一株絲孢酵母菌及其在金納米顆粒合成中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株絲孢酵母菌及其在金納米顆粒合成中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景
[0002]金納米顆粒(AuNPs)由于其抗氧化性、生物相容性和穩(wěn)定性，在微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境傳感及電子學(xué)中應(yīng)用廣泛。已有的AuNPs合成法均具有一定的局限性。物理合成法中可以通過(guò)優(yōu)化激光脈沖時(shí)間及作用溫度，合成顆粒尺寸小(直徑〈10 nm)、尺寸分布均一的AuNPso但是這些方法需要高溫高壓條件和復(fù)雜的儀器裝置。而在化學(xué)還原合成方法中常使用的難降解非極性有機(jī)物會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生負(fù)面影響。溶膠凝膠法比起其他物理化學(xué)方法，能夠獲得尺寸和形狀分布范圍更小的AuNPs。然而，溶膠凝膠合成法需要使用有毒封端劑來(lái)防止納米顆粒的聚合。相比較以上方法，微生物優(yōu)勢(shì)明顯，其合成過(guò)程簡(jiǎn)單可控且環(huán)境友好。微生物可以通過(guò)金屬的生物還原過(guò)程，合成金屬納米粒子，從周圍的環(huán)境中移除可溶性金屬，從而減少可溶性金屬的毒性。
[0003]真菌是一類重要的微生物資源，相比較細(xì)菌而言，可以分泌大量合成納米顆粒相關(guān)的胞外酶、多肽類物質(zhì)及次級(jí)代謝產(chǎn)物等，合成的納米顆粒產(chǎn)量高、易與真菌分離，可用于納米顆粒的大規(guī)模生產(chǎn)。真菌合成法具有兩個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn):環(huán)境影響小，生產(chǎn)成本低。這是因?yàn)椋⑸镆钥稍偕姆绞缴a(chǎn)，生產(chǎn)過(guò)程中只需要生物還原和限制、穩(wěn)定劑，不需要外源化學(xué)物質(zhì)。此外由于生物分子模板和無(wú)機(jī)材料的特異性相互反應(yīng)，可以產(chǎn)生所需形狀和大小的AuNPs以滿足特定的應(yīng)用要求。
[0004]目前已有真菌及其代謝產(chǎn)物還原Au3+Au+合成金納米顆粒的相關(guān)報(bào)道。Du等人于2011年報(bào)道了利用200個(gè)真菌菌屬用于金屬納米顆粒合成的系統(tǒng)研宄，研宄表明只有Verticillium sp.和/7.<0^5770/??兩個(gè)物種能夠產(chǎn)生金屬納米顆粒。其中真菌Verticillium sp.在細(xì)胞表面形成外形尺寸均一、單分散性良好的AuNPs。Agnihotri等人于2009年報(bào)道利用熱帶海洋酵母菌Yarrowia lipolytica NCIM 3589在不同pH下形成AuNPs尺寸不同，其中在pH 2條件下形成規(guī)則的三角形和五邊形結(jié)構(gòu)。在快速合成AuNPs方面，Du等人報(bào)道了以sp.1-208的細(xì)胞濾液中實(shí)現(xiàn)了快速生物合成，其中定量生物還原與AuNPs的合成不到5 min。Priyadarshini等人于2014年報(bào)道了 AspergillusterreiAs也可在幾分鐘內(nèi)即可還原產(chǎn)生AuNPs。本專利涉及的絲孢酵母菌{ Trichosporod)是一種廣泛存在的真菌，其中部分種與污水處理相關(guān)，還有若干種可以產(chǎn)生生物表面活性劑及產(chǎn)微生物柴油，而關(guān)于絲孢酵母菌合成AuNPs的研宄至今還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一株絲孢酵母菌以及采用該菌株催化HAuCl4合成金納米顆粒的方法，該菌株在生物合成納米材料領(lǐng)域中具有應(yīng)用價(jià)值。
[0006]本發(fā)明涉及一株絲孢酵母菌(拉丁文分類命名為:Trichosporonmontevideense)，所述菌株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC N0.10368，保藏日期為2015年I月19日；菌株的26S rRNA基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的登記號(hào)為KP676895。
[0007]該菌株分離自本實(shí)驗(yàn)室反應(yīng)器污泥，該菌株生長(zhǎng)采用的培養(yǎng)基為改良馬丁固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基，所述液體培養(yǎng)基組成為:葡萄糖10 g/L，(NH4)2SO4 I g/L,MgSO4 0.5 g/L，K2HP04 I g/L, pH 7;并加入四環(huán)素50 mg/L ;土霉素50 mg/L，所用的固體培養(yǎng)基為對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基中加入2 wt%瓊脂，固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基均在115°C濕熱滅菌20 min后使用。
[0008]該菌株具有合成金納米顆粒的能力:將2 mL的菌液中加入1.0 mmol/L HAuCl4溶液，在30°C，150 rpm條件下孵育10 min即可達(dá)到產(chǎn)生金納米顆粒的最大值，金納米顆粒呈球形、五邊形等不同形態(tài)。
[0009]本發(fā)明的有益效果是:該菌株分離自本溪鋼鐵焦化廠的活性污泥，在含有四環(huán)素和土霉素的改良馬丁液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的最適溫度為30°C，最適pH為6，該菌株可催化HAuCl4^成不同形態(tài)的金納米顆粒。該菌株為金納米材料的快速生物制備提供一種新的微生物資源，在生物合成納米材料領(lǐng)域中具有應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1絲孢酵母菌WIN的系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0011 ]圖2絲孢酵母菌WIN的在改良馬丁培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。
[0012]圖3絲孢酵母菌WIN掃描電鏡圖片。
[0013]圖4不同pH對(duì)絲孢酵母菌WIN生長(zhǎng)的影響。
[0014]圖5不同溫度對(duì)絲孢酵母菌WIN生長(zhǎng)的影響。
[0015]圖6絲孢酵母菌WIN合成金納米顆粒紫外-可見光全波長(zhǎng)掃描。
[0016]圖7絲孢酵母菌WIN合成金納米顆粒的透射電鏡表征。
[0017]圖8絲孢酵母菌WIN合成金納米顆粒的元素分析。
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例1:菌株的獲得
本申請(qǐng)中的絲孢酵母菌分離自本溪鋼鐵焦化廠的活性污泥。前期先將所取泥樣置于微生物反應(yīng)器中馴化培養(yǎng)，60天后取2 mL反應(yīng)器泥水混合物，采用平板稀釋涂布法，將泥水混合物稀釋涂布在含四環(huán)素和土霉素的固體改良馬丁液體培養(yǎng)基(葡萄糖10 g/L,(NH4)2SO4 I g/L，MgSO4 0.5 g/L，K2HPO4 I g/L，四環(huán)素 0.05 g/L ;土霉素 0.05 g/L, pH 7，瓊脂2 wt%)上，于30°C下培養(yǎng)5天。培養(yǎng)皿長(zhǎng)出菌落后，挑取少量菌落于含有25 mL液體改良馬丁培養(yǎng)基的50 mL錐形瓶中，于30°C，150 rpm下振蕩培養(yǎng)，待菌株生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，吸取少量菌液稀釋進(jìn)行平板涂布。重復(fù)上述操作，直至得到純化的菌株。
[0019]該菌株于2015年I月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所，100101)，登記入冊(cè)編號(hào)為 CGMCC N0.10368。
[0020]實(shí)施例2:菌株的26S rRNA分子鑒定提取絲孢酵母菌WIN的基因組DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增26S rRNA基因序列并測(cè)序，利用BLAST程序?qū)π蛄羞M(jìn)行同源對(duì)比，得到與其最相近的菌種為絲孢酵母菌，二者26S rRNA基因序列相似性為100%，因此判定WIN為絲孢酵母菌。圖1為菌株WIN基因的系統(tǒng)發(fā)育樹。其26S rRNA序列已登錄GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，入藏號(hào)為KP676895。菌株WIN的26Sr RNA基因序列如下。
[0021]>WIN 26S rRNA gene sequenceCTCAAATTTGAAATCTGGCTGTCTTCGATAGTCCGAGTTGTAATCTATAGAAGCGTTTTCCGTGCTGAACT
GTGTCTAAGTCCCTTGGAACAGGGTATCAAAGAGGGTGATAATCCCGTACTTGACAC