專利名稱：一種檢測(cè)K562單細(xì)胞表達(dá)p16基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及腫瘤相關(guān)基因的檢測(cè)方法，尤其涉及利用PCR技術(shù)檢測(cè)基因表達(dá)的方法。
背景技術(shù)：
在人類基因組測(cè)序工作完成后，生命科學(xué)的研究已從基因序列分析進(jìn)入功能基因組學(xué)的研究。從分子水平探討細(xì)胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)的產(chǎn)生及其對(duì)基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)控的作用，揭示特定基因表達(dá)與人體生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老的關(guān)系，揭示特定基因缺失或異常表達(dá)與疾病發(fā)生之間的關(guān)系，成為生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。
P16基因是重要的抗癌基因，定位于9p21上，全長(zhǎng)8.5kb，由2個(gè)內(nèi)含子間隔3個(gè)外顯子組成，編碼產(chǎn)物是16KD的蛋白。P16是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶——CDK4的抑制因子，參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，與腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系。當(dāng)P16基因正常表達(dá)時(shí)，可以抑制Cdk4活性，最終阻止細(xì)胞進(jìn)入S期。一旦P16基因因缺失，突變等原因?qū)е鹿δ苋笔?，則不能抑制CDK4，最終導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入惡性增殖，加速腫瘤發(fā)生。
P16基因在多種惡性腫瘤中有較高的失活率，失活的主要方式為基因缺失、點(diǎn)突變、移碼、基因重排及甲基化等。p16基因純合缺失常見(jiàn)于各種腫瘤，例如，食道癌約為92.3％，急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)中約為40％，間皮瘤61.9％，胰腺癌40.5％，卵巢癌22％。P16基因突變與腫瘤的發(fā)生也有著密切的關(guān)系，在肺癌、黑色素瘤等腫瘤中，都存在p16基因突變，包括無(wú)義突變，錯(cuò)義突變，剪接供體位點(diǎn)突變等。
P16基因參與了各種組織的腫瘤形成，因此檢測(cè)P16基因的突變與缺失，研究P16基因異常與腫瘤的分期、分級(jí)的相關(guān)性，對(duì)腫瘤臨床治療有重要意義。同樣，通過(guò)檢測(cè)P16基因表達(dá)，篩選可以激活P16基因的藥物，在抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)中具有重要意義。許多榮等在《臨床研究》1999；vol 18(4)，上，探討了p16基因純合缺失與急性淋巴細(xì)胞白血病的關(guān)系及其臨床意義，采用PCR方法檢測(cè)P16基因的有無(wú)；芮紅兵在《中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)研究》2002；10(5)研究了野生型P16和P53抑癌基因共轉(zhuǎn)染對(duì)K562細(xì)胞增殖的抑制作用，采用RT-PCR方法檢測(cè)了P16基因的表達(dá)。
然而，通常采用的PCR方法，檢測(cè)的對(duì)象是組織或多個(gè)細(xì)胞，采用的模板是從組織或多個(gè)細(xì)胞制備的DNA或RNA，在檢測(cè)的靈敏度、特異性等方面均有缺陷，尤其是，檢測(cè)結(jié)果不能反映各細(xì)胞之間的差異。
本領(lǐng)域迫切需要準(zhǔn)確、靈敏，能夠檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞P16基因的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)K562單細(xì)胞表達(dá)p16基因的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足；本發(fā)明的方法包括如下步驟采用極限稀釋法(limiting dilution)制備單細(xì)胞懸液，將含有單個(gè)細(xì)胞的懸液置于PCR管中；加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞；裂解后加入擴(kuò)增p16全長(zhǎng)基因的引物和RT-PCR試劑；進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。
用于檢測(cè)p16基因表達(dá)的引物序列為上游引物GAATTCGGCGGTGAGGGGG下游引物GGATCCCTGAGGGACCTTC在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方案中采用極限稀釋法(limiting dilution)制備單細(xì)胞懸液，將含有單個(gè)細(xì)胞的懸液置于PCR管中；加入細(xì)胞裂解液，冰浴中處理5min；裂解后加入p16特異性擴(kuò)增引物和RT-PCR試劑；37℃逆轉(zhuǎn)錄1小時(shí)，94℃預(yù)變性5分鐘，再以93℃30s，55℃30S，72℃50S，35個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后延伸8min；擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。
本發(fā)明的有益效果主要表現(xiàn)在本發(fā)明的方法能夠檢測(cè)單一細(xì)胞p16基因及其特異性表達(dá)情況。
RT-PCR擴(kuò)增中mRNA模板的制備是一項(xiàng)技術(shù)性很強(qiáng)的工作，在抽提工作中，容易造成模板降解，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。本發(fā)明通過(guò)單細(xì)胞原位基因擴(kuò)增，避免模板降解所致的問(wèn)題。與多細(xì)胞RT-PCR方法相比，本發(fā)明的方法具有更好的靈敏度。


圖1、PCR擴(kuò)增管中的單細(xì)胞和多細(xì)胞圖(左為單細(xì)胞100X，中為多細(xì)胞100X，右為1μl細(xì)胞懸液40X)。
圖2、p16基因表達(dá)的時(shí)間-效應(yīng)圖。
圖3為p16電泳LightFrame分析圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、K562白血病細(xì)胞的ABPS誘導(dǎo)培養(yǎng)凋亡基因的誘導(dǎo)取對(duì)數(shù)增殖期的K562白血病細(xì)胞系(上海細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)購(gòu)進(jìn))細(xì)胞，計(jì)數(shù)并將5×105/ml的細(xì)胞、10％胎牛血清(Fetus Cattle Serum，F(xiàn)CS，Gibco.lot.No.1165723)RPMI1640(Gibco)培養(yǎng)液和已知具有誘導(dǎo)凋亡基因表達(dá)的巴西蘑菇多糖(Agaricus Blazei Polysaccharide，ABPS)10μg/ml充分混勻后，加于96孔培養(yǎng)板(costar)中，每孔100μl，設(shè)8個(gè)復(fù)孔。樣品制好后，置37℃、飽和濕度、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。進(jìn)行誘導(dǎo)p16基因表達(dá)。
實(shí)施例2、單細(xì)胞RT-PCR檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞的獲得實(shí)施例1誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞，采用極限釋釋法分別于誘導(dǎo)基因表達(dá)的24h、48h、72h和96h時(shí)，取出培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行p16基因的檢測(cè)。制備單細(xì)胞時(shí)，先將實(shí)驗(yàn)孔細(xì)胞在無(wú)菌條件下取出，加于細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，計(jì)數(shù)，視細(xì)胞量，用PBS將細(xì)胞稀釋至約103/ml，然后取出1μl細(xì)胞懸液，加于0.2ml的PCR管中，倒置光顯微鏡下觀察，選擇細(xì)胞形態(tài)完整的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR。見(jiàn)圖1。(左為單細(xì)胞100X，中為多細(xì)胞100X，右為1μl細(xì)胞懸液40X)。
RT-PCR在PCR管中加入細(xì)胞裂解液
[2]，離心，置冰浴中靜置處理細(xì)胞5min，然后4℃12000r/min離心5min，旋即移至超凈工作臺(tái)中，加入p16基因特異性擴(kuò)增藥物，按華美公司酶混合物試劑盒說(shuō)明分別加入RT-PCR的各種試劑，離心，PCR儀進(jìn)行基因擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為37℃逆轉(zhuǎn)錄1小時(shí)，94℃預(yù)變性5分鐘，再以93℃30s 55℃30S，72℃50S循環(huán)擴(kuò)增35次，最后終延伸8min。
擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果見(jiàn)圖2。
第1泳道為marker，2，4，6，8為單細(xì)胞-時(shí)效PCR擴(kuò)增條帶，分別為ABPS誘導(dǎo)后24h，48h，72h和96h的擴(kuò)增結(jié)果；3，5，7，9為多細(xì)胞時(shí)-效PCR擴(kuò)增的條帶，分別為ABPS誘導(dǎo)后24h，48h，72h和96h的擴(kuò)增結(jié)果。
p16基因在誘導(dǎo)的24時(shí)小就有表達(dá)，72小時(shí)表達(dá)達(dá)到高峰，96小時(shí)下降。
實(shí)施例3、多細(xì)胞RT-PCR檢測(cè)實(shí)施例1誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度到1.5*105/ml細(xì)胞作為多細(xì)胞對(duì)照組。常規(guī)方法制備mRNA模板......
在PCR管中加入模板1ul，按實(shí)施例2的方法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果圖2。
1泳道為marker，2，4，6，8為單細(xì)胞-時(shí)效PCR擴(kuò)增條帶，分別為ABPS誘導(dǎo)后24h，48h，72h和96h的擴(kuò)增結(jié)果；3，5，7，9為多細(xì)胞時(shí)-效PCR擴(kuò)增的條帶，分別為ABPS誘導(dǎo)后24h，48h，72h和96h的擴(kuò)增結(jié)果。
p16基因在誘導(dǎo)的24時(shí)小就有表達(dá)，72小時(shí)表達(dá)達(dá)到高峰，96小時(shí)下降。
p16電泳LightFrame分析見(jiàn)圖3。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)K562單細(xì)胞表達(dá)p16基因的方法，其特征在于，包括如下步驟采用極限稀釋法制備單細(xì)胞懸液，將含有單個(gè)細(xì)胞的懸液置于PCR管中；加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞；裂解后加入p16特異性擴(kuò)增引物和RT-PCR試劑；進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所說(shuō)的p16基因特異性引物為上游引物GAA TTC GGC GGT GAG GGG G下游引物GGA TCC CTG AGG GAC CTT C。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括如下步驟采用極限稀釋法制備單細(xì)胞懸液，將含有單個(gè)細(xì)胞的懸液置于PCR管中；加入細(xì)胞裂解液，冰浴中處理5min；裂解后加入p16特異性擴(kuò)增引物和RT-PCR試劑；RT-PCR擴(kuò)增37℃逆轉(zhuǎn)錄1小時(shí)，94℃預(yù)變性5分鐘，再以93℃30s，55℃30S，72℃50S，35個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后延伸8分鐘；擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)K562單細(xì)胞表達(dá)p16基因表達(dá)的方法，包括如下步驟采用極限稀釋法制備單細(xì)胞懸液，將含有單個(gè)細(xì)胞的懸液置于PCR管中；加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞；裂解后加入擴(kuò)增p16全長(zhǎng)基因的引物和RT－PCR試劑；進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。本發(fā)明通過(guò)單細(xì)胞原位基因擴(kuò)增，避免模板降解所致的問(wèn)題。與多細(xì)胞RT－PCR方法相比，本發(fā)明的方法具有更好的靈敏度。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1861806SQ200510025810
公開(kāi)日2006年11月15日 申請(qǐng)日期2005年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月13日
發(fā)明者李興玉, 李靜, 丁煥平, 忻茜 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)