專利名稱：作為用于識別真菌和酵母種類的診斷目標(biāo)的swi5基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于識別一種或更多種真菌和酵母種類(species)的核酸引物和探 針。更具體而言，本發(fā)明涉及SWI5基因、相應(yīng)的RNA、特異性探針、引物和與其有關(guān)的寡核苷 酸，以及它們在檢測和/或區(qū)分真菌和酵母種類的診斷檢測中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
酵母和真菌感染代表了免疫妥協(xié)患者發(fā)病率和死亡率的主要原因。處于酵母和真 菌感染風(fēng)險中的免疫妥協(xié)患者每年持續(xù)增加，這如同引起疾病的真菌和酵母因子的范圍每 年持續(xù)增加一樣。由真菌感染、尤其是侵襲性真菌感染引起的死亡率在某些風(fēng)險群體中是 30%或更高?？捎玫目拐婢鷦┑年嚾菰谠鲩L；然而，對固有的和新出現(xiàn)的抗真菌藥物抗性的 識別也在增長。這些因素促成了在實驗室檢測中進(jìn)行經(jīng)費控制的增加需求，并已經(jīng)導(dǎo)致檢 IlJfMji Φ W^ ! ^^ (Iaboratoryconsolidation)。侵襲性真菌感染正在增加。在2003年，估計有900萬的風(fēng)險患者，其中120萬發(fā) 生感染。念珠菌屬菌種(假絲酵母屬菌種，Candida spp.)和曲霉屬菌種(Aspergillus spp.)現(xiàn)被列為感染免疫抑制患者的最主要病原體。尤其地，在泌尿道、呼吸系統(tǒng)和血流 中，在插入支架、導(dǎo)管和整形外科接頭的部位處，感染是常見的。約10%的已知念珠菌屬菌 種已經(jīng)牽涉到人類感染。當(dāng)念珠菌進(jìn)入血流時發(fā)生侵襲性念珠菌病，并且，估計其在美國 以8/100,000人口的頻率發(fā)生，死亡率為40%。白色念珠菌(Candida albicans)是血流 感染的第四種最常見的原因。曲霉病通常始于肺部感染，其在一些患者中可發(fā)展成致命的 侵襲性感染，并具有大于90%的死亡率。新出現(xiàn)的真菌病因子包括鐮刀菌屬(Fusarium)、 絲孢菌屬(Scedosporium)、接合菌(Zygomycetes)禾口毛孢子菌菌禾中(Trichosporon spp.) ("Stakeholder Insight Invasivefungal infections (1 ^ ) Datamonitor, Jan 2004)。免疫妥協(xié)患者，包括移植患者和手術(shù)患者、新生兒、癌癥患者、糖尿病患者和那 些患有HIV/AIDs的患者處于發(fā)生侵襲性真菌感染的高風(fēng)險中(Datamonitorr印ort Stakeholder opinion-Invasive fungal infections,options outweighreplacements(1 襲性真菌感染，選擇重于取代)2004)。每年有大量嚴(yán)重的膿毒癥病例被報道。盡管其醫(yī)學(xué) 管理有所改進(jìn)，但膿毒癥仍是重癥特別護(hù)理醫(yī)學(xué)中最大的挑戰(zhàn)之一。引起膿毒癥的微生物 (細(xì)菌、真菌和酵母)傳統(tǒng)地借助差靈敏性05-82% )的微生物學(xué)培養(yǎng)方法在醫(yī)院化驗室 中檢測，其非常耗費時間，通?；ㄙM2到5天來完成，并且花費多達(dá)8天來診斷真菌感染。由 酵母或真菌引起的感染的確診通常是基于從臨床樣本中回收并識別特定因子，或者顯微鏡 證明具有獨特形態(tài)學(xué)特征的真菌。然而，存在這些方法不能提供關(guān)于感染因子的結(jié)論性證 據(jù)的眾多情況。在這些情況中，可以應(yīng)用特異性宿主抗體反應(yīng)的檢測，盡管這可再次被患者 的免疫狀態(tài)所影響。在檢測并識別通常由細(xì)菌和真菌引起的血流感染中，時間是關(guān)鍵性的。 有效處理取決于迅速有效地找到感染源并就抗生素或抗真菌劑做出正確的決定。只有在病 原體被正確識別后，才能開始使用特異性抗生素或抗真菌劑的靶向治療。許多醫(yī)師希望看 到用于酵母和真菌早期診斷的更好的體外擴(kuò)增和直接檢測診斷技術(shù)的發(fā)展("MakeholderInsight Jnvasive fungal infections (侵襲f生真菌感染)，，，Datamonitor，Jan 2004)。最 近，Roche 發(fā)起了基于實時PCR的分析(S印tifasttm)，以在臨床樣品中檢測細(xì)菌、真菌和 酵母DNA。因此，明顯需要發(fā)展用于臨床有意義細(xì)菌和真菌病原體的新穎快速的診斷測試， 用于臨床部門中的生物分析應(yīng)用。這已經(jīng)致使本發(fā)明人識別新的真菌和酵母核酸目標(biāo)以應(yīng) 用于核酸診斷(NAD)檢測?；谡婢徒湍负怂岬脑\斷主要集中于核糖體RNA(rRNA)基因、RNA轉(zhuǎn)錄物及其 相關(guān)的DNA/RNA區(qū)域。rRNA基因在所有真菌種類中高度保守，并且它們也含有分歧的和 獨特的基因間轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)。核糖體rRNA包含3個基因大亞單位基因Q8S)、小亞單位基 因(18S)和5. 8S基因。^S和18S rRNA基因被5. 8S rRNA和兩個內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1和 ITS2)分開。由于ITS區(qū)域含有多數(shù)的序列多態(tài)性，許多研究者已經(jīng)將他們的努力集中于此 作為目標(biāo)(Atkins and Clark, 2004) 0 rRNA基因也是多拷貝基因，在真菌基因組中大于10 個拷貝。許多團(tuán)隊從事于開發(fā)真菌和酵母感染的新分析。US2004044193涉及白色念珠 菌的轉(zhuǎn)錄因子CaTECl ；其抑制劑，以及診斷和治療與念珠菌屬感染相關(guān)的疾病的方法；也 涉及含有核酸序列、蛋白質(zhì)、宿主細(xì)胞和/或抗體的診斷和藥物組合物，和許多其它方面。 W001838M涉及雜交分析探針和附屬寡核苷酸(accessoryoligonucleotides)，用于檢測 來自白色念珠菌和/或都柏林念珠菌(Candidadubliniensis)的核糖體核酸。US6017699 和US5426(^6涉及一組DNA引物，其可以用于擴(kuò)增并形成(speciate) 5個醫(yī)學(xué)上重要的念 珠菌屬種類的DNA。US 6747137公開了有助于診斷念珠菌屬感染的序列。EP 042觀72和US 56587 公開了基于18S rRNA基因的探針，而US 5958693公開了基于^S rRNA的探針，用 于診斷一系列酵母和真菌種類。US 6017366描述了基于幾丁質(zhì)合酶基因的序列，用于一系 列念珠菌屬種類的基于核酸的診斷學(xué)。但是清楚的是，需要開發(fā)更快、更精確的診斷方法，尤其是鑒于由現(xiàn)代抗微生物 劑治療引起的選擇壓力，所述抗微生物劑治療產(chǎn)生具有突變基因組序列的抗性有毒菌 株的增加群體。能早期診斷感染的微生物病因的方法使得能夠選擇特定狹窄范圍的抗 生素或抗真菌劑來治療該感染(Datamonitor report Stakeholderopinion-Invasive fungal infections, options outweigh replacements (侵襲性真菌感染，選擇重于取 代),2004 ；Datamonitor report :Stakeholder Opinion-Sepsis, under reactionto an overreaction (膿毒癥，反應(yīng)不足到過度反應(yīng))，2006)。SWI5是轉(zhuǎn)錄因子，其激活參與有絲分裂/間隔期1 (Gap 1)(間期)轉(zhuǎn)換的基因 并在細(xì)胞周期的 Gl 期表達(dá)(Butler and Thiele 1991 ；Aerne et al.，1998 ；Akamatsu et al. ,2003 ；Ellermeier et al. ,2004 ；MacCalIum et al.，2006)?？稍?NCBI GenBank 數(shù) 據(jù)庫中獲得1 條SWI5序列，包括下列序列6個曲霉屬菌種SWI5序列和費希新薩托菌 (Neosartorya fischeri)的一條SWI5序列。PCR引物被設(shè)計并被應(yīng)用以產(chǎn)生曲霉屬菌種 中的SWI5基因的序列信息。SWI5存在于一些念珠菌屬菌種例如光滑念珠菌(C. glabrata) 中，但不存在于其它菌種例如白色念珠菌(C. albicans)中(MacCallum etal.，2006)。因 此，存在使用SWI5進(jìn)行選擇的念珠菌屬菌種的分子識別的可能性。^X“合成寡核苷酸”指不直接來自基因組DNA或活的生物的2個或更多個核苷酸堿基的核酸聚合物分子。術(shù)語合成寡核苷酸擬包含已經(jīng)用化學(xué)方法制造的或在體外酶合成的 DNA、RNA和DNA/RNA雜交物分子。“寡核苷酸”是具有兩個或更多個共價結(jié)合在一起的核苷酸亞單元的核苷酸聚合 物。寡核苷酸通常為約10到約100個核苷酸。核苷酸亞單元的糖基團(tuán)可以是核糖、脫氧核 糖，或其改性的衍生物如OMe。核苷酸亞單元可以由如磷酸二酯鍵、修飾的鍵的鍵連接，或由 不阻止寡核苷酸雜交到其互補(bǔ)的目標(biāo)核苷酸序列上的非核苷酸部分連接。修飾的鍵包括這 些鍵，其中標(biāo)準(zhǔn)的磷酸二酯鍵被不同的鍵取代，所述不同的鍵如硫代磷酸酯鍵、甲基磷酸酯 鍵或中性肽鍵。根據(jù)本發(fā)明，含氮堿基類似物也可以是寡核苷酸的組分?！澳繕?biāo)核酸”是包含目標(biāo)核酸序列的核酸?！澳繕?biāo)核酸序列”、“目標(biāo)核苷酸序列”或 “目標(biāo)序列”是可以與互補(bǔ)寡核苷酸雜交的特定脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列?！肮押塑账崽结?，，是具有這樣的核苷酸序列的寡核苷酸，所述核苷酸序列足以與其 目標(biāo)核酸序列互補(bǔ)，以能夠在高度嚴(yán)格雜交條件下形成可檢測的雜交探針目標(biāo)雙鏈體。寡 核苷酸探針是一種分離的化學(xué)物質(zhì)，并可以包括目標(biāo)區(qū)域外面的另外的核苷酸，只要這些 核苷酸不阻止高度嚴(yán)格雜交條件下的雜交。非互補(bǔ)序列，如啟動子序列、限制性內(nèi)切核酸酶 識別位點、或者賦予期望的二級或三級結(jié)構(gòu)如催化活性部位的序列可以被使用，以促進(jìn)使 用發(fā)明探針的檢測。寡核苷酸探針任選地可以標(biāo)記有可檢測部分，如放射性同位素、熒光部 分、化學(xué)發(fā)光劑、納米顆粒部分、酶或配體，它們可以被使用以檢測或確定探針雜交到其目 標(biāo)序列。寡核苷酸探針優(yōu)選地在約10到約100個核苷酸長的大小范圍，盡管探針有可能長 達(dá)約500個核苷酸及多于約500個核苷酸，或者長度小于10個核苷酸?！半s交物”或“雙鏈體”是通過互補(bǔ)堿基之間的Watson-Crick堿基配對或非規(guī)范堿 基配對在兩條單鏈核酸序列之間形成的復(fù)合體。“雜交”是這樣的過程，通過該過程，兩個互 補(bǔ)的核酸鏈聯(lián)合形成雙鏈結(jié)構(gòu)(“雜交物”或“雙鏈體”)?！罢婢被颉敖湍浮币庵刚婢绲?任何生物，并且優(yōu)選地，關(guān)注于子囊菌(Ascomycota)門的任何生物。“互補(bǔ)”是由單鏈DNA或RNA的堿基序列賦予的一種特性，通過各自鏈上的 Watson-Crick堿基對之間的氫鍵，所述單鏈DNA或RNA可以形成雜交物或雙鏈DNA:DNA、 RNARNA或DNA:RNA。腺嘌呤(A)通常與胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)互補(bǔ)，而鳥嘌呤(G)通 常與胞嘧啶(C)互補(bǔ)。術(shù)語“嚴(yán)格(stringency) ”用于描述在雜交以及隨后的處理步驟過程中存在的溫 度、離子強(qiáng)度和溶劑組成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認(rèn)識到“嚴(yán)格”條件可通過單獨或共同改變 那些參數(shù)而變化。在高度嚴(yán)格條件下，只有高度互補(bǔ)核酸雜交物才會形成；沒有足夠程度互 補(bǔ)性的雜交物不會形成。因此，試驗條件的嚴(yán)格性決定了形成雜交物的兩個核酸鏈之間需 要的互補(bǔ)性的量。嚴(yán)格條件被選擇以最大化由目標(biāo)和非目標(biāo)核酸形成的雜交物之間的穩(wěn)定 性差異。在“高度嚴(yán)格”條件下，核酸堿基配對只會發(fā)生在具有高頻率互補(bǔ)堿基序列的核 酸片段之間(例如，在“高度嚴(yán)格”條件下的雜交可發(fā)生在具有約85-100%同一性、優(yōu)選約 70-100%同一性的同系物之間)。在中等嚴(yán)格條件下，核酸堿基配對會發(fā)生在具有中間頻率 互補(bǔ)堿基序列的核酸之間(例如，在“中等嚴(yán)格”條件下的雜交可在具有約50-70%同一性 的同系物之間發(fā)生)。因此，“弱”或“低”嚴(yán)格條件常常是來自遺傳上不同的生物的核酸所 要求的，因為互補(bǔ)序列的頻率通常較低。
‘高度嚴(yán)格，條件是那些相當(dāng)于這樣的條件，即于42°C下，在由5XSSPE(43.8g/ 1(克/升)NaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O 禾口 1. 85g/l EDTA，用 NaOH 將 pH 調(diào)至 7. 4)、0· 5% SDS、 5 XDenhardt，s試劑和100 μ g/ml (微克/毫升)變性鮭精DNA組成的溶液中結(jié)合或雜交， 接下來，于42°C下，在含有0. 1XSSPEU.0% SDS的溶液中洗滌，其時使用約500個核苷酸 長的探針?！爸械葒?yán)格”條件是那些相當(dāng)于這樣的條件，即于42°C下，在由5XSSPE(43.8g/ 1 NaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O 和 1. 85g/l EDTA,用 NaOH 將 pH 調(diào)至 7. 4)、0· 5 % SDS、 5 XDenhardt，s試劑和100 μ g/ml變性鮭精DNA組成的溶液中結(jié)合或雜交，接下來，于42°C 下，在含有1. 0XSSPEU. 0% SDS的溶液中洗滌，其時使用約500個核苷酸長的探針?！蛧?yán)格，條件是那些相當(dāng)于這樣的條件，即于42°C下，在由5XSSPE(43.8g/ 1 NaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O 禾口 1. 85g/l EDTA,用 NaOH 將 pH 調(diào)至 7. 4)、0. 1 % SDS、 5XDenhardt' s i式劑[每 500ml 的 50XDenhardt' s 含有5g Ficoll (Type 400， Pharamcia)、5g BSA (Fraction V ；Sigma)]和 100 μ g/ml 變性鮭精 DNA 組成的溶液中結(jié)合 或雜交，接下來，于42 °C下，在含有5 X SSPE、0. 1 % SDS的溶液中洗滌，其時使用約500個核 苷酸長的探針。在基于核酸體外擴(kuò)增的技術(shù)的上下文中，通過使用該體外擴(kuò)增技術(shù)特定的溫度條 件和離子緩沖條件來實現(xiàn)“嚴(yán)格”。例如，在PCR和實時PCR的上下文中，通過使用特定的溫 度和離子緩沖強(qiáng)度來實現(xiàn)“嚴(yán)格”，以將寡核苷酸引物，而對于實時PCR來說是探針，雜交到 目標(biāo)核酸上，以體外擴(kuò)增目標(biāo)核酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會理解，本發(fā)明的實質(zhì)上相應(yīng)的探針可以與所提到的序列不 同，并仍與相同的目標(biāo)核酸序列雜交。核酸的這種變異可根據(jù)序列中一致堿基的百分比或 探針與其目標(biāo)序列之間完全互補(bǔ)堿基的百分比來陳述。如果這些百分比是從約100%到約 80%，或者從約10個核苷酸目標(biāo)序列中0堿基錯配到約10個核苷酸目標(biāo)序列中約2個堿 基錯配，那么本發(fā)明的探針實質(zhì)上相應(yīng)于核酸序列。在優(yōu)選的實施方式中，該百分比是從約 100%到約85%。在更優(yōu)選的實施方式中，該百分比是從約90%到約100%;在其它優(yōu)選的 實施方式中，該百分比是從約95%到約100%。通過“充分互補(bǔ)(sufficiently complementary) ”或“實質(zhì)上互補(bǔ)(基本互補(bǔ)， substantially complementary) ”意指核酸具有足夠鄰接互補(bǔ)核苷酸數(shù)量，以在高度嚴(yán)格 雜交條件下形成穩(wěn)定用于檢測的雜交物。術(shù)語“同一的”或百分比“同一性”在兩個或更多個核酸或多肽序列的上下文中， 指兩個或更多個序列或子序列，如使用BLAST或BLAST 2. 0序列比較算法用以下描述的默 認(rèn)參數(shù)所測定的，或者通過手工比對和目視檢查(參見例如ncbi. nlm. nih. rov/BLAST/的 NCBI網(wǎng)站或類似物)所測定的，它們是相同的或者具有指定百分比的相同的氨基酸殘基或 核苷酸(即，當(dāng)在比較窗口或指明區(qū)域中針對最大相關(guān)性進(jìn)行比較和比對時，在指定區(qū)域 中 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性)。這樣的序 列隨后被稱為“實質(zhì)上同一的”。該定義也指測試序列的評價(compliment)，或者可用于測 試序列的評價。該定義也包括具有缺失和/或插入的序列，以及那些具有置換的序列。如 下所述，優(yōu)選的算法可以解釋空位和類似物。優(yōu)選地，同一性存在于至少約25個氨基酸或 核苷酸長的區(qū)域中，或者更優(yōu)選地，存在于50-100個氨基酸或核苷酸長的區(qū)域中。
對于序列比較，通常一條序列作為參考序列，測試序列與所述參考序列相比較。當(dāng) 使用序列比較算法時，將測試和參考序列輸入到計算機(jī)中，指定子序列坐標(biāo)，如果需要則指 定序列算法程序參數(shù)。優(yōu)選地，可以使用默認(rèn)程序參數(shù)，或者可以指定可選的參數(shù)。然后， 基于程序參數(shù)，序列比較算法計算測試序列相對于參考序列的序列同一性百分比。如本文所使用的“比較窗口”包括參考選自從20到600、通常約50到約200、更通 常約100到約150的連續(xù)位置數(shù)目中的任何一個的區(qū)段，其中，一個序列可以與該相同數(shù) 目連續(xù)位置的參考序列相比較——在這兩條序列最佳比對之后。比對序列用于比較的方 法在本領(lǐng)域是眾所周知的。用于比較的最佳序列比對可以例如由Smith & Waterman，Adv. Appl. Math. 2 :482(1981)的局部同源性算法(localhomology algorithm)、Needleman & ffunsch, J. Mol. Biol. 48 443 (1970)的同源性比對算法(homology alignment algorithm)、 Pearson & Lipman，Proc. Nat，1. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)的搜索相似性方法(search for similarity method)、這些算法的計算機(jī)化執(zhí)行(GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA， Wisconsin Genetics SoftwarePackage 中，Genetics Computer Group,575 Science Dr., Madison, WI)進(jìn)行，或者通過手工比對和目視檢查(參見例如，Current Protocols in Molecular Biology (當(dāng)前的分子生物學(xué)方案)(Ausubel et al.，eds. 1987-2005，Wiley Interscience))進(jìn)行。適于確定序列同一性百分比和序列相似性的算法的優(yōu)選例子是BLAST和BLAST 2. 0算法，其在Altschul et al. ,Nuc. Acids Res. 25 :3389-3402(1977)和Altschulet al.， J. Mol. Biol. 215 =403-410 (1990)中各有描述。使用本文描述的參數(shù)，BLAST和BLAST 2.0 被用于確定本發(fā)明核酸和蛋白質(zhì)的序列同一性百分比。進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過美國 國立生物技術(shù)信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公開獲得。該 算法包括通過識別查詢序列中長度W的短字串來首先識別高分序列對(HSR)，其在與數(shù)據(jù) 庫序列中相同長度的字串比對時或者匹配、或者滿足一些正賦值的閾值分值T。T是指鄰近 字串分值閾值(Altschul et al.，見上)。這些最初的鄰近字串命中充當(dāng)起始搜索的種子 以找到包含它們的更長的HSI^s。字串命中沿每條序列在兩個方向上延伸，直到積累的比對 分值可以增加。對于核苷酸序列，積累分值是使用參數(shù)M(對匹配殘基對的賦分；通常>0) 和N(對錯配殘基的罰分；通常< 0)計算的。對于氨基酸序列，得分矩陣被用于計算累計分 值。當(dāng)積累的比對分值從其最大獲得值下降數(shù)量X時；當(dāng)由于一個或更多個負(fù)得分殘基比 對的積累，累積分值變?yōu)榱慊蛐∮诹銜r；或者當(dāng)達(dá)到任一序列的末端時，每一方向中的字串 命中延伸被停止。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(對 于核苷酸序列)使用默認(rèn)的字串長(W) 11、期望值(E)10、M= 5、N = -4和比較兩條鏈。對 于氨基酸序列，BLASTP程序使用默認(rèn)的字串長3和期望值(E) 10，以及BL0SUM62得分矩陣 (參考 Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915(1989))比對(B) 50、期 望值(E) 10、M = 5、N = -4和比較兩條鏈?！昂怂帷敝该撗鹾颂呛塑账峄蚝颂呛塑账幔推鋯捂溁螂p鏈形式的聚合物，以及其 互補(bǔ)物。該術(shù)語包含含有已知的核苷酸類似物或修飾的骨架殘基或連接的核酸，其是合成 的、自然發(fā)生的以及非自然發(fā)生的，其具有與參考核酸相似的結(jié)合特性，并且其以與參考 核苷酸相似的方式被代謝。這樣的類似物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯 (phosphoramidate)、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸酯、2_0_甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNAs)。
“核酸雜交”或“探針目標(biāo)雙鏈體”意為雙鏈、氫鍵結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)，優(yōu)選為約10到約 100個核苷酸長，更優(yōu)選為14到50個核苷酸長，盡管這將在一定程度上取決于寡核苷酸探 針的總長度。該結(jié)構(gòu)足夠穩(wěn)定，以便通過如化學(xué)發(fā)光或熒光檢測、放射自顯影術(shù)、電化學(xué)分 析或凝膠電泳的手段來檢測。這樣的雜交物包括RNA RNA、RNADNA或DNADNA雙鏈體分子。"RNA和DNA等價物”指具有相同互補(bǔ)堿基對雜交特性的RNA和DNA分子。RNA和 DNA等價物具有不同的糖基團(tuán)(即，核糖對脫氧核糖)，并且可以通過尿嘧啶存在于RNA中 和胸腺嘧啶存在于DNA中而不同。RNA和DNA等價物之間的差異不促成實質(zhì)上相應(yīng)的核酸 序列中的差異，因為等價物對特定的序列具有相同程度的互補(bǔ)性?！皟?yōu)先雜交”表示在高度嚴(yán)格雜交條件下，寡核苷酸探針可以與其目標(biāo)核酸雜交以 形成穩(wěn)定的探針目標(biāo)雜交物(因而表明存在目標(biāo)核酸)，而不形成穩(wěn)定的探針非目標(biāo)雜 交物(其將表明存在來自其它生物的非目標(biāo)核酸)。因此，探針以比非目標(biāo)核酸實質(zhì)上更大 的程度雜交到目標(biāo)核酸上，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能正確地檢測這些種類的存在(例如，念 珠菌屬)并將這些種類與其它生物區(qū)分開。優(yōu)先雜交可以使用本領(lǐng)域已知的和本文描述的 技術(shù)來測量?！爸委熢\斷學(xué)”意為使用診斷檢測技術(shù)診斷疾病，選擇正確的治療方案，并監(jiān)控患 者對治療的反應(yīng)。本發(fā)明的治療診斷學(xué)可以基于本發(fā)明的NAD分析在樣品、拭子或從患者 收集的樣本上的使用。發(fā)明目的本發(fā)明的一個目的是提供序列和/或診斷檢測以檢測并識別一個或更多個酵母 和真菌種類。本發(fā)明人已經(jīng)利用SWI5基因序列來設(shè)計對曲霉屬SWI5基因具有特異性的引 物和探針。例如，這樣的引物可允許檢測酵母和真菌種類，并且也允許區(qū)分念珠菌屬和曲霉 屬種類。本發(fā)明還提供了引物和探針，其可允許在不同的念珠菌屬菌種之間和在不同的曲 霉屬菌種中進(jìn)行辨別。發(fā)明_既述本發(fā)明提供了用于檢測并識別真菌和酵母種類的診斷試劑盒，其包含寡核苷酸探 針，所述探針能夠與至少部分SWI5基因或其相應(yīng)mRNA結(jié)合。該寡核苷酸探針可以具有與至 少部分SWI5基因或其相應(yīng)mRNA實質(zhì)上同源或?qū)嵸|(zhì)上互補(bǔ)的序列。因此，它將能夠與互補(bǔ) DNA或RNA分子結(jié)合或雜交。SWI5基因可以是真菌SWI5基因。SWI5基因可以是酵母SWI5 基因。核酸分子可以是合成的。試劑盒可以含有多于一種這樣的探針。具體地說，試劑盒 可以包含多數(shù)這樣的探針。此外，試劑盒可以包含用于其它生物，例如，如細(xì)菌種類或病毒 的另外的探針。被識別的序列不僅適于基于體外DNA/RNA擴(kuò)增的檢測系統(tǒng)，也適于基于信號擴(kuò)增 (信號放大)的檢測系統(tǒng)。此外，被鑒定為合適目標(biāo)的本發(fā)明序列提供了下列優(yōu)勢在一些 區(qū)域中具有顯著的基因內(nèi)序列異質(zhì)性，這是有利的，并使本發(fā)明的方面能夠關(guān)注于類群或 種類特異性目標(biāo)；而且在一些區(qū)域中也具有顯著的序列同質(zhì)性，這使本發(fā)明的方面能夠關(guān) 注于屬特異性真菌和酵母引物以及探針，以用于直接核酸檢測技術(shù)、信號擴(kuò)增核酸檢測技 術(shù)以及核酸體外擴(kuò)增技術(shù)而用于真菌和酵母診斷學(xué)。SWI5序列在診斷檢測中允許多檢測性 能和自動操作。
本發(fā)明序列的優(yōu)勢之一是近緣真菌和酵母種類之間的基因內(nèi)SWI5核苷酸序列多 樣性使用于診斷學(xué)分析以檢測真菌和酵母的特異性引物和探針能夠被設(shè)計。SWI5核苷酸序 列——既有DNA也有RNA——均可與直接檢測、信號擴(kuò)增檢測和體外擴(kuò)增技術(shù)一起用于診 斷學(xué)分析。SWI5序列在診斷檢測中允許多檢測性能和自動操作。試劑盒還可以包括用于擴(kuò)增至少部分SWI5基因的引物。適當(dāng)?shù)兀噭┖邪ú糠?SWI5基因的正向和反向引物。SWI5基因的所述部分可以與與bp (堿基對)位置1-2319相當(dāng)?shù)腟WI5區(qū)域相當(dāng)。與煙曲霉(A. fumigatus)中堿基對位置1到堿基對位置2319相當(dāng)?shù)奈恢每梢栽?其它生物中找到，但不一定在相同的位置。SffI5基因的所述部分可以與與煙曲霉中堿基對位置38到堿基對位置472(區(qū)域 1)和煙曲霉中從堿基對位置1423到1627堿基對位置(區(qū)域3)相當(dāng)?shù)那箤倬N中SWI5 基因的兩個區(qū)域相當(dāng)。與煙曲霉中堿基對位置38到堿基對位置472和從堿基對位置1423到1627相當(dāng) 的位置可以在其它生物中找到，但不一定在相同的位置。試劑盒也可以包含另外的探針。探針可以具有選自集合SEQID NO 17、18、42、45、48、51、54、61、64、或67 的序列，
或者具有與這些序列實質(zhì)上同源或?qū)嵸|(zhì)上互補(bǔ)的序列，所述序列也可以充當(dāng)SWI5基因的 探針。試劑盒可以包括至少一種正向體外擴(kuò)增引物和至少一種反向體外擴(kuò)增引物。這樣 的引物可以包括正向引物，所述正向引物與與被SEQ ID NOs :1、3、5、7、9、11、13、15、36、38、 40、43、46、49、52、55、58、59、62或65優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交， 和/或反向引物，所述反向引物與與被SEQ ID NOs :2、4、6、8、10、12、14、16、37、39、41、44、 47、50、53、56、57、60、63或66優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交，或者也 可以充當(dāng)正向或反向擴(kuò)增引物的與它們實質(zhì)上同源或互補(bǔ)的序列。診斷試劑盒可以基于直接核酸檢測技術(shù)、信號擴(kuò)增核酸檢測技術(shù)，而核酸體外擴(kuò) 增技術(shù)選自下列一種或更多種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、基于核酸 序列的擴(kuò)增(NASBA)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、分支DNA技術(shù)(bDNA)以及 滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCAT)，或其它體外酶擴(kuò)增技術(shù)。本發(fā)明也提供了核酸分子，其選自SEQ ID NO. 1到SEQ ID NO. 95，以及與其實質(zhì)上 同源、或與其部分實質(zhì)上互補(bǔ)并在基于SWI5基因的診斷學(xué)中具有功能的序列。核酸分子可 以含有這樣的寡核苷酸，其具有與SEQ ID NO. 1到SEQ ID NO. 95的核酸分子的一部分實質(zhì) 上同源或?qū)嵸|(zhì)上互補(bǔ)的序列。本發(fā)明也提供了檢測檢測樣品中的目標(biāo)生物的方法，其包括 以下步驟(i)在適當(dāng)?shù)臈l件下，將檢測樣品與至少一種如上所定義的寡核苷酸探針混合； 和(ii)在高度嚴(yán)格條件下，將可能存在于檢測樣品中的任何核酸與寡核苷酸雜交， 形成探針目標(biāo)雙鏈體；和(iii)確定探針目標(biāo)雙鏈體是否存在；雙鏈體的存在明確(positively)識別出 檢測樣品中目標(biāo)生物的存在。
本發(fā)明的核酸分子和試劑盒可以用于診斷檢測，以檢測一種或更多種真菌和/或 酵母種類的存在、測量患者中的真菌和/或酵母滴度，或者用于評估被設(shè)計以減少患者中 的酵母和/或真菌滴度的治療方案的功效的方法中，或者用于測量環(huán)境中的真菌和/或酵 母污染物。環(huán)境可以是醫(yī)院，或者其可以是食物樣品，環(huán)境樣品例如水，工業(yè)樣品，如需要生 物負(fù)載或質(zhì)量評估的加工中樣品或終產(chǎn)品。本發(fā)明的試劑盒和核酸分子可以用于識別和/或表征一種或更多種破壞劑 (disruptive agent)，所述破壞劑可以用于破壞SWI5基因功能。破壞劑可以選自反義RNA、 PNA 和 siRNA。在本發(fā)明的一些實施方式中，含有種類特異性探針的核酸分子可以用于在相同屬 的種之間進(jìn)行區(qū)分。本發(fā)明的寡核苷酸可以在用于檢測真菌和酵母目標(biāo)生物的核酸的組合物中被提 供。適應(yīng)于組合物的意圖用途，這樣的組合物也可以包含緩沖液、酶、去污劑、鹽等。也考慮 的是，本發(fā)明的組合物、試劑盒和方法盡管在本文中被描述為含有至少一種合成寡核苷酸， 其也可以含有具有與該合成核苷酸片段實質(zhì)上相同的序列的天然寡核苷酸，所述天然寡核 苷酸替代合成寡核苷酸或在合成寡核苷酸旁邊。本發(fā)明也提供目標(biāo)真菌和/或酵母生物的體外擴(kuò)增診斷試劑盒，其包含至少一種 正向體外擴(kuò)增引物和至少一種反向體外擴(kuò)增引物，正向擴(kuò)增引物選自也可以充當(dāng)正向擴(kuò)增 引物的與其實質(zhì)上同源或互補(bǔ)的一條或更多條序列，而反向擴(kuò)增引物選自也可以充當(dāng)反向 擴(kuò)增引物的與其實質(zhì)上同源或互補(bǔ)的一條或更多條序列。本發(fā)明也提供用于檢測候選真菌和/或酵母種類的存在的診斷試劑盒，其包含一 條或更多條DNA探針，所述探針含有與候選真菌和/或酵母種類的SWI5基因序列實質(zhì)上互 補(bǔ)或?qū)嵸|(zhì)上同源的序列。用于檢測曲霉屬或光滑念珠菌SW15多核苷酸的試劑盒包括寡核苷酸探針，其選 自 SEQ ID NOs :17、18、42、45、48、51、54、61、64 或 67，或者與與被 SEQ ID NOs 17、18、42、 45、48、51、54、61、64或67優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交的探針。試劑 盒還包括正向引物，其選自 SEQ IDNOs :1、3、5、7、9、11、13、15、36、38、40、43、46、49、52、55、 58、59、62 或 65，或者與與被 SEQ ID NOs :1、3、5、7、9、11、13、15、36、38、40、43、46、49、52、 55、58、59、62或65優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交的探針，和/或反向 引物，其選自 SEQ ID NOs :2、4、6、8、10、12、14、16、37、39、41、44、47、50、53、56、57、60、63 或 66，或者與與被 SEQID NOs :2、4、6、8、10、12、14、16、37、39、41、44、47、50、53、56、57、60、63 或66優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交的探針。用于檢測或識別煙曲霉SW15多核苷酸的試劑盒包括寡核苷酸探針，其選自SEQ ID NO 17或18或42和M，或者與與被SEQ ID NO 17或18或42和M優(yōu)先雜交的核苷酸 序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交的序列；而且還包括正向引物，其選自SEQ ID NO :43,55, 58，或者與與被SEQ ID N0:43、55、58優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交的 序列；和反向引物，其選自SEQ IDNO :44、56、57，或者與與被SEQ ID NO :44、56、57優(yōu)先雜交 的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交的序列。用于檢測或識別黃曲霉(Aspergillus flavus) SW15多核苷酸的試劑盒包括寡 核苷酸探針，其選自SEQ ID NO 45,61和與與被SEQ ID NO :45、61優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交的序列；而且還包括正向引物，其選自SEQID N0:46、59和與與 被SEQ ID NO :46、59優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交的序列；和反向引 物，其選自SEQ ID N0:47、60和與與被SEQID NO :47、60優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷 酸序列優(yōu)先雜交的序列。用于檢測或識別黑曲霉(Aspergillus niger) SW15多核苷酸的試劑盒包括寡核 苷酸探針，其選自SEQ ID NO :48、67和與與被SEQ ID NO :48、67優(yōu)先雜交的核苷酸序列相 同的核苷酸序列優(yōu)先雜交的序列；而且還包括正向引物，其選自SEQID N0:48、65和與與被 SEQ ID NO :48、65優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交的序列；和反向引物， 其選自SEQ ID NO :49、66和與與被SEQID NO :49、66優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸 序列優(yōu)先雜交的序列。用于檢測或識別土曲霉(Aspergillus terreus) SW15多核苷酸的試劑盒包括寡 核苷酸探針，其選自SEQ ID NO :51、64和與與被SEQ ID NO :51、64優(yōu)先雜交的核苷酸序列 相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交的序列；而且還包括正向引物，其選自SEQ ID N0;52、62和與 與被SEQ ID NO :52、62優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的核苷酸序列優(yōu)先雜交的序列；和反向 引物，其選自SEQ ID N0:53、63和與與被SEQ ID NO :53、63優(yōu)先雜交的核苷酸序列相同的 核苷酸序列優(yōu)先雜交的序列。本發(fā)明也提供一條或更多條合成寡核苷酸，其具有與下列集合中的一個或更多個 實質(zhì)上同源或?qū)嵸|(zhì)上互補(bǔ)的核苷酸序列SWI5基因或其mRNA轉(zhuǎn)錄物；真菌SWI5基因或其 mRNA轉(zhuǎn)錄物；酵母SWI5基因或其mRNA轉(zhuǎn)錄物；SEQ ID NOl-SEQ ID NO 95中的一個或更多 個。核苷酸可以包括DNA。核苷酸可以包括RNA。核苷酸可以包括DNA、RNA和PNA的 混合物。核苷酸可以包括合成核苷酸。本發(fā)明的序列(以及與本發(fā)明的方法、試劑盒、組合 物和分析有關(guān)的序列)可以被選擇，以便與SWI5基因編碼區(qū)的一部分實質(zhì)上同源?；蚩?以是來自目標(biāo)真菌和/或酵母生物的基因。本發(fā)明的序列優(yōu)選為足夠的，以便能夠?qū)υ撔?列部分形成探針目標(biāo)雙鏈體。本發(fā)明也提供目標(biāo)真菌或酵母生物的診斷試劑盒，其含有寡核苷酸探針，所述探 針與本發(fā)明的寡核苷酸(其可以是合成的)實質(zhì)上同源或?qū)嵸|(zhì)上互補(bǔ)。應(yīng)該理解，適合用作 體外擴(kuò)增引物的序列也可以適合用作寡核苷酸探針，盡管優(yōu)選擴(kuò)增引物可以具有約15個 核苷酸到約30個核苷酸(更優(yōu)選為約15到約23、最優(yōu)選為約20到約23)之間的互補(bǔ)部 分，本發(fā)明的寡核苷酸探針可以是任何適合的長度。技術(shù)人員應(yīng)該理解，取決于選擇的寡核 苷酸探針的長度、性質(zhì)和結(jié)構(gòu)(例如，用于LightCycler的雜交探針對、Taqman 5’外切核 酸酶探針、發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)等)以及序列，將要求不同的雜交和/或退火條件。本發(fā)明的試劑盒和分析也可以被這樣提供，其中，寡核苷酸探針被固定于表面上。 這樣的表面可以是珠子、膜、柱、浸染棒(dipstick)、納米顆粒、反應(yīng)室的內(nèi)表面，如診斷平 板的孔或反應(yīng)管的內(nèi)部、毛細(xì)管或管(vessel)或類似物。目標(biāo)真菌生物可以選自煙曲霉、費希新薩托菌、棒曲霉(A.clavatus)、黑曲霉、 土曲霉、黃曲霉、雜色曲霉(A. versicolor)和構(gòu)巢曲霉(A. nidulans)。目標(biāo)酵母生物可以是念珠菌屬種類光滑念珠菌。在這些情況下，本發(fā)明的擴(kuò)增引物和寡核苷酸探針可以針對基因特異性或?qū)偬禺愋詤^(qū)域來設(shè)計，以便能夠鑒定目標(biāo)酵母生物群體中的一個或更多個、或大部分、或幾乎全部 的期望生物。目標(biāo)真菌生物可以是針對已經(jīng)被試驗證明了的給定引物組的曲霉屬種類，并且更 優(yōu)選地，選自煙曲霉、棒曲霉、黑曲霉、土曲霉、黃曲霉、雜色曲霉和構(gòu)巢曲霉。檢測樣品可以包括目標(biāo)真菌和/或酵母生物的細(xì)胞。方法也可包括從可能存在于 所述檢測樣品中的目標(biāo)真菌或酵母生物的任何細(xì)胞中釋放核酸的步驟。理想的是，檢測樣 品是從患者中獲得的樣品(如拭子或血液、尿、唾液、支氣管灌洗液、牙齒樣本、皮膚樣本、 頭皮樣本、移植器官活組織檢查、糞便、粘液或排出物樣品)的溶解產(chǎn)物。檢測樣品可以是 食物樣品、水樣品、環(huán)境樣品、終產(chǎn)物、終產(chǎn)品或加工中的工業(yè)樣品。本發(fā)明也提供了 SEQ ID NO. 1到SEQ ID NO. 35中任一種在一種或更多種酵母或 真菌種類的存在情況的診斷檢測中的應(yīng)用。所述種類可以選自光滑念珠菌、煙曲霉、費希 新薩托菌、棒曲霉、黑曲霉、土曲霉、黃曲霉、雜色曲霉和構(gòu)巢曲霉。本發(fā)明也提供用于臨床診斷學(xué)、治療診斷學(xué)、食品安全診斷學(xué)、工業(yè)微生物診斷 學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、獸醫(yī)診斷學(xué)、生物恐怖主義診斷學(xué)的試劑盒，其含有一種或更多種本發(fā)明的 合成寡核苷酸。該試劑盒也可以包含選自下列的一種或更多種物品合適的樣品收集儀器、 試劑容器、緩沖液、標(biāo)記部分、溶液、去污劑和補(bǔ)充溶液。本發(fā)明也提供本發(fā)明的序列、組合 物、核苷酸片段、分析和試劑盒在治療診斷學(xué)、食品安全診斷學(xué)、工業(yè)微生物診斷學(xué)、環(huán)境監(jiān) 測、獸醫(yī)診斷學(xué)、生物恐怖主義診斷學(xué)中的應(yīng)用。核酸分子、組合物、試劑盒或方法可以用于基于診斷核酸的分析中，以便檢測真菌 和/或酵母種類。核酸分子、組合物、試劑盒或方法可以用于診斷分析中，以檢測患者中的真菌和/ 或酵母滴度。滴度可以在體外測量。核酸分子、組合物、試劑盒或方法可以用于評估被設(shè)計以減少患者中真菌和/或 酵母滴度的治療方案的功效的方法中，其包括評估在治療方案的一個或更多個關(guān)鍵時期患 者中的真菌和/或酵母滴度(通過體內(nèi)方法或體外方法)。適當(dāng)?shù)年P(guān)鍵時期可以包括治 療前、治療過程中和治療后。治療方案可以包含抗真菌劑，如藥物。核酸分子、組合物、試劑盒或方法可以用于診斷分析中，以測量潛在的真菌和/或 酵母污染物，例如，在醫(yī)院中。核酸分子、組合物、試劑盒或方法可以用于識別和/或表征一種或更多種破壞劑， 所述破壞劑可以用于破壞SWI5基因功能。合適的破壞劑可以選自反義RNA、PNA、siRNA。附圖簡述

圖1 煙曲霉SWI5基因中選擇的引物結(jié)合部位。感興趣的區(qū)域(1、2和3)加有下 劃線(區(qū)域1的位置38到472。區(qū)域2的位置1034-1241。區(qū)域3的位置1423-1627)。圖2 在SWI5的擴(kuò)增片段(感興趣的區(qū)域1)中煙曲霉探針Pl-AspSWI5_l的結(jié)合 部位(有下劃線和粗體的部分)。PCR引物AspSWI5-l-F/AspSWI5-l-R被突出顯示。圖3 在SWI5的擴(kuò)增片段(感興趣的區(qū)域3)中煙曲霉探針Pl-AspSWI5_3的結(jié)合 部位(有下劃線和粗體的部分)。PCR引物AspSWI5-3-F/AspSWI5-3-R被突出顯示。圖4 用TaqMan探針Pl-AspSWI5_l、基于SWI5基因區(qū)域1的煙曲霉實時PCR分析 產(chǎn)生的擴(kuò)增圖。針對來自6個近緣曲霉屬種類和白色念珠菌的一組DNA來檢測分析的特異性。3個煙曲霉菌株被檢測到，并且沒有觀察到與來自其它測試的種類的DNA的交叉反應(yīng)。圖5 用iTaciMan探針Pl-AspSWI5_3、基于SWI5基因區(qū)域3的煙曲霉實時PCR分析 產(chǎn)生的擴(kuò)增圖。針對來自6個近緣曲霉屬種類和白色念珠菌的一組DNA來檢測分析的特異 性。3個煙曲霉菌株被檢測到，并且沒有觀察到與來自其它測試的種類的DNA的交叉反應(yīng)。圖6 煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉和土曲霉SWi5分析的排他性。排他性分析用熱循環(huán) 條件進(jìn)行，所述熱循環(huán)條件包括于95°C 5秒和于60°C 10秒進(jìn)行變性和退火，50個循環(huán)。 探針只檢測它們被設(shè)計針對的種類，沒有觀察到交叉反應(yīng)。圖7 煙曲霉Afum_SWI5_l分析檢測的限度(limit)。煙曲霉分析Afum_SWI5_l的 LOD如下進(jìn)行于95°C 5秒和于60°C 10秒退火，50個循環(huán)。圖8 :SWI5 土曲霉Aterr_SWI5_l分析檢測的限度。結(jié)果顯示土曲霉Aterr_SWI5_l分析的L0D。熱循環(huán)條件包括于95°C 5秒和于60°C 10秒退火，50個循環(huán)。獲得每反應(yīng)IO5細(xì) 胞當(dāng)量的L0D。圖9 煙曲霉Afum_SWI5_2檢測的限度。圖顯示了在煙曲霉Afum_SWI5_2分析上進(jìn)行的LOD分析獲得的結(jié)果。圖a中顯示 的結(jié)果是按照以下獲得的95°C 10秒和60°C 30秒變性和退火，各50個循環(huán)。圖b中顯示 的結(jié)果是按照以下獲得的95°C 5秒和60°C 20秒變性和退火，40個循環(huán)。獲得的LOD是 100 細(xì)胞當(dāng)量(cell equivalent)。圖10 黃曲霉、黑曲霉和土曲霉SWI5_2分析檢測的限度。退火為95°C 5秒和60°C 10秒，45個循環(huán)。顯示在圖c中的黑曲霉分析是唯一成 功的分析，其LOD是10細(xì)胞當(dāng)量。圖11 =SffI5序列信息的主要比對。發(fā)明詳述實施例1材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)曲霉屬種類在沙氏肉湯(Sabouraud broth) (4% wt/vol (重量/體積)的葡萄糖、 1% wt/vol的蛋白胨、1.5%的瓊脂)或瓊脂中于25°C培養(yǎng)3-4天。DNA 提取在DNA分離前，用溶細(xì)胞酶或消解酶預(yù)處理曲霉屬菌種。用MagNA純化體系(MagNA Pure System) (Roche Molecular Systems)聯(lián)合MagNA純化酵母和細(xì)菌分離試劑盒III，根 據(jù)廠商指示，從曲霉屬菌種分離DNA。曲霉屬菌種中SWI5基因區(qū)域的DNA測序曲霉屬種類SWI5基因的可公開得到的序列從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫獲得，并用 Clustal W比對。PCR引物的聯(lián)合被用于擴(kuò)增與煙曲霉bp 1到bp 2319相當(dāng)?shù)那箤俜N 類中的SWI5子區(qū)域。例如，PCR引物AspSWI5-l-F/Asp SWI5-1-R被設(shè)計以擴(kuò)增與煙曲 霉XM_749401. 1中bp位置38到472 (區(qū)域1，圖1)相當(dāng)?shù)那箤倬N中的區(qū)域。PCR引 物AspSWI5-2-F/AspSWI5-2-R被設(shè)計以擴(kuò)增與煙曲霉中bp位置10；34到1241(區(qū)域2， 圖1)相當(dāng)?shù)那箤倬N中的區(qū)域。AspSWI5-3-F/AspSWI5-3-R被設(shè)計以擴(kuò)增與煙曲霉XM_749401. 1中bp位置1423到1627(區(qū)域3，圖1)相當(dāng)?shù)那箤倬N中的區(qū)域。在一系 列曲霉屬菌種中，使用表2所列出的試劑和表3所描述的熱循環(huán)條件或其修改，在iCycler BioRad PCR儀或PTC200Peltier熱循環(huán)儀(MJ Research)上擴(kuò)增SWI5基因區(qū)域。用 羅氏高純度 PCR 產(chǎn)物純化試劑盒(Roche High Pure PCR Product Purification kit) 或ExoSAP-IT試劑盒(ExoSAP-IT kit) (USB)，根據(jù)廠商指示，純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物，發(fā)送到 Sequiserve，Germany用于測序，并用正向擴(kuò)增弓|物AspSWI5-1-F或AspSWI5-3-F進(jìn)行測序。 產(chǎn)生了如下的DNA序列信息針對5個曲霉屬種類(煙曲霉、構(gòu)巢曲霉、棒曲霉、黑曲霉、黃 曲霉)和費希新薩托菌產(chǎn)生了曲霉屬區(qū)域1序列信息。針對3個曲霉屬種類(煙曲霉、構(gòu) 巢曲霉、黑曲霉)和費希新薩托菌產(chǎn)生了曲霉屬區(qū)域3序列信息。表1 設(shè)計用于擴(kuò)增曲霉屬菌種中SWI5基因區(qū)域的PCR引物。
引物名稱引物序列AspSWI5-l-FATCGACAACATCGTCGGCAGAAspSWI5-l-RGCTGTTGCTGTTGCATCAGATTAspSWI5-2-FTAGCCGCCATGCCMGCAspSWI5-2-RCCAGTCTCTTTGATAGAAGCAAspSWI5-3-FCGTGGACATGACCTG AAGCAspSWI5-3-RGTCTCTCCTCCAACTCTGGIFATGTTAGCCAATCCACIRATTCCAGGCACCG2FCTTGAGGGCCAAATC2RCTCGTCCTTTCAATCC3FACTATGCCTCGTCG3RAGCGAATACATTGCC4FACAAACCATATGAATGTC4RGCAGGCTCGGTT5FCCTCGAGAAGATCGT5RCTAGCAGTCCATGMG 表2 用于擴(kuò)增曲霉屬菌種中SWI5基因區(qū)域的PCR試劑。
權(quán)利要求
1.真菌或酵母種類的診斷試劑盒，所述試劑盒含有能夠與至少部分SWI5基因或其相 應(yīng)mRNA結(jié)合的寡核苷酸探針。
2.權(quán)利要求1至3中任一項所述的試劑盒，其中所述SWI5基因的所述部分是曲霉屬 (Aspergillus) SWI5基因從堿基對位置1到堿基對位置2319的基因區(qū)域的一部分。
3.權(quán)利要求1至3中任一項所述的試劑盒，其中所述SWI5基因的所述部分是曲霉屬 SffI5基因從堿基對位置38到堿基對位置472、或者從堿基對位置1423到堿基對位置1627 的基因區(qū)域的一部分。
4.任一前述權(quán)利要求所述的試劑盒，包含針對所述曲霉屬SWI5基因從堿基對位置1到 堿基對位置2319、從堿基對位置38到堿基對位置472和從堿基對位置1423到堿基對位置 1627的基因區(qū)域的一部分的探針。
5.任一前述權(quán)利要求所述的診斷試劑盒，其中所述探針選自SEQID NO 17、18、42、45、48、51、M、61、64或67，或者也可以充當(dāng)探針的與其實質(zhì)上相似或互補(bǔ)的序列。
6.任一前述權(quán)利要求所述的試劑盒，還包含用于擴(kuò)增至少部分所述SWI5基因的引物。
7.任一前述權(quán)利要求所述的試劑盒，包含針對部分所述SWI5基因的正向和反向引物。
8.任一前述權(quán)利要求所述的試劑盒，包含至少一種正向體外擴(kuò)增引物和至少一種反向 體外擴(kuò)增引物，所述正向擴(kuò)增引物選自SEQ ID NO 1、3、5、7、9、11、13、15、36、38、40、43、46、49、52、55、58、59、62或65，或者也可以充當(dāng)正向擴(kuò)增引物的與其實質(zhì)上相似或互補(bǔ)的序 列，以及所述反向擴(kuò)增引物選自 SEQID NO 2、4、6、8、10、12、14、16、37、39、41、44、47、50、53、 56、57、60、63或66、也可以充當(dāng)反向擴(kuò)增引物的與其實質(zhì)上相似或互補(bǔ)的序列。
9.權(quán)利要求8所述的診斷試劑盒，其基于直接核酸檢測技術(shù)、信號擴(kuò)增核酸檢測技術(shù)， 并且核酸體外擴(kuò)增技術(shù)選自下列一種或更多種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (LCR)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、分支DNA 技術(shù)(bDNA)以及滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCAT)或其它基于酶體外擴(kuò)增的技術(shù)。
10.核酸分子，其選自SEQID NO 1到SEQ ID NO 95，以及與其或其部分實質(zhì)上同源 或?qū)嵸|(zhì)上互補(bǔ)且在基于所述SWI5基因的診斷學(xué)中具有功能的序列。
11.核酸分子，其含有寡核苷酸，所述寡核苷酸具與權(quán)利要求10所述的核酸分子的一 部分實質(zhì)上同源或?qū)嵸|(zhì)上互補(bǔ)的序列。
12.檢測檢測樣品中的目標(biāo)生物的方法，包括以下步驟(i)在適當(dāng)?shù)臈l件下，將所述檢測樣品與能夠與至少部分SWI5基因或其相應(yīng)mRNA結(jié)合 的至少一種寡核苷酸探針混合；( )在高度嚴(yán)格條件下，將可能存在于所述檢測樣品中的任何核酸與所述寡核苷酸雜 交，形成探針目標(biāo)雙鏈體；和(iii)確定探針目標(biāo)雙鏈體是否存在，所述雙鏈體的存在明確識別出所述檢測樣品 中所述目標(biāo)生物的存在。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述探針選自SEQID NO 17、18、42、45、48、51、54、 61、64或67，或者也可以充當(dāng)所述SWI5基因的探針的與其實質(zhì)上同源或?qū)嵸|(zhì)上互補(bǔ)的序 列。
14.權(quán)利要求10或11中任意一項所述的核酸分子在檢測真菌和/或酵母種類中一種 或更多種的存在情況的診斷分析中的應(yīng)用。
15.權(quán)利要求1至9中任意一項所述的試劑盒或權(quán)利要求10或11中任意一項所述的 核酸分子在測量患者中真菌和/或酵母滴度的診斷分析中的應(yīng)用。
16.評估被設(shè)計以減少患者中真菌和/或酵母滴度的治療方案的功效的方法，其包括 在所述治療方案的一個或更多個關(guān)鍵時期應(yīng)用權(quán)利要求1至9中任意一項所述的試劑盒或 權(quán)利要求10或11中任意一項所述的核酸分子。
17.權(quán)利要求1至9中任意一項所述的試劑盒或權(quán)利要求10或11中任意一項所述的 核酸分子在對環(huán)境中真菌和/或酵母污染物的診斷分析中的應(yīng)用。
18.權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其中，所述環(huán)境是醫(yī)院；食物樣品；環(huán)境樣品，例如水； 工業(yè)樣品，如需要生物負(fù)載或質(zhì)量評估的加工中樣品或終產(chǎn)品。
19.權(quán)利要求1至9中任意一項所述的試劑盒或權(quán)利要求10或11中任意一項所述的 核酸分子在識別和/或表征一種或更多種破壞劑中的應(yīng)用，所述破壞劑可以用于破壞所述 SWI5基因功能。
20.權(quán)利要求19所述的應(yīng)用，其中，所述破壞劑選自反義RNA、PNA、siRNA。
21.試劑盒，其實質(zhì)上如本文中參考附圖所述。
22.核酸，其實質(zhì)上如本文中參考附圖所述。
23.方法，其實質(zhì)上如本文中參考附圖所述。
全文摘要
本發(fā)明涉及SWI5基因、相應(yīng)的RNA、特異性探針、引物和與其有關(guān)的寡核苷酸，以及它們在檢測和/或區(qū)分真菌和酵母種類的診斷檢測中的應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/68GK102105600SQ200980129338
公開日2011年6月22日 申請日期2009年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月13日
發(fā)明者L·奧’考納爾, M·簡克威茲, M·馬赫, N·圖伊特, S·拉黑夫, T·G·巴里, T·J·史密斯 申請人:愛爾蘭國立高威大學(xué)