專利名稱：：一種釀酒酵母及其篩選方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說是一種釀酒酵母及其篩選方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：釀酒酵母屬于真菌屬，酵母菌科，是兼性厭氧微生物，有氧時(shí)，酵母菌則進(jìn)行有氧呼吸，新陳代謝旺盛，繁殖快；缺氧時(shí)進(jìn)行無氧呼吸，產(chǎn)生酒精和二氧化碳。菌體呈圓形、卵形或橢圓形，內(nèi)有細(xì)胞核、液泡和顆粒體物質(zhì)。通常以出芽繁殖；有的能進(jìn)行二等分分裂；有的種類能產(chǎn)生子囊孢子。廣泛分布于自然界，尤其在葡萄及其他各種果品和蔬菜上更多，是重要的發(fā)酵素，能分解碳水化合物產(chǎn)生酒精和二氧化碳等。生產(chǎn)上常用的有面包酵母、飼料酵母、酒精酵母和葡萄酒酵母等?，F(xiàn)用的釀酒酵母有啤酒酵母、葡萄汁酵母等。這些酵母在啤酒、葡萄酒等各自領(lǐng)域內(nèi)能較好完成發(fā)酵任務(wù)，似用于釀造櫻桃酒時(shí)，得不到很好的發(fā)酵效果。分析原因主要有兩個(gè)一是酵母自身存在一定限制，如對(duì)酸、酒精耐受力較低、發(fā)酵溫度范圍較窄，另一個(gè)原因是櫻桃果肉硬度大、組織致密、酸度糖度較高，現(xiàn)用酵母適應(yīng)不了發(fā)酵條件，致使生長(zhǎng)繁殖速度慢、原料利用率低，影響最終發(fā)酵效果，達(dá)不到要求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一株適用于櫻桃酒、冰櫻桃酒、櫻桃露酒、櫻桃果酒等系列櫻桃酒釀造的菌株。該菌株也可用于葡萄酒及其他果酒的釀造。本發(fā)明所提供的一種適宜于系列櫻桃酒釀造的釀酒酵母菌株，酉良酒酵母SC203(Sacc/araOT_yc"ce"w^at"SC70)，己由中國(guó)微生物保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)進(jìn)行保藏，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2008年12月5號(hào)，保藏編號(hào)為CGMCCN0.2786。本發(fā)明釀酒酵母SC203的基本生理特征細(xì)胞圓形、卵圓形或洋梨形；在顯微鏡下觀察，該菌叢呈圓形，乳白色，邊緣整齊，凸起；在幼年菌落中，細(xì)胞為4-14x3-7微米，長(zhǎng)和寬的比率是l:1-1:2;在麥汁屮沉淀；子囊孢子圓形，平滑。本發(fā)明釀酒酵母SC203菌株是通過篩選，選育出的乙醇脫氫酶基因缺失或不表達(dá)的變異菌株，具有能耐受高濃度酒精、酸、二氧化硫的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明釀酒酵母SC203菌株同現(xiàn)在所使用的其他釀酒酵母菌菌株及原出發(fā)菌株相比，能耐受較高濃度的酒精和酸；其發(fā)酵周期比現(xiàn)有酵母縮短20%;S02耐受能力達(dá)到260mg/L;降糖能力范圍在30%-40%之間；發(fā)酵糖度在12%40%之間；低溫發(fā)酵能力較強(qiáng)，在5-15'C時(shí)，還能進(jìn)行較活躍的發(fā)酵活動(dòng)，且在此條件下具有良好發(fā)酵生產(chǎn)能力。本發(fā)明還提供了一種篩選和培養(yǎng)釀酒酵母SC203的方法。本發(fā)明所述的篩選和培養(yǎng)釀酒酵母SC203的具體操作方法如下(1)篩選從萊州大紅櫻桃園內(nèi)土壤中篩選分離純化釀酒酵母A、取大紅櫻桃園內(nèi)表層以下5-10cm的土壤0.5g，倒入帶玻璃珠的無菌水瓶中振蕩5-10min，此為10—2的土壤懸液，用無菌移液管吸10—s的土壤懸液0.5ml，放入4.5ml無菌水中，制成10^稀釋液，如此重復(fù)，依次制成10久10;的稀釋液；B、在超凈工作臺(tái)上，取融化后降溫至約5(TC的葡萄糖酵母膏(YPD)固體培養(yǎng)基約20ml倒入平板，在培養(yǎng)基中加入0.1-100mg/L濃度的抑制細(xì)菌的抗生素(如青霉素)，待培養(yǎng)基凝固后，取A歩驟制取的稀釋液0.05-0.1ml分別加入四個(gè)平板上，用三角刮鏟將菌液均勻涂布于平板表面；C、將制備好的平板置于23-28°〇培養(yǎng)箱'!-'培養(yǎng)2-3d;D、用接種環(huán)挑取經(jīng)純化的各種典型酵母齒齒落至另一新葡萄糖酵母膏固體培養(yǎng)基平板劃線，將平板置于23-28t:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3d;E、持續(xù)D步驟操作，直至菌落完全純化，得到40株純的釀酒酵母菌株。(2)培養(yǎng)用櫻桃汁篩選富集優(yōu)良釀酒酵母菌株A、將新鮮的大紅櫻桃榨汁(原漿濃度12%)，在12rc下滅菌30min;作為篩選富集釀酒酵母培養(yǎng)基。B、櫻桃汁培養(yǎng)基冷卻后分別接入純化后的40株酵母菌，置于23-28'C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3-7d。C、由菌落的顏色判定酵母產(chǎn)酒精的能力，挑選紅色的菌落作為初篩入選菌。D、復(fù)篩是在加有杜氏小管的大試管液體培養(yǎng)基中，接入分離的斜面菌種，25。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔6h記錄菌體生長(zhǎng)及發(fā)酵情況。將有典型酒香生成、氣泡較多的酵母菌作為復(fù)篩入選菌。E、將效果較好的20株酵母菌選出，分別進(jìn)行耐S02能力、發(fā)酵糖能力和耐糖能力等性能方面的研究；F、耐S02能力實(shí)驗(yàn)分別接種篩選出的酵母，在S02濃度為80、120、140、200、300mg/L時(shí)，發(fā)酵一周的過程中，觀察發(fā)酵液可溶性固形物含量隨時(shí)間的變化情況。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)SO2濃度較低(〈230mg/L)時(shí)，濃度高低對(duì)酵母死亡率影響不顯著，而當(dāng)SO2濃度達(dá)到300mg/L時(shí)，影響顯著。20株酵母中，S02耐受能力較高的菌株，達(dá)到280mg/L260mg/L;G、降糖能力實(shí)驗(yàn)可溶性固形物(原漿)濃度15%、30%、40%、50%時(shí)，觀察酵母的降糖速度和生長(zhǎng)滯后期時(shí)間。實(shí)驗(yàn)表明，原漿濃皮在15%時(shí)，各個(gè)酵母菌株都能較快地利用糖，開始迅速降糖，發(fā)酵液屮酒精含量也相應(yīng)地迅速增加。當(dāng)nJ溶性固形物含量卨于40。/。時(shí)，大部分酵母的生fc在發(fā)酵的初期受到了一定的影響。表現(xiàn)為酵母的生長(zhǎng)滯后期變長(zhǎng)(由2d變到4d)。在高糖濃度50%時(shí)，各酵母發(fā)酵性能均受到很大程度的抑制。從整體上來看，降糖能力最強(qiáng)的酵母菌株，適宜范圍在30%-40%之間H、耐糖能力實(shí)驗(yàn)隨著發(fā)酵液的可溶性固形物含量從30%升高到50%，酵母菌總數(shù)下降(從7.6降到6.46.8)，死亡率升高。這一現(xiàn)象說明高糖濃度對(duì)酵母的生長(zhǎng)有很大影響。表現(xiàn)出較高的耐糖性的酵母在各種濃度下的生長(zhǎng)能力均比其他酵母強(qiáng)，適合發(fā)酵糖度在]2%40%之間。I、低溫發(fā)酵能力實(shí)驗(yàn)發(fā)酵溫度分別設(shè)置5'C、15°C、25°C、35°C、45。C時(shí)，觀察酵母的繁殖速度。實(shí)驗(yàn)表明，原漿濃度在25-35。C時(shí)，各個(gè)酵母菌株都能較快繁殖。當(dāng)溫度低于15'C和高于35"C時(shí)，大部分酵母的生長(zhǎng)受到了較大的影響。當(dāng)溫度在5"C時(shí),各酵母發(fā)酵性能受到很大程度的抑制。從整體上來看，低溫發(fā)酵能力較強(qiáng)，的酵母菌株在5-15t:時(shí)，還能進(jìn)行較活躍的發(fā)酵活動(dòng)。綜合上述各項(xiàng)酵母發(fā)酵能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選出綜合效果較好的酵母菌種進(jìn)行復(fù)篩。J、將復(fù)篩入選菌種，按5%的接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，于25。C生化培養(yǎng)箱中發(fā)酵7d，從發(fā)酵性能和發(fā)酵產(chǎn)物感官評(píng)定等方面綜合評(píng)價(jià)，選取綜合性能最佳，發(fā)酵后酒體果香濃郁，口味純正，風(fēng)格獨(dú)特，酒精度在10度以上的菌種作為入選菌種，并將其命名為釀酒酵母SC203(S"cc/z"ra附y(tǒng)ce5"w由/"e經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)，故將其與四種商業(yè)酵母進(jìn)行發(fā)酵性能比較。K、釀酒酵母SC203與商品酵母發(fā)酵能力比對(duì)選擇四種商業(yè)酵母，R2、DVIO、D254、RC212，分別進(jìn)行耐S02能力、發(fā)酵糖能力和耐糖能力、發(fā)酵溫度四方面的比較。比較結(jié)果見下表1。表1釀酒酵母SC203與四中商業(yè)釀灑fil./:j.發(fā)酵能力對(duì)比《<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>通過比對(duì)試驗(yàn)，釀酒酵母SC203綜合性能明顯優(yōu)于這四種商業(yè)酵母，適用于系列櫻桃酒的釀造，也可用于其它類型酒類釀造。(4)種子培養(yǎng)釀酒酵母SC203要經(jīng)過四級(jí)液體種子培養(yǎng)。A、菌種斜面培養(yǎng)菌種接種在YPD斜面上，置于23-28'C于生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)12-48小時(shí)；B、大試管培養(yǎng)將上述YPD斜面上的菌種接入裝有5-10ml無菌麥汁液體培養(yǎng)基大試管，置于22-30。C搖床振蕩培養(yǎng)12-48小時(shí)；C、三角瓶一級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)上述試管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于裝有50-150ml麥芽汁的250ml三角瓶中，置于22-3(TC搖床振蕩培養(yǎng)12-48小時(shí)；D、酵母罐擴(kuò)大培養(yǎng)上述試管菌體密度約為1(f-l()S個(gè)/ml的培養(yǎng)物50mL轉(zhuǎn)接于裝有1500-2500ml麥芽汁的5000ml酵母罐中，，置于22-30。C培養(yǎng)12-48小時(shí)；此時(shí)培養(yǎng)的酵母菌SC203可用于發(fā)酵生產(chǎn)，齒體密度為10、10"個(gè)/ml發(fā)酵液。上述釀酒酵母SC203在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，起始pH值為pH5.8，發(fā)酵過程中控制pH值在5.0-6.5之間。本發(fā)明的釀酒酵母SC203，具有生長(zhǎng)快、起發(fā)早、發(fā)酵周期短、對(duì)低溫、酸、酒精、二氧化硫耐受力強(qiáng)等特點(diǎn)。本發(fā)明所制得的釀酒酵母SC203，特別適合應(yīng)用于原衆(zhòng)櫻桃酒、冰櫻桃酒、櫻桃露酒、櫻桃果酒等的釀造，也可應(yīng)用于葡萄酒、其他果酒以及啤酒的釀造。本發(fā)明所述的釀酒酵母SC203可以單獨(dú)使用，也可以與生香酵母和/或其它釀酒酵母一起作為合酵釀酒酵母在釀酒發(fā)酵生產(chǎn)過程中使用。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例將有助于理解本發(fā)明，但并不能限制本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例1選擇含糖量高、充分成熟的櫻桃鮮果500kg，除掉劣果；洗凈表皮的污物，用3%的雙氧水浸泡，清洗后瀝干水分。榨汁，制成原漿濃度為15%的櫻桃汁，按原漿量0.3。/。。的比例加入150gVc，按料液量1.5。/。接入釀酒酵母SC203，控制SO2濃度150mg/L，進(jìn)行控溫共同發(fā)酵，發(fā)酵溫度為24r，發(fā)酵時(shí)間為10d，主發(fā)酵結(jié)束，立即分離皮渣。控制后發(fā)酵溫度為16r，經(jīng)30d后發(fā)酵醪殘?zhí)荿4g/L，后發(fā)酵停止。陳釀結(jié)束后，硅藻土過濾，殺菌，得原漿櫻桃酒。實(shí)施例2選擇含糖量高、充分成熟的櫻桃鮮果500kg，除掉劣果；洗凈表皮的污物，用3%的雙氧水浸泡，清洗后瀝干水分。榨汁，制成原漿濃度為30%的櫻桃汁，按原漿量0.396。的比例加入150gVc，按料液量1.6。/。接入釀酒酵母SC203和生香酵母(釀酒酵母SC203與生香酵母的比例為2:1)，控制SO2濃度150mg/L，進(jìn)行控溫共同發(fā)酵，發(fā)酵溫度為24。C，發(fā)酵吋間為10d，卞發(fā)酵結(jié)束，立即分離皮渣?？刂坪蟀l(fā)酵溫度為16。C，經(jīng)30d后發(fā)酵醪殘?zhí)荿4g/L，后發(fā)酵停止。陳釀結(jié)束后，硅藻土過濾，殺菌，得度原漿櫻桃酒。實(shí)施例3選擇含糖量高、充分成熟的櫻桃鮮果500kg，除掉劣果；洗凈表皮的污物，用3%的雙氧水浸泡，清洗后瀝干水分。榨汁，制成原漿濃度為30%的櫻桃汁，按原漿量0.3%。的比例加入150gVc，按料液量1.6%接入葡萄酒酵母1450，控制S02濃度150mg/L，進(jìn)行控溫共同發(fā)酵，發(fā)酵溫度為24。C，發(fā)酵時(shí)間為10d，主發(fā)酵結(jié)束，立即分離皮渣?？刂坪蟀l(fā)酵溫度為16°C，經(jīng)30d后發(fā)酵醪殘?zhí)荿4g/L，后發(fā)酵停止。陳釀結(jié)束后，硅藻土過濾，殺菌，得原漿櫻桃酒。表2實(shí)方包例13發(fā)酵結(jié)果比較表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>接種不同酵母，發(fā)酵櫻桃原漿生產(chǎn)櫻桃酒，發(fā)酵結(jié)果如表2所示。從櫻桃酒的理化指標(biāo)和感官指標(biāo)綜合評(píng)定可以得出結(jié)論釀酒酵母SC203的發(fā)酵性能要.W著優(yōu)于葡萄酒酵母1450，而酵母釀灑酵母SC203與生香酵母合酵的發(fā)酵性能要優(yōu)于酏酒酵母SC203單獨(dú)發(fā)酵。實(shí)例4選擇含糖量高、充分成熟的葡萄500kg，除掉劣果；洗凈表皮的污物，用3%的雙氧水浸泡，清洗后瀝干水分。搾汁，按葡萄汁原漿量0.3。/。。的比例加入150gVc，按料液量1.2。/。接入釀酒酵母SC203，控制SO2濃度120mg/L，進(jìn)行控溫共同發(fā)酵，發(fā)酵溫度為25"，發(fā)酵時(shí)間為10d，主發(fā)酵結(jié)束，立即分離皮渣?？刂坪蟀l(fā)酵溫度為15。C，經(jīng)40d后發(fā)酵醪殘?zhí)荢4g/L，后發(fā)酵停止。陳釀結(jié)束后，硅藻土過濾，殺菌，最終得到16度葡萄酒。表3兩種酵母發(fā)酵葡萄酒結(jié)果比較項(xiàng)目總糖揮發(fā)酸總一.氧化干浸出物酒度Cg/L)g/L碳，m|/L9/L%(vol)釀酒酵母0.60.5132.128.112.5SC203葡萄酒酵母0.90.8185,819.611.31450國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)24.0化0S200218.027.0由表可知，釀酒酵母SC203、葡萄酒酵母1450發(fā)酵生產(chǎn)的葡萄酒理化指標(biāo)都符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。釀酒酵母SC203的發(fā)酵結(jié)果較葡萄酒酵母1450的發(fā)酵結(jié)果好。權(quán)利要求1.一種釀酒酵母菌株釀灑酵母SC203(SaccharomycescerevisiaeSC203)，由中國(guó)微生物保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行保藏，保藏編號(hào)為CGMCCNO.2786。2.如權(quán)利要求1所述的釀酒酵母SC203，其特征是(1)基本生理特征細(xì)胞圓形、卵圓形或洋梨形，在顯微鏡下觀察，該菌叢呈圓形，乳白色，邊緣整齊，凸起。在幼年菌落中，細(xì)胞為4_l4x3_7微米，長(zhǎng)和寬的比率是l:1-1:2;在麥汁中沉淀；子囊孢子圓形，平滑；(2)釀酒酵母SC203菌株是通過篩選，選育出的乙醇脫^酶基因缺失或不表達(dá)的變異菌株，具有能耐受卨濃度酒精、酸、二氧化硫的優(yōu)點(diǎn)；3.如權(quán)利要求1所述的釀酒酵母SC203的篩選培養(yǎng)方法，其特征在于(1)篩選從萊州大紅櫻桃園內(nèi)土壤中篩選分離純化釀酒酵母菌A、取大紅櫻桃園內(nèi)表層以下5-10cm的土壤0.5g，倒入帶玻璃珠的無菌水瓶(無菌水95ml)中振蕩5-10min，制成10—2的土壤懸液，用無菌移液管吸10_2的土壤懸液0.5ml，放入4.5ml無菌水中，制成10—3稀釋液，如此重復(fù)，依次制成10—3-10-7的稀釋液；B、在超凈工作臺(tái)上，取融化后降溫至約5(TC的葡萄糖酵母膏(YPD)固體培養(yǎng)基倒平板，在平板中注入約20ml的培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中加入0.1-100mg/L濃度的抑制細(xì)菌的抗生素，待培養(yǎng)基凝固后，取上述稀釋液0.05-0.1ml分別加入四個(gè)平板上，用三角刮鏟將菌液均勻涂布于平板表面；C、將制備好的平板置于23-28'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3d;D、用接種環(huán)挑取經(jīng)純化的各種典型酵母菌菌落至另一新葡萄糖酵母膏固體培養(yǎng)基平板劃線，將平板置于23-28。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3d;E、持續(xù)D步驟操作，直至菌落完全純化，得到40株純的酵母菌株。(2)用櫻桃汁富集篩選優(yōu)良釀酒酵母菌株，其具體方法為A、櫻桃汁(原漿濃皮12%),12rC滅齒30min;B、分別接入純化后的酵母菌，置于23-28。C培養(yǎng)箱「1-'培養(yǎng)2-3d;C、將效果較好的20株酵母菌進(jìn)行發(fā)酵能力實(shí)驗(yàn)，從中挑選出綜合指標(biāo)最好的釀酒酵母菌株；D、將選出的綜合性能優(yōu)越的菌株與四株商品釀酒酵母進(jìn)行性能比對(duì)；F、篩選出的釀酒酵母要經(jīng)過四級(jí)種子培養(yǎng)。(如權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征是所述釀酒酵母SC203經(jīng)過四級(jí)液體種子培養(yǎng)，其具體方法為-A、菌種斜面培養(yǎng)菌種接種在YPD斜面上，置于23-28"C于生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)12-48小時(shí)；B、大試管培養(yǎng)將i:述YPD斜面上的菌種接入裝有5-10ml無菌麥汁液體培養(yǎng)基大試管，置于22-3(TC搖床振蕩培養(yǎng)12-48小時(shí)；C、三角瓶一級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)上述試管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于裝有50-150ml麥芽汁的250ml三角瓶中，置于22-3(TC搖床振蕩培養(yǎng)12-48小時(shí)；D、酵母罐擴(kuò)大培養(yǎng)上述試管菌體密度約為107-108個(gè)/1111的培養(yǎng)物50mL轉(zhuǎn)接于裝有1500-2500ml麥芽汁的5000ml酵母罐中，，置于22-3(TC培養(yǎng)12-48小時(shí)；此時(shí)培養(yǎng)的酵母菌SC203可用于發(fā)酵生產(chǎn)，菌體密度為10、10"個(gè)/ml發(fā)酵液。4.<image>imageseeoriginaldocumentpage3</image>5如權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征是所述釀酒酵母SC203在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，起始pH值為pH5.8，發(fā)酵過程中控制pH值在5.0-6.5之間。6.如權(quán)利要求1所述的釀酒酵母SC203菌株的應(yīng)用，其特征是用于櫻桃酒、冰櫻桃酒、櫻桃露酒、櫻桃果酒的釀造。7.如權(quán)利要求1所述的釀酒酵母SC203的應(yīng)用，其特征是可以用于葡萄酒和其它果酒的釀造，也可以用于啤酒的釀造。8.如權(quán)利要求7所述的l'狼酒酵母SC203的應(yīng)j目，其特征是n了以單獨(dú)使川，也可以與生香酵母和/或其它酵母合川。全文摘要本發(fā)明涉及一種適宜于系列櫻桃酒釀造的釀酒酵母的篩選及應(yīng)用，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明的釀酒酵母SC203菌株，已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行保藏，登記編號(hào)為CGMCCNo.2786。本發(fā)明菌株具有生長(zhǎng)快、起發(fā)早、發(fā)酵周期短、對(duì)低溫、酸、酒精、二氧化硫耐受力強(qiáng)等特點(diǎn)，是一株適用于櫻桃酒、冰櫻桃酒、櫻桃露酒、櫻桃果酒等系列櫻桃酒釀造的菌株。此外，本發(fā)明菌株也可用于葡萄酒及其他普通果酒和冰酒的釀造。文檔編號(hào)C12R1/865GK101550400SQ20091001368公開日2009年10月7日申請(qǐng)日期2009年1月22日優(yōu)先權(quán)日2009年1月22日發(fā)明者于磊娟,林曹,李敬龍,王超萍申請(qǐng)人:李敬龍;曹林