專利名稱：用于電化學(xué)鑒定靶核苷酸序列的方法
用于電化學(xué)鑒定靶核苷酸序列的方法本發(fā)明涉及用于電化學(xué)鑒定靶核苷酸序列的方法和組件(assembly)。預(yù)想的一個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域具體為可包含細(xì)菌或病毒，和更通常地，任何核酸的生物學(xué) 樣本的快速分析。已知的電化學(xué)檢測(cè)方法已使證明靶核酸序列稱為可能。有人使用核酸擴(kuò)增方法， 例如PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))類型的方法，和循環(huán)伏安方法。根據(jù)這些方法中的一種，提供 包含核酸的生物學(xué)樣本，所述核酸顯示預(yù)定的靶核苷酸序列，并向生物學(xué)樣本加入能氧化 靶序列中至少一個(gè)核苷酸堿基的氧化劑。擴(kuò)增裝置包含包括可氧化核苷酸堿基的核苷酸類 型，和當(dāng)然意圖在執(zhí)行擴(kuò)增方法的過(guò)程中被消耗的核苷酸，從而產(chǎn)生復(fù)制的核酸序列。同 時(shí)，或者在每個(gè)擴(kuò)增步驟后，對(duì)樣本施加電場(chǎng)，使氧化劑與可氧化核苷酸堿基反應(yīng)，并測(cè)量 因此通過(guò)樣本的電流。根據(jù)這種方法(文件PCT/FR2007/000373中有更具體的描述)當(dāng)電 流隨著擴(kuò)增的過(guò)程而降低時(shí)，確定存在預(yù)定的靶序列及其初始量。這是因?yàn)?，在擴(kuò)增過(guò)程 中，擴(kuò)增裝置的游離核苷酸的數(shù)目由于并入合成的核酸中而降低。然后氧化劑只與越來(lái)越 有限量的游離核苷酸反應(yīng)。因此，由于氧化反應(yīng)的發(fā)生，電子傳遞越來(lái)越少，并且電流下降。因此，這種方法使得在任何生物學(xué)樣本中快速檢測(cè)和定量給定核酸的存在成為可 能。出現(xiàn)的并且本發(fā)明旨在解決的問(wèn)題不僅在于提供另一種電化學(xué)檢測(cè)方法，其使得 在生物學(xué)樣本中檢測(cè)靶核苷酸序列的存在成為可能，而且在于能鑒定其性質(zhì)并將其定量。為了解決這個(gè)問(wèn)題，根據(jù)第一方面，本發(fā)明提出用于電化學(xué)鑒定靶核苷酸序列的 方法。所述方法是根據(jù)如下類型(said method is of the type accoding towhich)提 供可包含的預(yù)定的靶核苷酸序列生物學(xué)樣本，作為可激活擴(kuò)增裝置包含游離核苷酸以引起 所述預(yù)定的靶核苷酸序列的復(fù)制，和形成復(fù)制的靶核苷酸序列。根據(jù)本方法，還提供能與所 述核苷酸反應(yīng)的可氧化還原的化合物，并使所述可氧化還原的化合物與所述生物學(xué)樣本接 觸。然后激活所述可激活的擴(kuò)增裝置，并對(duì)所述樣本施加電場(chǎng)以激活所述可氧化還原的化 合物，并測(cè)量通過(guò)所述樣本的代表所述可氧化還原的化合物的電化學(xué)活性的電流。因此，如 果電流下降則確定存在所述預(yù)定的靶核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明，提供能在復(fù)制過(guò)程中插入 形成所述復(fù)制的靶序列的核苷酸之間的可氧化還原的化合物，所述復(fù)制的靶序列引起所述 插入的可氧化還原的化合物的電化學(xué)活性的抑制，電流因此下降。除了游離核苷酸，可激活擴(kuò)增裝置包括引物，其為對(duì)于待檢測(cè)的靶核苷酸序列有 特異性或互補(bǔ)的寡核苷酸，和聚合酶。此外，如后文將詳細(xì)解釋的，通過(guò)使電極接觸所述樣 本和通過(guò)在這些電極之間施加電勢(shì)差而對(duì)所述樣本施加電場(chǎng)。因此，本發(fā)明的一個(gè)特點(diǎn)是提供不會(huì)氧化樣本中游離核苷酸的核苷酸堿基的可氧 化還原的化合物，如同上述現(xiàn)有技術(shù)文件中的情況，但是其將插入形成復(fù)制的靶序列的核 苷酸之間。優(yōu)選地，根據(jù)連續(xù)的擴(kuò)增循環(huán)激活所述可激活的擴(kuò)增裝置和，在每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，將 所述復(fù)制的靶序列加倍。然后可氧化還原的化合物插入形成所述復(fù)制的靶序列的核苷酸之 間，并相對(duì)于施加的電場(chǎng)而損失其可氧化還原的活性。因此，在擴(kuò)增循環(huán)的過(guò)程中，測(cè)量的電信號(hào)下降。然后有利地記錄與電流下降相對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，從而確定所述樣本中所述靶核 苷酸序列的濃度。這是因?yàn)闇y(cè)量的信號(hào)的下降與復(fù)制的靶核苷酸序列的量成比例。由此比 例可以推導(dǎo)出初始存在于所述樣本中的預(yù)定的靶核苷酸序列的量。因此，根據(jù)一定的擴(kuò)增 循環(huán)數(shù)重復(fù)所述可激活擴(kuò)增裝置的激活，并且記錄電流下降時(shí)所述擴(kuò)增裝置的循環(huán)數(shù)，以 確定樣本中所述靶核苷酸序列的濃度。特別地，生物學(xué)樣本包含的預(yù)定的靶核苷酸序列越 多，使電流強(qiáng)度下降所需要的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)越少。相反，樣本包含的預(yù)定的靶序列越少，擴(kuò)增 循環(huán)數(shù)越多。即，如同本說(shuō)明書(shū)其它部分將更詳細(xì)解釋的，這種方法還使在生物學(xué)樣本中定 量預(yù)定的靶序列的濃度成為可能。應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明的是，術(shù)語(yǔ)“可氧化還原的化合物”不僅描述氧化還原化合物，還描述 能夠在某些條件下被氧化和在其它條件下被還原的化合物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特別有利的實(shí)施方案，在已經(jīng)擴(kuò)增出預(yù)定的靶核苷酸序列后， 還向所述樣本提供熱能，以引起所述插入的可氧化還原的化合物的釋放，并且向所述樣本 施加電場(chǎng)，以同時(shí)記錄經(jīng)過(guò)所述樣本的電流的變化。然后確定與記錄的電流的最大變化相 對(duì)應(yīng)的熱能Q的量，以鑒定所述預(yù)定的靶核苷酸序列的性質(zhì)。有利地，以這樣的方式向所述 樣本提供熱能使得引起所述樣本溫度的漸增。因此，將電流變化記錄為所提供熱能的函數(shù)， 或者更具體地記錄為給定范圍內(nèi)溫度的函數(shù)。由在給定溫度的電流的最大變化，鑒定所述 預(yù)定的靶核苷酸序列的性質(zhì)。這是因?yàn)?，根?jù)擴(kuò)增的靶序列的性質(zhì)，在給定溫度的電流的最 大變化是所述復(fù)制的靶核苷酸序列的特征。因此，當(dāng)向樣本和，由此向復(fù)制的靶核苷酸序列提供足夠的熱能時(shí)，復(fù)制的靶核苷 酸序列的雙鏈傾向于分離成兩條單鏈并因此釋放插入的可氧化還原的化合物，然后所述化 合物恢復(fù)電化學(xué)活性。在給定的熱震蕩，即在給定的溫度，復(fù)制的靶核苷酸序列的雙鏈彼 此分離，從而在向樣本提供給定量的熱能時(shí)，突然以幾乎不連續(xù)的方式，即，在窄的溫度范 圍內(nèi)發(fā)生可氧化還原的化合物的釋放，然后通過(guò)在電極處產(chǎn)生的電流測(cè)量所述化合物的釋 放。有利地，以這樣的方式向所述樣本提供熱能使得引起所述樣本溫度的漸增，例如 40°C-98°C。在這個(gè)溫度范圍內(nèi)，復(fù)制的靶核苷酸序列的雙鏈將逐漸從配對(duì)狀態(tài)(其中復(fù)制 的靶序列的每個(gè)核苷酸堿基都以互補(bǔ)方式相結(jié)合)轉(zhuǎn)變?yōu)榻怆x狀態(tài)(其中每個(gè)復(fù)制的靶序 列將最終成為單鏈)。因此由雙鏈狀態(tài)到單鏈狀態(tài)的改變發(fā)生在窄的溫度范圍內(nèi)，其通過(guò) “解離”溫度表征，通常記作Tm，是復(fù)制的靶核苷酸序列的性質(zhì)的特征。此外，優(yōu)選在所述樣本的預(yù)定的溫度測(cè)量代表所述可氧化還原的化合物的電化學(xué) 活性的電流，在該溫度沒(méi)有其它形成的或正在形成過(guò)程中的分子抑制可氧化還原的化合 物，例如引物二聚體。有利地，所述預(yù)定的溫度明顯低于，但仍然接近與熱能Q的預(yù)定量相 對(duì)應(yīng)的所述樣本的溫度，使得，在這個(gè)高的溫度，所有其它分子(其大小小于復(fù)制的靶核苷 酸序列)去雜交化，而復(fù)制的靶核苷酸序列保持完整。用這種方式，將由各種引物二聚體或 任何其它更小的分子釋放所述可氧化還原的化合物(已經(jīng)供應(yīng)的熱能使其可能解離)而導(dǎo) 致的電流量，從測(cè)量的電流中消除。優(yōu)選地，使用伏安法測(cè)量并記錄電流或電流的所述變化。這種動(dòng)電位法 (potentiodynamic method)包括在兩個(gè)電極之間，如在本說(shuō)明書(shū)的其余部分將更詳細(xì)解釋的，施加隨時(shí)間可變的電勢(shì)，并隨之記錄由其產(chǎn)生的電流的變化。優(yōu)選地，使用方波伏安法。 其它電化學(xué)技術(shù)當(dāng)然也可能應(yīng)用，例如示差脈沖伏安法或線性或循環(huán)掃描伏安法或其它取 樣電流伏安法或交流電伏安法。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特別有利的實(shí)施方案，提供的所述可氧化還原的化合物是過(guò)渡 金屬的復(fù)合物，例如門捷列夫表第VIIIA列的金屬，和更具體地，鋨。此外，可氧化還原的化 合物有利地具有至少一個(gè)核酸序列插入配體，和例如二吡啶并吩嗪配體，其能插入由復(fù)制 的靶核苷酸序列形成的配對(duì)鏈之間。此外，可氧化還原的化合物具有至少一個(gè)二吡啶配體和有利地兩個(gè)這類配體。鋨 與相伴的二吡啶并吩嗪配體或兩個(gè)相伴的二吡啶配體形成的復(fù)合物將在本說(shuō)明書(shū)的其余 部分更詳細(xì)地描述。此外，可以觀察到一些完全有機(jī)的可氧化還原的化合物也能有益地使 用；其為，例如，亞甲基藍(lán)的情況。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，引起了所述預(yù)定的靶核苷酸序列的復(fù)制和復(fù)制 的靶核苷酸序列以核酸雙鏈形式的形成。因此，所述可激活擴(kuò)增裝置為PCR類型的。根據(jù)第二方面，本發(fā)明提出用于電化學(xué)鑒定靶核苷酸序列的組件。所述組件包括 用于接收可包含預(yù)定的靶核苷酸序列的生物學(xué)樣本的裝置，和包含游離核苷酸以引起所述 預(yù)定的靶核苷酸序列復(fù)制和復(fù)制的靶核苷酸序列的形成的可激活擴(kuò)增裝置。此外，組件包 括能與所述核苷酸反應(yīng)的可氧化還原的化合物，所述可氧化還原的化合物與所述生物學(xué)樣 本接觸。激活裝置使得激活所述可激活擴(kuò)增裝置成為可能，并且該裝置可以以這樣的方式 對(duì)所述樣本施加電場(chǎng)使得激活所述可氧化還原的化合物，而測(cè)量裝置使得測(cè)量代表所述可 氧化還原的化合物的電學(xué)活性的經(jīng)過(guò)所述樣本的電流成為可能。最后，確定裝置使得如果 電流下降則確定存在所述預(yù)定的靶核苷酸序列成為可能。根據(jù)本發(fā)明，所述可氧化還原的 化合物選自能在復(fù)制期間插入形成所述復(fù)制的靶序列的核苷酸之間，即復(fù)制的靶核苷酸序 列的雙鏈中的化合物，所述復(fù)制的靶序列引起所述插入的可氧化還原的化合物電化學(xué)活性 的抑制，電流因此下降。此外，并且根據(jù)一個(gè)有利的實(shí)施方案，鑒定組件還包含用于以這樣的方式向所述 樣本提供熱能使得引起所述插入的可氧化還原的化合物釋放的裝置，和用于通過(guò)電極接觸 樣本而以這樣的方式向所述樣本施加電場(chǎng)使得同時(shí)記錄經(jīng)過(guò)所述樣本的電流變化作為溫 度的函數(shù)的裝置，以及用于確定與記錄的電流的最大變化相對(duì)應(yīng)的熱能的量以檢查預(yù)定的 靶核苷酸序列的存在的裝置。這些裝置根據(jù)記錄的電流的最大變化，確定作為待檢測(cè)靶核 苷酸序列存在的特征的解離溫度(Tm)。上述電化學(xué)鑒定組件，其使得根據(jù)本發(fā)明執(zhí)行所述 方法成為可能，將在后面的敘述中更詳細(xì)地解釋。特別地，將描述激活裝置，其有利地能根 據(jù)連續(xù)擴(kuò)增循環(huán)激活所述可激活擴(kuò)增裝置，以使所述復(fù)制的靶序列在每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)加倍。 此外，根據(jù)本發(fā)明的鑒定組件包括用于以這樣的方式記錄與電流下降相對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù) 使得確定所述樣本中所述靶核苷酸序列的濃度的記錄裝置。此外，本發(fā)明的其它特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)將在閱讀下文提供的對(duì)本發(fā)明的特定實(shí)施方案的 描述中體現(xiàn)，所述實(shí)施方案參照附圖，以非限制性指示的方式給出-

圖1是根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)鑒定組件的示意圖；-圖2A至2C是根據(jù)一個(gè)可變實(shí)施方案，圖1中所示鑒定組件的要素的示意圖；-圖3A和;3B是通過(guò)圖1所示鑒定組件獲得的強(qiáng)度/電勢(shì)-圖3C是通過(guò)推導(dǎo)圖3A和;3B中所示的圖而獲得的圖。-圖4是與圖3C類型相似的圖。-圖5A闡釋通過(guò)圖1和第一步中所示鑒定組件獲得的強(qiáng)度/溫度圖。-圖5B闡釋通過(guò)轉(zhuǎn)換圖5A中所闡釋的圖在第二步中獲得的圖。-圖6闡釋圖5B所代表的類型在具體應(yīng)用中的圖。 根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)鑒定方法要求使用電化學(xué)鑒定組件，其一方面包括，控制和 測(cè)量裝置，其將首先描述，和另一方面包括特定的生物學(xué)和化學(xué)組分。因此，根據(jù)本發(fā)明的 電化學(xué)鑒定設(shè)備10示于圖1中。此圖1顯示了兩個(gè)微池12、14，其內(nèi)部適合于接收生物學(xué) 樣本，所述樣本的性質(zhì)將在后文定義。這些微池12、14，其根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)是已知的，分別具 有底部16、18，其上存在電極20、對(duì)電極22和未顯示的參照電極，所述電極通過(guò)，例如篩網(wǎng) 印制獲得，并分別連接至穩(wěn)壓器24，前兩者通過(guò)導(dǎo)線沈、觀連接。此外，它們夾心在支撐 它們的Pelletier-效應(yīng)模塊32和與發(fā)生器34連接的加熱帽30之間。如后文將解釋的， Pelletier-效應(yīng)模塊32使得為微池12、14的內(nèi)容物提供給定量的熱能成為可能。此外，發(fā) 生器34和穩(wěn)壓器M受微型計(jì)算機(jī)36的控制，所述計(jì)算機(jī)包含計(jì)算機(jī)程序和記錄裝置。因此，這些微池12、14構(gòu)成能接收生物學(xué)樣本的接收裝置，其中所述生物學(xué) 樣本可包括核酸序列，特別是DNA，其包含意圖檢測(cè)的預(yù)定的靶核苷酸序列。此外， Pelletier-效應(yīng)模塊32，和能受微型計(jì)算機(jī)36控制的發(fā)生器34，構(gòu)成可激活擴(kuò)增裝置的第 一部分，第二部分包含生物材料和化學(xué)物質(zhì)。當(dāng)然，其它公知的接收裝置，其未示出，包括插入放置生物學(xué)樣本的基底的管。然 后為管配備能在這種生物學(xué)樣本中浸入并與穩(wěn)壓器連接的電極。然后意欲將管安裝在熱循 環(huán)器中以使生物學(xué)樣本達(dá)到預(yù)定的溫度并遵循預(yù)定的時(shí)間循環(huán)。其它接收裝置，如圖2A至 2C所闡釋的，使得接收生物學(xué)樣本成為可能。它們包含小尺寸的容器11，例如管蓋，如圖2A 所示，其能包含例如從 μ 至lml，并且其上部13為開(kāi)放的。它能接收反應(yīng)混合物。然后 通過(guò)膜15將其密封，所述膜上篩網(wǎng)印制了三個(gè)未連接的電極17、19、21。電極17、19、21朝 向容器11內(nèi)側(cè)并且由此出現(xiàn)在容器邊緣和膜15之間的結(jié)合點(diǎn)。接著，然后將具有膜15的 容器11翻轉(zhuǎn)，使其背對(duì)Pelletier-效應(yīng)模塊，并且因此，起初在容器11底部的反應(yīng)混合物 接觸電極17、19、21，所述電極浸入所述混合物中。本文使用的擴(kuò)增方法是“PCR”方法。因此，通過(guò)Pelletier-效應(yīng)模塊32，微池12、 14的內(nèi)部能達(dá)到預(yù)定的溫度，保持同樣是預(yù)定的一段時(shí)間并遵循下述規(guī)程該規(guī)程以根據(jù) 聚合酶類型進(jìn)行的1至15分鐘的第一階段開(kāi)始，其中微池12、14的內(nèi)部達(dá)到94-95°C的溫 度；接著，根據(jù)檢測(cè)復(fù)制的靶核苷酸序列所需的擴(kuò)增，對(duì)微池12、14進(jìn)行一定次數(shù)的溫度連 續(xù)循環(huán)，通常為10-50個(gè)循環(huán)，根據(jù)每個(gè)循環(huán)四個(gè)連續(xù)階段進(jìn)行，第一個(gè)“變性”階段通常為 在94-95°C的1至60秒；第二個(gè)“引物退火”階段，通常為在40°C _72°C的1至60秒，特征 為對(duì)預(yù)定的靶核苷酸序列特異性的引物；第三個(gè)“延伸”階段，通常為在72°C 1至60秒，和 在40°C _95°C的溫度幾秒鐘的最終階段，其由電化學(xué)測(cè)量所需的時(shí)間確定。執(zhí)行此第一擴(kuò) 增-裝置部分的條件將在下文，在描述第二部分后描述，所述第二部分包括，特別地，生物 材料和化學(xué)物質(zhì)(化合物)。因?yàn)楸景l(fā)明的目標(biāo)之一是通過(guò)復(fù)制擴(kuò)增核酸序列并在擴(kuò)增方法過(guò)程中電化學(xué)測(cè) 量其在介質(zhì)(medium)中的存在，首先可取的是具有能進(jìn)行這種擴(kuò)增的生物材料。為了進(jìn)行PCR技術(shù)，可取的是使待擴(kuò)增核酸接觸聚合酶、引物對(duì)和構(gòu)成DNA的四種游離核苷酸dGTP、 dATP、dTTP和dCTP，所述游離核苷酸分別是脫氧鳥(niǎo)苷三磷酸、脫氧腺苷三磷酸、脫氧酪氨酸 三磷酸和脫氧胞苷三磷酸。也可以使用脫氧核糖核苷酸三磷酸類型的堿基的類似物，比如 脫氧-去氮-鳥(niǎo)苷三磷酸。因此，根據(jù)本申請(qǐng)的第一個(gè)實(shí)例，除了待檢測(cè)的生物學(xué)樣本和事實(shí)上包含283個(gè) 堿基對(duì)的靶核酸序列的巨細(xì)胞病毒DNA提取物之外，將DNA聚合酶(即酶)、引物和四類核 苷酸引入微池12，全部形成反應(yīng)混合物，其當(dāng)然為液體并已緩沖。此外，為了能測(cè)量電信號(hào) 的強(qiáng)度，向反應(yīng)混合物加入可氧化還原的化合物，所述可氧化還原的化合物，在相關(guān)的情況 中，是鋨復(fù)合物雙0，2’-二吡啶)二吡啶并[3，2-a:2’，3’-c]吩嗪鋨(II)，其CAS號(hào)可 為3555395-37-8，在本情形表示為[Osn(bpy)2DPPZ]2+，并且其化學(xué)式為式I
權(quán)利要求
1.用于電化學(xué)鑒定靶核苷酸序列的方法，所述方法是根據(jù)如下類型-提供生物樣品，其中可包含預(yù)定的靶核苷酸序列；-提供包含游離核苷酸的可激活的擴(kuò)增裝置，以引起所述預(yù)定的靶核苷酸序列的復(fù)制 和復(fù)制的靶核苷酸序列的形成；-提供能與所述核苷酸反應(yīng)的可氧化還原的化合物，并使所述可氧化還原的化合物與 所述生物學(xué)樣本接觸；-激活所述可激活擴(kuò)增裝置；-對(duì)所述樣本施加電場(chǎng)以激活所述可氧化還原的化合物，并測(cè)量代表所述可氧化還原 的化合物的電化學(xué)活性的電流，所述電流經(jīng)過(guò)所述樣本；和-如果電流減弱，則確定存在所述預(yù)定的靶核苷酸序列；所述方法的特征在于提供能在復(fù)制期間在形成所述復(fù)制的靶序列的核苷酸之間插入 的可氧化還原的化合物，所述復(fù)制的靶序列引起所述插入的可氧化還原的化合物的電化學(xué) 活性的抑制，由此電流減弱。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的鑒定方法，其特征在于根據(jù)連續(xù)擴(kuò)增循環(huán)激活所述可激活的擴(kuò)增 裝置，而且在于，在每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)所述復(fù)制的靶序列加倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的鑒定方法，其特征在于記錄與電流減弱相對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，從 而確定所述樣本中所述靶核苷酸序列的濃度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的鑒定方法，其特征在于其還包括下述步驟-為所述樣本提供熱能，以引起所述插入的可氧化還原的化合物的釋放，并且對(duì)所述樣 本施加電場(chǎng)，以同時(shí)記錄經(jīng)過(guò)所述樣本的電流的變化；和-確定與記錄的電流中最大變化相對(duì)應(yīng)的熱能Q的量，從而鑒定所述預(yù)定的靶核苷酸 序列的性質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的鑒定方法，其特征在于向所述樣本提供熱能以引起所述樣本溫度 的逐漸升高。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的鑒定方法，其特征在于所引起的溫度的逐漸升高是在40°C-98°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的鑒定方法，其特征在于在所述樣本的預(yù)定的溫度測(cè) 量代表所述可氧化還原的化合物的電化學(xué)活性的電流。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6和7的鑒定方法，其特征在于所述預(yù)定的溫度顯著低于與熱能 Q的預(yù)定量相對(duì)應(yīng)的所述樣本的溫度。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的鑒定方法，其特征在于使用伏安法測(cè)量所述電流。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的鑒定方法，其特征在于使用方波伏安法。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的鑒定方法，其特征在于提供的所述可氧化還原的 化合物是過(guò)渡金屬的復(fù)合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的鑒定方法，其特征在于所述可氧化還原的化合物具有至少一個(gè) 核酸序列插入配體。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12的鑒定方法，其特征在于所述可氧化還原的化合物具有二吡 啶并吩嗪配體。
14.根據(jù)權(quán)利要求11至13中任一項(xiàng)的鑒定方法，其特征在于所述可氧化還原的化合物 具有至少一個(gè)二吡啶配體。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)的鑒定方法，其特征在于引起所述預(yù)定的靶核苷酸 序列的復(fù)制和核酸雙鏈形式的復(fù)制的靶核苷酸序列的形成。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)的鑒定方法，其特征在于所述可激活擴(kuò)增裝置是 PCR類型的。
17.用于通過(guò)電化學(xué)方法鑒定靶核苷酸序列的組件，所述組件包括-用于接收生物學(xué)樣本的裝置(12，14)，所述樣本可包含預(yù)定的靶核苷酸序列；-可激活的擴(kuò)增裝置，其包含游離核苷酸，以引起所述預(yù)定的靶核苷酸序列的復(fù)制和復(fù) 制的靶核苷酸序列的形成；-能與所述核苷酸反應(yīng)的可氧化還原的化合物，所述可氧化還原的化合物與所述生物 學(xué)樣本接觸；-用于激活所述可激活擴(kuò)增裝置的激活裝置(32，34，36)；-用于對(duì)所述樣本施加電場(chǎng)以激活所述可氧化還原的化合物的裝置00，22，24, 26, 觀，36)，和用于測(cè)量代表所述可氧化還原的化合物的電化學(xué)活性的電流的裝置，所述電流 經(jīng)過(guò)所述樣本；和-用于如果電流減弱則確定存在所述預(yù)定的靶核苷酸序列的裝置04，36)；其特征在于所述可氧化還原的化合物選自能在復(fù)制期間插入形成所述復(fù)制的靶序列 的核苷酸之間的化合物，所述復(fù)制的靶序列引起所述插入的可氧化還原的化合物電化學(xué)活 性的抑制，由此電流減弱。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的鑒定組件，其特征在于所述激活裝置(32，34，36)適合于根據(jù)連 續(xù)擴(kuò)增循環(huán)激活所述可激活擴(kuò)增裝置，從而在每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)使所述復(fù)制的靶序列加倍。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的鑒定組件，其特征在于還包括記錄裝置(36)，其用于記錄與電 流減弱相對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)以確定所述樣本中所述靶核苷酸序列的濃度。
20.根據(jù)權(quán)利要求17至19中任一項(xiàng)的鑒定組件，其特征在于還包括-用于為所述樣本提供熱能以引起所述插入的可氧化還原的化合物釋放的裝置(32)， 和用于對(duì)所述樣本施加電場(chǎng)以同時(shí)記錄經(jīng)過(guò)所述樣本的電流的變化的裝置(20，22，對(duì)，26， 28，36)；和-用于確定與記錄的電流中最大變化相對(duì)應(yīng)的熱能的量以鑒定所述預(yù)定的靶核苷酸序 列的性質(zhì)的裝置。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于靶核酸序列電化學(xué)檢測(cè)的方法和集合。根據(jù)所述方法，提供可能包含核酸的生物樣品，所述核酸能包含靶序列，所述生物樣品與氧化劑混合，所述靶序列包括至少一個(gè)能由所述氧化劑氧化的核苷酸堿基；提供能與所述靶序列結(jié)合的互補(bǔ)裝置；根據(jù)本發(fā)明，所述互補(bǔ)裝置包括適于復(fù)制所述靶序列的可激活的擴(kuò)增裝置，所述擴(kuò)增裝置包括至少包括所述核苷酸堿基的核苷酸，其中所述核苷酸能在復(fù)制過(guò)程中消耗以構(gòu)成復(fù)制核酸；并且通過(guò)對(duì)所述樣品施加電場(chǎng)并記錄電流的降低而確定所述靶序列的存在。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102112630SQ200980130393
公開(kāi)日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2009年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月5日
發(fā)明者蒂鮑特·德費(fèi)弗, 貝努瓦·里默格斯, 達(dá)米恩·馬查爾 申請(qǐng)人:國(guó)家科學(xué)研究中心, 巴黎大學(xué)迪德羅特第七分校