專利名稱：一種檢測兔i型膠原蛋白基因的方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術領域，具體涉及一種檢測兔I型膠原蛋白基因的方法及試劑
背景技術：
膠原蛋白是人體和動物的結締組織的主要蛋白，是哺乳動物含量最多，分布最廣的蛋白質，含量能夠占總蛋白的25% 35%，體內具有廣泛的生物學活性。在肌肉組織中它是肌內膜的主要成份，I型膠原蛋白是人體中含量最多的膠原蛋白，瘢痕組織中含量豐富，它也是組織愈合和修復的產物。肌腱、皮膚、動脈血管壁、軟骨以及部分的器官和牙齒中也含有I型膠原蛋白。I型膠原蛋白合成紊亂會導致骨折、輕微脊柱彎曲、關節(jié)松弛、皮膚彈性過度綜合征(cutis hyperelastica)、嬰兒骨外層肥厚(infantile corticalhyperostosis)等疾病。 目前，基因表達水平檢測主要是通過聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction, PCR)來完成，PCR是一項廣泛應用于分子生物學的實驗技術，通過熱穩(wěn)定的TaqDNA polymerase,能夠使模板中的單個或幾個拷貝的基因片斷在經過幾十個熱循環(huán)后進行指數擴增，達到數以百萬計的拷貝。PCR產物經過電泳檢測目的基因的表達量。這種方法是目前比較常用的基因表達相對定量檢測方法，這種方法屬于終點檢測方法，由于不能夠實時的監(jiān)測反應的進行，所以實驗的重復性、可靠性相對較差。 隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，以及光電子技術的進步，近些年來實時熒光定量PCR(Realtime PCR)技術得到了很大的發(fā)展。此技術是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實現了實時監(jiān)測整個PCR進程，對起始模板進行定量分析的方法。應用實時熒光定量PCR技術來檢測基因的表達水平比以往的技術有了很大的進步，實時熒光定量PCR技術能夠全程實時檢測PCR反應的進行，因此具有良好的實驗可靠性，重復性。實時熒光定量PCR有分為熒光染料摻入法和探針法。熒光染料摻入法是在PCR反應體系中加入熒光染料SYBR Green， SYBR Green只有和雙鏈DNA結合后才發(fā)熒光。變性時，DNA雙鏈分開，無熒光信號，因此必須在延伸結束階段采集熒光信號。SYBR Green也能和非特異的雙鏈DNA結合發(fā)光，所以必須在反應結束時做熔解曲線分析產物的特異性。 T叫man探針法T叫man探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團，此時5'端熒光基團吸收能量后將能量轉移給臨近的3'端熒光淬滅基團(發(fā)生熒光共振能量轉移，FRET)，因此探針完整時，檢測不到該探針5'端熒光基團發(fā)出的熒光。隨著引物的退火，產物的不斷擴增，報告熒光基團能夠被DNA聚合酶從探針上剪切下來，探針被打碎，這樣報告熒光基團不再被淬滅，從而不斷發(fā)射出熒光信號。因此應用T叫man探針法能夠快速準確的檢測組織和細胞中基因的表達變化。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種靈敏度高、特異性強的檢測兔I型膠原蛋白基因的方法。 為實現上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案 —種檢測兔I型膠原蛋白基因的方法，包括如下步驟 (i)用核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的下游引物擴增生物樣品； (ii)用探針對擴增產物進行檢測，所述探針序列如SEQ ID NO. 3所示。
優(yōu)選地，步驟(i)所述擴增與步驟(ii)所述檢測同時進行。 更優(yōu)選地，采用實時熒光定量PCR法進行步驟(i)所述擴增與步驟(ii)所述檢測。所述實時熒光定量PCR法反應程序優(yōu)選為95。C lOmin ;95。C 30sec ;58。C lmin ;72。Clmin為一個循環(huán)，設定45個循環(huán)。 更優(yōu)選地，步驟(ii)所述探針為T叫Man探針。所述T叫Man探針其5'端標記6-FAM、 TET、 HEX、 TAMRA、 R0X、 CY5、 CY3、 J0E、 Texas Red其中一種，3'端標記TAMRA、 BHQ-1、Eclipse、 IowaBlack其中——禾中。 本發(fā)明還提供一種檢測兔I型膠原蛋白基因的試劑盒，包含用于擴增核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示的核酸片段的引物。 優(yōu)選地，本發(fā)明所述試劑盒中的引物為核苷酸序列如SEQ ID NO. l所示的核酸片段、核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示的核酸片段中的至少一種。 更優(yōu)選的，本發(fā)明所述試劑盒還包含核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示的探針。
更優(yōu)選的，本發(fā)明所述試劑盒還包含用于檢測兔GAPDH基因的引物和探針；其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，探針序列如SEQ ID NO. 6所示。 本發(fā)明還提供一種用于檢測兔I型膠原蛋白基因的引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO. l所示。 本發(fā)明還提供一種用于檢測兔I型膠原蛋白基因的引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO. 2所示。 本發(fā)明的術語"引物"指作為合成引物延伸產物的起始位點的單鏈寡核苷酸序列，其與待復制的核酸鏈互補，長度和序列必須適合于延伸產物的合成。 本發(fā)明術語"探針"指單鏈寡核苷酸，用于與核酸片段特異性雜交。"特異性雜交"
指所述探針與核酸的整個區(qū)域或一部分在特定的實驗條件下形成雙鏈體，且在這些條件
下，所述探針不與待檢測樣品中存在的其他核酸或核酸的其他區(qū)域形成雙鏈體。 本發(fā)明所述"T叫Man探針"是一種寡核苷酸探針，是在寡核苷酸兩端分別標記一個
報告熒光基團和一個淬滅熒光基團，報告熒光基團連接在探針的5'末端，而淬滅熒光基團
則在3'末端。 所述TaqMan探針的5，端標記6_FAM、 TET、 HEX、 TAMRA、 R0X、 CY5、 CY3、 JOE、 Texas
Red其中一種，探針的3'端標記TAMRA、BHQ-l、Eclipse、 Iowa Black其中一種 探針和核酸片段雜交后，可以通過任意合適的方式，進行雜交的檢測，例如可以檢
測的標記探針和/或核酸片段，為了輔助檢測，優(yōu)選實時熒光PCR法擴增。 本發(fā)明試劑盒還包含PCR緩沖液、dNTPs、 Taq酶、R0X、對照品。對照品分陰性對
照和陽性對照，陰性對照為無菌三蒸水，陽性對照為兔肌肉組織的cDNA樣品。
本發(fā)明所述試劑盒保存條件為-20°〇，盡量避免反復凍融。
本發(fā)明所述試劑盒的使用方法是 將待測樣品兔組織或體外培養(yǎng)細胞用Trizol提取總RNA，提取的總RNA經過逆轉錄為cDNA，建立25ii 1的PCR反應體系如下2. 5ii 1 10XPCR Buffer、0. 3ii 1的R0X、2ii 1的10mM dNTPs、0. 5ii 1的5 y M上游引物0. 5 y 1的5 y M下游引物、兔cDNA2 y 1、0. 5iU的5iiM特異性Taqman探針、Taq酶lU、補充無核酶水至25ii1。反應條件為95。C 30sec ;58。Clmin ;72°C lmin ;45個循環(huán)。 每個樣品分別做3個骨形態(tài)蛋白2和GAPDH反應，并且每次實驗做兔I型膠原蛋白基因和GAPDH陰性對照和陽性對照實驗，將兔cDNA模板以5倍稀釋不同濃度梯度，繪制骨形態(tài)蛋白2兔實時定量PCR標準曲線，根據標準曲線以及實驗所用的相應軟件相對定量樣品中兔I型膠原蛋白基因。 術語"Ct值":為了便于對所檢測樣本進行比較，在實時熒光PCR反應的指數期，首先需設定一定熒光信號的域值， 一般這個域值是以PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設置是3 15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。如果檢測到熒光信號超過域值被認為是真正的信號，它可用于定義樣本的域值循環(huán)數(Ct)。 Ct值的含義是每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環(huán)數。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。 本發(fā)明所述檢測兔I型膠原蛋白基因的方法，對比現有技術的優(yōu)點在于 (1)檢測速度快，效率高，能夠實時檢測PCR反應的結果，不需要電泳和染色過程，
比普通的PCR方法相比步驟簡單、實驗周期短、重復性好； (2)靈敏度高，靈敏度范圍是10-1(^拷貝，可檢測到基因的最小濃度為IO個拷貝； (3)特異性強，與SYBR Green熒光染料嵌入式Real-time PCR方法相比，Taqman探針法能夠特異性與目的基因結合，不會與非特異性PCR產物和引物二聚體結合，因此具有良好的特異性和可靠性；
(4)操作簡單，結果穩(wěn)定。


圖1為本發(fā)明所述實時定量PCR方法檢測兔I型膠原蛋白基因的標準曲線；
圖2為本發(fā)明所述實時定量PCR方法檢測兔GAPDH基因的標準曲線；
圖3為對實施例3標準品擴增產物鑒定的電泳 泳道1 :標準品擴增產物(488bp)
泳道2 :100bp DNA Marker 圖4為本發(fā)明所述方法檢測不同接枝率骨修復材料中的兔I型膠原基因的柱形圖； 圖5為本發(fā)明所述方法檢測不同接枝率骨修復材料兔成骨細胞中的兔I型膠原基因的柱形圖。
具體實施例方式實施例1 :設計和制備引物、探針序列 兔I型膠原蛋白基因的GENEBANK登錄號為gi_984641，應用引物設計軟件Beacon
designer 7設計了兔I型膠原蛋白基因和兔GAPDH基因的實時定量PCR引物和探針，經過
軟件Beacon designer 7分析排除了引物間/內二聚體以及發(fā)夾結構，并經BLAST驗證引
物的特異性和與相近基因的同源性，設計出下列引物和探針。 兔I型膠原蛋白基因特異性引物分為上游引物和下游引物 上游引物序列5' -CCACTGGCAAACATGGAAACC-3'(其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1
所示) 下游引物序列5' -GGATGCCTTGTGGACCACTAG-3'(其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示) 兔I型膠原蛋白基因特異性Taqman探針序列為5' 6-FAMCCTCTTG-GACCAGCAGCACCGACG 3' TAMRA(其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示)。 為了避免由于樣品間加入的核酸總量的差別，以及樣品在RNA抽提以及逆轉錄過程中效率的不同而導致的樣品間基因表達量的差別，通常采用管家基因進行校正來消除這些客觀的差異。 一些基因在外界因素改變時表達相對比較恒定，我們把這些基因用來實時定量PCR的校正，GAPDH是最通用的管家基因，本發(fā)明采用GAPDH基因作為管家基因對每個待測樣品進行校正。 以兔GAPDH基因為內參，GAPDH基因GENEBANK登錄號為NM-001082253，設計上游引物為 5' -GATGGTGAAGGTCGGAGTG-3'(其核苷酸序列如SEQ IDNO. 4所示)
兔GAPDH基因下游引物為 5' -TGTAGTGGAGGTCAATGAATGG-3'(其核苷酸序列如SEQ IDNO. 5所示)
兔GAPDH特異性Taqman探針序列 5' 6-FAM CAGCCTTGACCGTGCCGTGGAACT 3' TAMRA (其核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示)。 實施例2 : 制備本發(fā)明所述試劑盒本發(fā)明所述試劑盒組成為1. 25ml 10 X PCR Buffer、200ii 1的2 y M的ROX、 lml的
10mM dNTPs、250 的5 y M上游引物、250 的5 y M下游引物、250 的5 y M熒光標記
的Taqman探針、Taq酶500U、無核酶水2ml，標準品(IO1?？截?20 iU。 所述引物包括實施例1制備的兔I型膠原蛋白基因的上游引物和下游引物、兔
GAPDH基因的上游引物和下游引物；所述探針包括兔I型膠原蛋白基因的探針和兔GAPDH
基因的探針。 對照品分陰性對照和陽性對照，陰性對照為無核酶水，陽性對照為兔肌肉組織的cDNA樣品。 應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，如將試劑盒的組分等比例增加，也應視為在本發(fā)明要求保護的范圍之內。
實施例3 : 本發(fā)明所述方法檢測不同接枝率骨修復材料中的兔I型膠原基因的表達 骨修復材料從兔腿部取出，稱取lOOmg材料，在研缽中加入液氮搗碎，用Trizol提
取材料中的總RNA，取lug總RNA進行逆轉錄成cDNA，用這些cDNA和實施例1所述I型膠
原引物和GAPDH引物進行Real-time PCR反應，實驗設置GAPDH為內參組，用以校正每個樣
品起始模板量的差異對實驗帶來的誤差。反應組份如表1 : 表1
名稱體積
lOXPCRBuffer2. 5u 1
ROX (2 u M)0. 3u 1
dNTPs(10mM)2u 1
上游引物(5uM)0. 5u 1
下游引物(5uM)0. 5u 1
Taqman探針(5 u M)0. 5u 1
cDNA2u 1
T叫酶(4U/ u 1)0. 25u 1
H2016. 45 u 1 兔I型膠原蛋白基因的GENEBANK登錄號為gi_984641，根據NCBI搜索選取其特異性基因序列為兔I型膠原蛋白基因的253-740片段，共488bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。以兔I型膠原蛋白基因的253-740片段為標準品，兔I型膠原蛋白基因的253-740片段核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示，標準品濃度為10"拷貝/iU，將標準品稀釋后，分為10"拷貝/111、108拷貝/111、106拷貝/111、104拷貝/111、102拷貝/yl，104考貝/iU進行Real-time PCR反應，反應條件是95。C預變性10min，然后95。C 30秒、58。C 60秒、72。C 60秒共進行45個循環(huán)，結果制作標準曲線，見圖1。將標準品擴增產物進行電泳，紫外燈檢測并拍照，結果見圖3，可見在接近400bp出有一明顯的條帶，即為目的基因兔I型膠原蛋白基因的253-740片段(488bp)?？芍景l(fā)明所述方法可擴增兔I型膠原蛋白基因，靈敏度范圍是10-l(T拷貝。 本發(fā)明所用Trizol試劑購自Invitrogen， 01igo-dT、 dNTP、 M-MLV逆轉錄酶、Taq酶和RNA酶抑制劑購自Promega公司，Brilliant QPCRMaster Mix和ROX購自Stratagene公司。
7
設定Real-time PCR反應條件95。C預變性10min，然后95°C 30秒、58。C 60秒、72°C 60秒共進行45個循環(huán)，樣品在Stratagen Mx3005P機器上運行，結束后軟件分析結果見圖4。 實施例4 : 實時熒光定量法檢測種植在不同接枝率HA與PLGA共混材料上的兔成骨細胞中兔I型膠原蛋白基因的表達。 取3天新生兔的顱骨，顱骨剪碎后加DMEM+10% FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)兔成骨細胞。單純的PLGA和不同接枝率HA與PLGA共混材料，共混材料中HA與PLGA質量百分比分別是80 %和20 % 。用于成骨細胞培養(yǎng)的復合材料分別為PLGA、 PLGA+HA、 PLGA+HA (1 % )、PLGA+HA (3% ) PLGA+HA (5% ) 、 PLGA+HA (7% ) 、 PLGA+HA (10% )。材料用氯仿溶解后在硅化的蓋玻片上鋪膜。成骨細胞種植于涂有不同復合材料的薄膜上。培養(yǎng)l周后，提取總RNA，逆轉錄，Real-time PCR檢測I型膠原蛋白表達。
材料、引物合成、檢測方法同實施例3。 成骨細胞用Trizol提取總RNA，取lug總RNA進行逆轉錄成cDNA，用這些cDNA和I型膠原引物和GAPDH引物進行Real-timePCR反應，反應組份如表2 :
表2
名稱體積
lOXPCRBuffer2. 5u 1
ROX(2 u M)0. 3u 1
dNTPs(10mM)2u 1
上游引物(5uM)0. 5u 1
下游引物(5uM)0. 5u 1
T叫man探針(5 u M)0. 5u 1
cDNA2u 1
Taq酶(4U/ u 1)0. 25u 1
H2016. 45u 1 Real-time PCR反應條件是，95 °C預變性10min，然后95。C 30秒、58。C 60秒、72°C 60秒共進行45個循環(huán)，樣品在Stratagen Mx3005P機器上運行，結束后軟件分析結果見圖5。從圖5可以看出成骨細胞在不同復合材料上培養(yǎng)1周后，材料PLGA+HA(5% )中I型膠原蛋白基因表達量最高，因此材料PLGA+HA(5% )更有利于體外培養(yǎng)的兔成骨細胞中I型膠原蛋白基因的表達。 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應 視為本發(fā)明的保護范圍。
0080]SEQUENCE LISTING
0081]〈110〉中國科學院長春應用化學研究所
0082]〈120〉 一種檢測兔I型膠原蛋白基因的方法及試劑盒
0083]〈130>MP097633
0084]〈160>7
0085]〈170>PatentIn version 3.3
0086]〈210>1
0087]〈211>21
0088]〈212>DNA
0089]〈213〉兔I型膠原蛋白基因的上游引物
0090]〈400>1
0091]CC3CtggC朋3C3tgg朋3C c
0092]〈210>2
0093]〈211>21
0094]〈212>DNA
0095]〈213〉兔I型膠原蛋白基因的下游引物
0096]〈400>2
0097]ggatgccttg tggaccacta g
0098]〈210>3
0099]〈211>24
0100]〈212>DNA
0101]〈213〉兔I型膠原蛋白基因探針
0102]〈400>3
0103]cctcttggac cagcagcacc gacg
0104]〈210>4
0105]〈211>19
0106]〈212>DNA
0107]〈213〉兔GAPDH基因上游引物
0108]〈400>4
0109]g3tggtg朋g gtCgg3gtg
0110]〈210>5
0111 ]〈211>22
0112]〈212>DNA
0113]〈213〉兔GAPDH基因下游引物
0114]〈400>5.0115] tgtagtggag gtcaatgaat gg 22
:0116] 〈210>6
:0117] 〈211>24
:0118] 〈212>DNA
:0119] 〈213〉兔GAPDH基因探針
:0120] 〈400>6
.0121] cagccttgac cgtgccgtgg aact 24 〈210>7 〈211>488 〈212>DNA 〈213〉兔I型膠原蛋白基因序列的253-740片斷 〈400>7
.0127] ggtcgtgatg gcaaccctgg gagcgatggt cctccaggtc gcgatggtca gcctggacac
:0128] 60
.0129] aagggagaac gtggttaccc tggcaatgct ggtcctgttg gtgctgcagg agcacctggt
:0130] 120
.0131] cctcaaggct ccgtgggccc cactggcaaa catggaaacc gtggtgaacc tggccctgct
:0132] 180
.0133] ggttctattg gtcccgtcgg tgctgctggt ccaagaggcc ctagtggtcc acaaggcatc
:0134] 240
.0135] cggggtgaca agggagagcc tggtgacaag gggcccagag gtcttcctgg cataaaggga
:0136] 300
.0137] cacaacggat tgcaaggtct tcccggtctc gctggtcaac atggtgatca aggtgctccc
:0138] 360
.0139] ggcgctgtgg gtcccgctgg ccccaggggc cctgctggtc ctaccggccc tgctggcaaa
:0140] 420
.0141] gacggccgct ctggacatcc cggcacagtt ggacctgctg gccttcgagg ttctcagggt
:0142] ■
.0143] agccaagg
:0144] 488
權利要求
一種檢測兔I型膠原蛋白基因的方法，包括如下步驟(i)用核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物、核苷酸序列如SEQID NO.2所示的下游引物擴增生物樣品；(ii)用探針對擴增產物進行檢測，所述探針序列如SEQ ID NO.3所示。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(i)所述擴增與步驟(ii)所述檢測同時進行。
3. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于，采用實時熒光定量PCR法進行步驟(i)所述擴增與步驟(ii)所述檢測。
4. 根據權利要求l-3任一項所述的方法，其特征在于，步驟(ii)所述探針為T叫Man探針。
5. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述實時熒光定量PCR反應程序為95°ClOmin ;95。C 30sec ;58。C lmin ;72。C lmin為一個循環(huán)，設定45個循環(huán)。
6. —種檢測兔I型膠原蛋白基因的試劑盒，其特征在于，包含核苷酸序列如SEQ IDNO. 1所示的引物和核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示的引物中的至少一種。
7. 根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包含核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示的探針。
8. 根據權利要求6所述的試劑盒，還包含用于檢測兔GAPDH基因的引物和探針；其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，探針序列如SEQ ID NO. 6所示。
9. 根據權利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于，所述探針為TaqMan探針，其5'端標記6-FAM、 TET、 HEX、 TAMRA、 ROX、 CY5、 CY3、 JOE、 Texas Red其中一種，3'端標記TAMRA、BHQ-l、Eclipse、 Iowa Black其中一種。
10. 檢測兔I型膠原蛋白基因的引物，上游引物核苷酸序列如SEQ IDNO. l所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體提供一種檢測兔I型膠原蛋白基因的方法，包括用核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物、核苷酸序列如SEQID NO.2所示的下游引物擴增生物樣品，以及用序列如SEQ ID NO.3所示的探針進行檢測步驟。本發(fā)明還提供一種檢測兔I型膠原蛋白基因的試劑盒。本發(fā)明所述方法檢測兔I型膠原蛋白基因靈敏度高，可檢測到基因的最小濃度為10個拷貝，特異性強，操作簡單，樣本范圍廣，具有廣泛的應用前景。
文檔編號C12N15/11GK101775438SQ200910266200
公開日2010年7月14日 申請日期2009年12月31日 優(yōu)先權日2009年12月31日
發(fā)明者崔立國, 王宇, 王宗良, 章培標, 陳學思 申請人:中國科學院長春應用化學研究所