具有Iym的間隙尺寸(Y)和一側(cè)尺寸總為1 μ m，而另一側(cè)是可變的結(jié)構(gòu)尺寸(X)。礦化、OPN和OC的誘導(dǎo)、細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞大小與系列A-J的最佳結(jié)構(gòu)相似。綜合數(shù)據(jù)為以下發(fā)現(xiàn)提供了基礎(chǔ)，即特征在于包含排列在規(guī)則二維網(wǎng)格格點(diǎn)上的大量突出物的形貌結(jié)構(gòu)的生物相容性材料通過(guò)成骨細(xì)胞表達(dá)骨橋蛋白和骨鈣蛋白而特別促進(jìn)骨生成，其中突出物具有最小橫截面徑為ι. ο μ m-2. 0 μ m的橫截面，其中沿至少一維的相鄰格點(diǎn)之間的距離介于2. ομπι和8.0 μ m之間，其中形貌結(jié)構(gòu)的各個(gè)突出物的垂直高度/深度尺寸等于或大于1. 60 μ m,優(yōu)選約2. 4 μ m。實(shí)施例3. 2 異位成骨異位成骨可如下進(jìn)行分析將500，000個(gè)MC3T3-E1細(xì)胞/cm2在包含了添加的50 微克/ml抗壞血酸和IOmM β -甘油磷酸鹽的簡(jiǎn)單培養(yǎng)基中、在6mm χ 6mm生物相容性材料結(jié)構(gòu)(例如K系列1-8中的任一種)上培養(yǎng)。培養(yǎng)一周后，將生物相容性材料結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到小鼠模型皮下用于異位成骨。在小鼠背側(cè)制備兩個(gè)皮下袋狀皮摺。手術(shù)期間，將動(dòng)物用異氟烷麻醉，將一個(gè)結(jié)構(gòu)放入一個(gè)袋狀皮摺中，用外科縫線縫合。小鼠留置8周后，通過(guò)頸椎脫位法處死。取出結(jié)構(gòu)，塑料包埋在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)中，切片，染色用于骨檢測(cè)(例如堿性復(fù)紅/亮綠或茜素紅S)。實(shí)施例4. 2.綿羊成骨試驗(yàn)下述體內(nèi)綿羊模型可用來(lái)測(cè)定生物相容性材料誘導(dǎo)骨生成/骨長(zhǎng)入的能力在6mm χ 6mm硅片正方形的基底上制備相關(guān)生物相容性材料的樣品和對(duì)照，例如平整的鉭。樣品分別稱(chēng)為“活性物”和“對(duì)照”，并成對(duì)使用以減小由動(dòng)物變化引起的結(jié)果變動(dòng)。用生物相容性膠水(例如Loctite 431)將樣品粘合在樣品架上，制成植入物。用于綿羊成骨試驗(yàn)的樣品架見(jiàn)圖四。具體地講，圖^a圖示樣品架的底視圖，圖 28b圖示樣品架的側(cè)視圖，圖^c圖示樣品架的頂視圖，圖^d圖示樣品架的透視圖，圖^e 圖示樣品架的剖視圖。樣品架包含正方形凹穴1501，適于接受將要暴露其生物相容性表面的樣品。正方形凹穴位于圓柱狀部分1502的底面。在頂面上，樣品架包括螺紋孔1503，有利于在骨中/從骨中放置和取出樣品架。手術(shù)前，給予綿羊2.5ml Rompun vet和2ml阿托品。20分鐘后，用15ml異丙酚使動(dòng)物麻醉。在每個(gè)內(nèi)股骨髁中鉆一個(gè)深度6mm，直徑Ilmm的孔。這在生物相容性表面和骨之間留下0. 5mm間隙用于研究骨長(zhǎng)入。將植入物壓配合至孔中，切口用外科縫合線縫合。 綿羊留置4周后處死。取出植入物，包埋在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)中。最初用μ CT掃描檢查骨長(zhǎng)入程度，隨后切割，對(duì)朝向植入物的骨容積和骨長(zhǎng)入進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)檢查。
4權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞或組織培養(yǎng)容器用于促進(jìn)未分化多能哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)的用途，所述容器具有在使用期間暴露于培養(yǎng)物的表面，其中至少部分所述表面為生物相容性材料， 其中至少部分所述生物相容性材料的暴露表面具有納米和/或微米級(jí)形貌結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)包含排列在規(guī)則二維網(wǎng)格格點(diǎn)上的大量突出物，其特征在于所述突出物的橫截面積等于或小于該結(jié)構(gòu)總面積的25%，所述結(jié)構(gòu)面積以所述結(jié)構(gòu)暴露表面的平面測(cè)得，且其中突出物的密度等于或大于1個(gè)突出物/65 μ m2，且其中所述形貌結(jié)構(gòu)的每個(gè)突出物的垂直高度/深度等于或大于1. 6 μ m或3. 0 μ m，優(yōu)選介于2. 0 μ m-3. Oym之間，更優(yōu)選2. 4 μ m。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述突出物具有橫截面，且最小橫截面徑介于0.1 μ m和 4.0μπι之間，且其中任何突出物與其最近鄰?fù)怀鑫镏g的間隙的水平尺寸(d ；Y)介于約 0. 5 μ m-8. Ομπι 之間。
3.權(quán)利要求2的用途，其中所述橫截面徑介于0.5 μ m和1. 5 μ m之間，且任何突出物與其最近鄰?fù)怀鑫镏g的最大間隙的水平尺寸(d ；Y)介于約1μπ -4μπ 之間。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的用途，其中沿至少一維的相鄰格點(diǎn)之間的最小距離小于 8. 0 μ m，優(yōu)選介于0. 5 μ m和6. 0 μ m之間。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的用途，其中所述結(jié)構(gòu)包括具有相同的橫截面幾何形狀或至少兩種不同的橫截面幾何形狀的突出物。
6.權(quán)利要求5的用途，其中所述不同橫截面幾何形狀的突出物以交替方式排列在規(guī)則二維網(wǎng)格上。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的用途，其中所述結(jié)構(gòu)包括不同橫截面積的突出物。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的用途，其中所述突出物的橫向截面具有由周緣定義的形狀和/或選自以下的幾何形狀環(huán)形、凹形、凸形、圓形、星形、正方形、長(zhǎng)方形、六邊形和多邊形或其組合。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的用途，其中所述表面的至少一部分用選自鉭、鈦、鉬或其氧化物的物質(zhì)涂覆。
10.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的用途，其中所述表面的至少一部分包含選自以下的聚合物聚苯乙烯、聚己酸內(nèi)酯聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、脫乙酰殼多糖或其組合。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的用途，其還包括選自以下的化合物多肽、碳水化合物、 脂質(zhì)、生長(zhǎng)激素、抗體、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、多糖、脂質(zhì)、有機(jī)化合物和無(wú)機(jī)化合物，其中所述化合物吸附在容器的暴露表面上或以化學(xué)方式與容器的暴露表面連接。
12.權(quán)利要求11的用途，其中所述生長(zhǎng)激素選自BMP、EGF樣、TGF-β、IGF和LIF。
13.權(quán)利要求1-12的用途，其中所述細(xì)胞或組織培養(yǎng)容器通過(guò)例如納米晶金剛石、等離子體聚合、氧等離子體或氮等離子體進(jìn)行化學(xué)官能化。
14.一種用于制備細(xì)胞或組織培養(yǎng)容器的印?；蜓谀?，所述容器至少部分由生物相容性材料制備，所述印?；蜓谀＿m于將按照權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)限定的形貌表面結(jié)構(gòu)印壓入或提供給所述生物相容性材料的表面。
15.一種用于促進(jìn)未分化的多能哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞或組織培養(yǎng)容器，所述容器具有在使用期間暴露于培養(yǎng)物的表面，其中至少部分所述表面為生物相容性材料， 其中至少部分生物相容性材料的暴露表面具有納米和/或微米級(jí)形貌結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)包含排列在規(guī)則二維網(wǎng)格格點(diǎn)上的大量突出物，其特征在于所述突出物的橫截面積等于或小于該結(jié)構(gòu)總面積的25%，所述面積以該結(jié)構(gòu)暴露表面的平面測(cè)量，且其中所述突出物的密度等于或大于1個(gè)突出物/65 μ m2，且其中所述形貌結(jié)構(gòu)的每個(gè)突出物的垂直高度/深度尺寸約為 2. 4μπι。
16.一種促進(jìn)未分化的多能胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，所述方法包括使細(xì)胞與具有暴露于干細(xì)胞的表面的細(xì)胞或組織培養(yǎng)容器接觸，其中至少部分所述表面為生物相容性材料， 其中至少部分所述生物相容性材料的暴露表面具有納米和/或微米級(jí)形貌結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)包含排列在規(guī)則二維網(wǎng)格格點(diǎn)上的大量突出物，其中選擇所述結(jié)構(gòu)以促進(jìn)未分化的哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞的生長(zhǎng)，其特征在于所述突出物的橫截面積等于或小于該結(jié)構(gòu)總面積的25%，所述面積以該結(jié)構(gòu)暴露表面的平面測(cè)量，且其中所述突出物的密度等于或大于1 個(gè)突出物/65 μ m2，且其中所述形貌結(jié)構(gòu)的每個(gè)突出物的垂直高度/深度尺寸等于或大于 1. 6μπι或 3. Ομ ，優(yōu)選介于 2. 0μπι-3. Ομ 之間，更優(yōu)選 2. 4 μ m。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述突出物具有橫截面，且最小橫截面徑介于0.1 μ m和 4.0μπι之間，且其中任何突出物與其最近鄰?fù)怀鑫镏g的間隙的水平尺寸(d;Y)介于約 0. 5 μ m-8. 0 μ m 之間。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述橫截面徑介于0.5 μ m和1. 5 μ m之間，且任何突出物與其最近鄰?fù)怀鑫镏g的最大間隙的水平尺寸(d ；Y)介于約1μπι-4μπι之間。
19.權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)的方法，其中沿至少一維的相鄰格點(diǎn)之間的最小距離小于8. 0 μ m，優(yōu)選介于0. 5 μ m和6. 0 μ m之間。
20.權(quán)利要求16-19中任一項(xiàng)的方法，其中所述結(jié)構(gòu)包括至少兩種不同的橫截面幾何形狀的突出物。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述不同橫截面幾何形狀的突出物以交替方式排列在規(guī)則二維網(wǎng)格上。
22.權(quán)利要求16-21中任一項(xiàng)的方法，其中所述結(jié)構(gòu)包括不同橫截面積的突出物。
23.權(quán)利要求16-22中任一項(xiàng)的方法，其中一種或多種特征的橫向截面具有由周緣定義的形狀和/或選自以下的幾何形狀環(huán)形、圓形、星形、正方形、長(zhǎng)方形、六邊形和多邊形或其組合。
24.權(quán)利要求16-23中任一項(xiàng)的方法，其中所述表面的至少一部分是涂鉭的和/或涂鈦的表面。
25.權(quán)利要求16-23中任一項(xiàng)的方法，其中所述表面的至少一部分由聚合物組成，所述聚合物包括聚苯乙烯、聚己酸內(nèi)酯聚乳酸或脫乙酰殼多糖。
26.權(quán)利要求16-25中任一項(xiàng)的方法，其還包括選自以下的化合物多肽、碳水化合物、 脂質(zhì)、生長(zhǎng)激素、抗體、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、多糖、脂質(zhì)、有機(jī)化合物和無(wú)機(jī)化合物，其中所述化合物吸附在容器的表面層上或者與容器的表面層化學(xué)連接、固定化或絡(luò)合。
27.權(quán)利要求沈的方法，其中所述生長(zhǎng)激素選自BMP、EGF樣、TGF-β、IGF和白血病抑制因子或其組合。
28.權(quán)利要求14-27的方法，其中所述細(xì)胞或組織培養(yǎng)容器通過(guò)例如納米晶金剛石、等離子體聚合、氧等離子體或氮等離子體進(jìn)行化學(xué)官能化。
29.權(quán)利要求16的方法，其中所述細(xì)胞表達(dá)選自0ct4、NanOg、SSEA3/4和S0X2的多能性標(biāo)志物。
30.一種細(xì)胞或組織培養(yǎng)容器用于促進(jìn)哺乳動(dòng)物干細(xì)胞均一分化性生長(zhǎng)的用途，所述容器具有在使用期間暴露于培養(yǎng)物的表面，其中至少部分所述表面為生物相容性材料，其中至少部分所述生物相容性材料的暴露表面具有納米和/或微米級(jí)形貌結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)包含排列在規(guī)則二維網(wǎng)格格點(diǎn)上的大量突出物，其特征在于所述突出物具有橫截面，且橫截面徑介于1.0 μ m-8.0 μ m之間，且其中任何突出物與其最近鄰?fù)怀鑫镏g的最大間隙的水平尺寸(d;Y)介于1.0μπι-2.0μπι之間，且其中所述形貌結(jié)構(gòu)的每個(gè)突出物的垂直高度/ 深度尺寸等于或小于1. O μ m，優(yōu)選介于0. 6 μ m-1. Oym之間，更優(yōu)選約0. 6 μ m。
31.權(quán)利要求30的用途，其中所述一個(gè)或多個(gè)突出部分的橫向截面具有由周緣定義的形狀和/或選自以下的幾何形狀環(huán)形、圓形、星形、正方形、長(zhǎng)方形、六邊形和多邊形或其組合。
32.權(quán)利要求31的用途，其中所述結(jié)構(gòu)包括具有正方形橫向截面的突出部分和具有長(zhǎng)方形橫向截面的突出部分，其中所述突出部分的第一橫截面徑為Ι.Ομπ ，所述突出部分的第二橫截面徑介于ι. ο μ m-8. 0 μ m之間，優(yōu)選介于1. 0 μ m-6. 0 μ m之間，且其中所述突出部分的垂直高度/深度尺寸等于或小于ι. ο μ m，優(yōu)選介于0. 6 μ m-1. 0 μ m之間，更優(yōu)選約0.6 μ m0
33.權(quán)利要求30-32中任一項(xiàng)的用途，其中所述表面的至少一部分是涂鉭的和/或涂鈦的表面。
34.權(quán)利要求30-33中任一項(xiàng)的用途，其中所述表面的至少一部分由聚合物組成，所述聚合物包括聚苯乙烯、聚己酸內(nèi)酯聚乳酸或脫乙酰殼多糖。
35.權(quán)利要求30-34中任一項(xiàng)的用途，其還包括選自以下的化合物多肽、碳水化合物、 脂質(zhì)、生長(zhǎng)激素、抗體、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、多糖、脂質(zhì)、有機(jī)化合物和無(wú)機(jī)化合物，其中所述化合物吸附在容器的暴露表面上。
36.一種促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞均一分化性生長(zhǎng)的方法，所述方法包括使細(xì)胞與具有暴露于干細(xì)胞的表面的細(xì)胞或組織培養(yǎng)容器接觸，其中至少部分所述表面為生物相容性材料， 其中至少部分所述生物相容性材料的暴露表面具有納米和/或微米級(jí)形貌結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)包含排列在規(guī)則二維網(wǎng)格格點(diǎn)上的大量突出物，其特征在于所述突出物具有橫截面和介于1.0 μ m-8. 0 μ m之間的橫截面徑，且其中任何突出物與其最近鄰?fù)怀鑫镏g的最大間隙的水平尺寸(d ；Y)介于1.0 μ m-2.0 μ m之間，且其中每個(gè)突出物的垂直高度/深度尺寸等于或小于1. 0 μ m，優(yōu)選介于0. 6 μ m-1. Oym之間，更優(yōu)選約0. 6 μ m。
37.權(quán)利要求36的方法，其中一個(gè)或多個(gè)突出部分的橫向截面具有由周緣定義的形狀和/或選自以下的幾何形狀環(huán)形、圓形、星形、正方形、長(zhǎng)方形、六邊形和多邊形或其組合。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述結(jié)構(gòu)包括具有正方形橫向截面的突出部分和具有長(zhǎng)方形橫向截面的突出部分，其中所述突出部分的第一橫截面徑為Ι.Ομπι，而所述突出部分的第二橫截面徑介于ι. ο μ m-8. 0 μ m之間，優(yōu)選介于1. 0 μ m-6. 0 μ m之間，且其中所述突出部分的垂直高度/深度尺寸等于或小于ι. ο μ m，優(yōu)選介于0. 6 μ m-1. 0 μ m之間，更優(yōu)選約 0. 6 μ m0
39.權(quán)利要求36-38中任一項(xiàng)的方法，其中所述表面的至少一部分是涂鉭和/或涂鈦的表面。
40.權(quán)利要求36-39中任一項(xiàng)的方法，其中所述表面的至少一部分由聚合物組成，所述聚合物包括聚苯乙烯、聚己酸內(nèi)酯聚乳酸或脫乙酰殼多糖。
41.權(quán)利要求36-40中任一項(xiàng)的方法，其還包括選自以下的化合物多肽、碳水化合物、 脂質(zhì)、生長(zhǎng)激素、抗體、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、多糖、脂質(zhì)、有機(jī)化合物和無(wú)機(jī)化合物，其中所述化合物吸附在容器的暴露表面上。
42.權(quán)利要求30-41中任一項(xiàng)的用途或方法，其中所述干細(xì)胞選自胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞。
43.一種用于骨組織植入的醫(yī)學(xué)植入物，所述醫(yī)學(xué)植入物包含表面，其中至少部分所述表面為生物相容性材料，其中所述生物相容性材料的表面的至少一部分的特征在于包含排列在規(guī)則二維網(wǎng)格格點(diǎn)上的大量突出物的納米和/或微米級(jí)形貌結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)能夠通過(guò)在成骨細(xì)胞中表達(dá)骨橋蛋白和骨鈣蛋白而促進(jìn)骨生成，其中所述突出物具有最小橫截面徑為1. 0 μ m-2. 0 μ m的橫截面，其中沿至少一維的相鄰格點(diǎn)之間的距離介于2. 0 μ m和 9. 0 μ m之間，其中所述形貌結(jié)構(gòu)的各個(gè)突出物的垂直高度/深度尺寸等于或大于1. 60 μ m, 優(yōu)選約2. 4 μ m。
44.權(quán)利要求43的醫(yī)學(xué)植入物，其中任何突出物與其最近鄰?fù)怀鑫镏g的最大間隙的水平尺寸(d ；Y)介于約1. 0μπι-6. Oym之間。
45.權(quán)利要求43或44的醫(yī)學(xué)植入物，其中所述橫截面的橫截面徑約為1μ m,且任何突出物與其最近鄰?fù)怀鑫镏g的最小間隙的水平尺寸(d ；Y)約為Ι.Ομπι。
46.權(quán)利要求43-45中任一項(xiàng)的醫(yī)學(xué)植入物，其中所述結(jié)構(gòu)包括至少兩種不同的橫截面幾何形狀的突出物。
47.權(quán)利要求46的醫(yī)學(xué)植入物，其中不同橫截面幾何形狀的突出物以交替方式排列在規(guī)則的二維網(wǎng)格上。
48.權(quán)利要求43-47中任一項(xiàng)的醫(yī)學(xué)植入物，其中所述結(jié)構(gòu)包括不同橫截面積的突出物。
49.權(quán)利要求43-48中任一項(xiàng)的醫(yī)學(xué)植入物，其中所述突出物位于二維規(guī)則網(wǎng)格的格點(diǎn)上使得只有子集部分格點(diǎn)上覆蓋有突出物。
50.權(quán)利要求43-49中任一項(xiàng)的醫(yī)學(xué)植入物，其中所述突出物平行排列，其中在相鄰排中，相鄰?fù)怀鑫镏g中心至中心的距離不同。
51.權(quán)利要求43-50中任一項(xiàng)的醫(yī)學(xué)植入物，其中一種或多種突出物的橫向截面具有由周緣定義的形狀和/或選自以下的幾何形狀環(huán)形、凹形、凸形、圓形、正方形和長(zhǎng)方形或其組合。
52.權(quán)利要求43-51中任一項(xiàng)的醫(yī)學(xué)植入物，其中所述周期性形貌結(jié)構(gòu)的特征中心位于網(wǎng)格常數(shù)為a和b的二維長(zhǎng)方形網(wǎng)格的格點(diǎn)上，且其中a.網(wǎng)格為正方形網(wǎng)格，其中每個(gè)方向的網(wǎng)格常數(shù)(a= b)的間距介于2_8μπι之間，或b.網(wǎng)格為長(zhǎng)方形，其中第一方向的網(wǎng)格常數(shù)(a)的間距介于2_8μπι之間，第二方向的網(wǎng)格常數(shù)(b)的間距介于1_4μπι之間。
53.權(quán)利要求43-52中任一項(xiàng)的醫(yī)學(xué)植入物，其中所述表面的至少一部分是涂鉭和/或涂鈦或其任何氧化物的表面。
54.權(quán)利要求43-52中任一項(xiàng)的醫(yī)學(xué)植入物，其中所述表面的至少一部分由像聚乳酸或聚乳酸-羥基乙酸共聚物一樣的生物可降解聚合物組成。
55.權(quán)利要求43-54中任一項(xiàng)的醫(yī)學(xué)植入物，其還包含選自以下的吸附的化合物多肽、碳水化合物、脂質(zhì)、生長(zhǎng)激素、抗體、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、多糖、脂質(zhì)、有機(jī)化合物和無(wú)機(jī)化合物。
56.權(quán)利要求55的醫(yī)學(xué)植入物，其中所述生長(zhǎng)激素選自BMP、EGF樣、TGF-β、IGF。
57.權(quán)利要求43-56中任一項(xiàng)的醫(yī)學(xué)植入物，其中所述植入物是牙科植入物。
58.權(quán)利要求43-56中任一項(xiàng)的醫(yī)學(xué)植入物，其中所述植入物是矯形植入物。
59.權(quán)利要求43-58中任一項(xiàng)的醫(yī)學(xué)植入物，其用于人或動(dòng)物的外科治療。
60.權(quán)利要求56的醫(yī)學(xué)植入物，其用于治療人或動(dòng)物的牙科疾病。
61.一種用于制備醫(yī)療裝置的印?；蜓谀＃鲠t(yī)療裝置至少部分由生物相容性材料制備，所述印?；蜓谀＿m于將權(quán)利要求43-60中任一項(xiàng)限定的形貌表面結(jié)構(gòu)印壓入或提供給所述生物相容性材料的表面。
62.權(quán)利要求43-60中任一項(xiàng)的醫(yī)學(xué)植入物的用途，其用于治療人或動(dòng)物的矯形病癥。
63.一種細(xì)胞或組織培養(yǎng)容器用于促進(jìn)分化細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)期間的基因表達(dá)的用途， 所述容器具有在使用期間暴露于細(xì)胞培養(yǎng)物的表面，其中至少部分所述表面為生物相容性材料，其中所述生物相容性材料包含權(quán)利要求43-60中任一項(xiàng)的生物相容性材料。
64.一種用于制備醫(yī)學(xué)植入物的生物相容性涂層材料，其中所述生物相容性涂層材料包含權(quán)利要求43-60中任一項(xiàng)的生物相容性材料。
65.權(quán)利要求64的生物相容性涂層材料，其中所述醫(yī)學(xué)植入物與成骨細(xì)胞具有生物相容性。
66.一種通過(guò)在成骨細(xì)胞中表達(dá)骨橋蛋白和骨鈣蛋白而促進(jìn)骨生成的方法，所述方法包括使細(xì)胞與生物相容性材料接觸，其中所述生物相容性材料的表面的至少一部分的特征在于納米和/或微米級(jí)形貌結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)包含排列在規(guī)則二維網(wǎng)格的格點(diǎn)上的大量突出物，其中所述突出物具有最小橫截面徑為ι. ο μ m-2. 0 μ m的橫截面，其中沿至少一維的相鄰格點(diǎn)之間的距離介于2. 0 μ m和8. 0 μ m之間，其中所述形貌結(jié)構(gòu)的各個(gè)突出物的垂直高度/深度尺寸等于或大于1. 60 μ m,優(yōu)選約2. 4 μ m。
全文摘要
本發(fā)明提供一種生物相容性材料，其中生物相容性材料表面的至少一部分的特征在于包含大量特征的微米或納米級(jí)形貌結(jié)構(gòu)，其中選擇所述結(jié)構(gòu)來(lái)促進(jìn)未分化的多能干細(xì)胞生長(zhǎng)或用來(lái)促進(jìn)干細(xì)胞的均一分化性生長(zhǎng)。此外，提供具有影響細(xì)胞功能，特別是與體內(nèi)和離體基因誘導(dǎo)、細(xì)胞分化和骨組織形成有關(guān)的細(xì)胞功能的表面結(jié)構(gòu)和組成成分的生物相容性材料。
文檔編號(hào)C12N5/00GK102232109SQ200980130625
公開(kāi)日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2009年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月27日
發(fā)明者A·C·富希特鮑爾, E·M·富希特鮑爾, F·S·佩德森, F·貝森巴切爾, J·洛夫曼德, L·馬克特, M·R·杜克, M·福斯 申請(qǐng)人:奧爾胡斯大學(xué)