專利名稱：分泌腫瘤壞死因子－α的重組卡介苗及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分泌腫瘤壞死因子-α的重組卡介苗及其構(gòu)建方法，具體涉及一種包含卡介苗主要分泌抗原Ag85B信號肽片斷和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的重組卡介苗及其構(gòu)建方法，得到的重組卡介苗rBCGTNF-α用于預(yù)防和治療淺表性膀胱腫瘤，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自從1976年Morales首次報(bào)告應(yīng)用卡介苗(BCG)膀胱灌注治療表淺性膀胱腫瘤以來，BCG作為一種有效的免疫佐劑已在防治膀胱腫瘤方面取得了良好效果，目前BCG膀胱灌注已被視為膀胱腫瘤最有效的輔助治療之一。盡管BCG在預(yù)防和治療表淺性膀胱腫瘤方面具有良好的療效，但仍有許多問題需要解決。首先是進(jìn)一步增強(qiáng)膀胱腫瘤對BCG灌注的免疫反應(yīng)性。國內(nèi)外文獻(xiàn)表明，表淺性膀胱腫瘤切除術(shù)后，即使進(jìn)行規(guī)范的BCG膀胱灌注治療，仍有10％-20％的患者缺乏免疫反應(yīng)而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)[茍欣等“卡介苗和白細(xì)胞介素-2預(yù)防膀胱癌復(fù)發(fā)長期觀察”，醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)第21卷第9期(2000)]。其次是減少其副作用。在BCG膀胱灌注后，患者常有尿頻、尿急、尿痛、血尿等膀胱炎癥狀，多數(shù)可自行緩解，但仍有少數(shù)患者會(huì)出現(xiàn)膀胱攣縮、BCG敗血癥等嚴(yán)重并發(fā)癥。
國外研究認(rèn)為BCG的抗瘤機(jī)制與局部細(xì)胞免疫、直接細(xì)胞毒性作用、細(xì)胞因子的細(xì)胞殺傷等密切相關(guān)，其中IL-2、IFN-γ、TNF-α等多種細(xì)胞因子參與到免疫反應(yīng)中并發(fā)揮重要的作用。體外實(shí)驗(yàn)研究表明，BCG聯(lián)合TNF-α可通過抑制MMP-2的表達(dá)，明顯增強(qiáng)對膀胱腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。臨床上也有人全身或局部應(yīng)用TNF-α聯(lián)合化療藥物治療晚期實(shí)體腫瘤，經(jīng)隨機(jī)對照研究發(fā)現(xiàn)療效明顯好于單純化療組[李恩孝“重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子治療惡性腫瘤的隨機(jī)研究”，中國癌癥雜志，13.4(2003)]。但TNF-α存在半衰期短、用量大及毒性強(qiáng)的缺點(diǎn)，同時(shí)高昂的治療費(fèi)用限制了其在臨床上的推廣。近年來國內(nèi)外專家開始重視BCG轉(zhuǎn)變?yōu)橐呙巛d體的分子生物學(xué)研究，并取得了明顯的進(jìn)展。目前，國內(nèi)外已將重組BCG疫苗應(yīng)用于日本血吸蟲病、結(jié)核病的動(dòng)物試驗(yàn)及臨床中，并取得了良好的效果[甘燕等“多糖佐劑FQ2對日本血吸蟲rBCG Sj26GST疫苗增效作用及其機(jī)理的初步探討”，中國人獸共患病雜志，19.2(2003)]。國外成功構(gòu)建分泌鼠白介素-2的重組BCG，并對膀胱腫瘤動(dòng)物模型的免疫刺激作用及對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用進(jìn)行研究[Yamada等“分泌小鼠白細(xì)胞介素-2的重組卡介苗增強(qiáng)單核細(xì)胞介導(dǎo)的膀胱腫瘤的殺傷作用”J Urol，164(2)526(2000)]，發(fā)現(xiàn)重組卡介苗具有明顯抗腫瘤活性及高效表達(dá)IL-2的作用，同時(shí)可以減少卡介苗的用量及毒副作用。但借助基因工程技術(shù)構(gòu)建分泌TNF-α的重組卡介苗，以提高膀胱腫瘤療效的研究尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對傳統(tǒng)卡介苗的不足，提出一種分泌腫瘤壞死因子-α的重組卡介苗rBCGTNF-α及其構(gòu)建方法，得到的rBCGTNF-α具有BCG和TNF-α的雙重效果，通過在膀胱腔內(nèi)局部高效表達(dá)TNF-α，既可以協(xié)同加強(qiáng)BCG介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，促進(jìn)T-cell、NK-cell對膀胱腫瘤的殺傷作用，也可直接殺傷膀胱腫瘤細(xì)胞。
為實(shí)現(xiàn)這一目的，本發(fā)明利用基因工程技術(shù)將起分泌作用的卡介苗Ag85B信號肽和TNF-α的基因片段克隆至pMV261，得到卡介苗穿梭表達(dá)載體pMSTNF-α，然后采用電轉(zhuǎn)化技術(shù)將pMSTNF-α導(dǎo)入BCG構(gòu)建重組卡介苗rBCGTNF-α，Ag85B信號肽是BCG自身起分泌作用的抗原，可以協(xié)助外源基因分泌至細(xì)胞外。依靠pMSTNF-α在BCG的復(fù)制和信號肽的分泌作用，能夠高效分泌TNF-α。
本發(fā)明分泌腫瘤壞死因子-α的重組卡介苗rBCG TNF-α的構(gòu)建方法通過下述步驟實(shí)現(xiàn)步驟1卡介苗穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定根據(jù)GeneBank已有的卡介苗主要分泌抗原Ag85B信號肽和TNF-α的基因序列，分別設(shè)計(jì)Ag85B信號肽和TNF-α的擴(kuò)增引物，Ag85B信號肽的上下游酶切位點(diǎn)分別為BamHI和EcorI，TNF-α的上下游酶切位點(diǎn)分別為EcorI和SalI。分別經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)合成得到Ag85B信號肽和TNF-α的基因片段。先將Ag85B信號肽克隆到pMV261載體中得到pMS，再將TNF-α基因片段與pMS載體的信號肽連接，得到卡介苗穿梭表達(dá)載體pMSTNF-α。
步驟2卡介苗的培養(yǎng)選取卡介苗BCG為上海丹麥株(H37Rv56209)，由上海生物制品所提供。BCG專用液體培養(yǎng)基為含有10％的營養(yǎng)劑ADC(albumin-extrose-catalase)、0.5％吐溫80和0.2％甘油的Middlebrook7H9 broth(Difco產(chǎn)品)。將卡介苗放在含有液體培養(yǎng)基的燒瓶中進(jìn)行搖床培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)100轉(zhuǎn)/分，三周后卡介苗處于對數(shù)生長期(OD600值＝0.6)，制得感受態(tài)卡介苗。
本發(fā)明所用的液體培養(yǎng)基中還可以加入青霉素100μg/ml、放線菌酮100μg/ml預(yù)防細(xì)菌感染。
步驟3電轉(zhuǎn)化技術(shù)構(gòu)建重組卡介苗rBCGTNF-α制備好感受態(tài)卡介苗后，在一離心管中混勻400μl含1×108cfu的感受態(tài)卡介苗和2μl含0.4μg的穿梭表達(dá)載體pMSTNF-α，置于基因脈沖儀中進(jìn)行電轉(zhuǎn)化得到陽性重組子，電轉(zhuǎn)參數(shù)電壓為2500V，電流為25μF，電阻為1000Ω。陽性重組子先在含有50μg/ml卡那霉素的固體培養(yǎng)基中篩選，培養(yǎng)兩周后得到陽性克隆rBCGTNF-α，然后接種在含有50μg/ml卡那霉素的液體培養(yǎng)基搖床生長，大量培養(yǎng)。
電轉(zhuǎn)化構(gòu)建rBCGTNF-α采用含有50μg/ml卡那霉素的固體培養(yǎng)基Middlebrook 7H10(Difco產(chǎn)品)進(jìn)行抗性篩選，液體培養(yǎng)基為含有50μg/ml卡那霉素的Middlebrook 7H9 broth。固體培養(yǎng)基及液體培養(yǎng)基還可加入青霉素100μg/ml、放線菌酮100μg/ml預(yù)防細(xì)菌感染。
步驟4重組卡介苗rBCGTNF-α的鑒定與功能檢測抗酸染色初步確定rBCGTNF-α為抗酸桿菌，抽提rBCGTNF-α質(zhì)粒DNA后，PCR擴(kuò)增得到TNF-α的基因片斷，Western blotting檢測rBCGTNF-α培養(yǎng)上清中和菌體中有TNF-α蛋白的表達(dá)，ELISA方法檢測到rBCGTNF-α培養(yǎng)上清中有高含量的TNF-α。
本發(fā)明所用試劑均為市購，本發(fā)明所用電轉(zhuǎn)化方法及檢測方法為常規(guī)已知方法。
本發(fā)明構(gòu)建的重組卡介苗rBCGTNF-α與傳統(tǒng)卡介苗比較，在采用相同劑量(106cfu/0.1ml)的情況下，能夠在體外明顯抑制膀胱腫瘤細(xì)胞，差別有顯著性。分別應(yīng)用于8只T739小鼠膀胱腫瘤模型(來自于該品系的膀胱腫瘤細(xì)胞種植于小鼠大腿內(nèi)側(cè)形成腫瘤)，采用腫瘤局部注射治療的方法，發(fā)現(xiàn)重組卡介苗在腫瘤消退的小鼠數(shù)目(8/8vs.2/8)、腫瘤消退時(shí)間(1W vs.3W)、無瘤生存時(shí)間(9Wvs.2W)及對該腫瘤細(xì)胞的免疫力方面，均優(yōu)于傳統(tǒng)卡介苗。本發(fā)明構(gòu)建的rBCGTNF-α如果能夠應(yīng)用于臨床，預(yù)防和治療表淺性膀胱腫瘤，不僅可以提高傳統(tǒng)BCG的藥物療效，減少患者腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)；而且可以減少膀胱腫瘤患者的醫(yī)療支出，既有利于患者，也有利于減輕社會(huì)醫(yī)療費(fèi)用負(fù)擔(dān)，因而有良好的推廣價(jià)值和臨床應(yīng)用趨向。


圖1為卡介苗主要分泌抗原Ag85B信號肽片斷的PCR擴(kuò)增電泳圖。
圖2為卡介苗主要分泌抗原Ag85B信號肽片斷的測序圖。
圖3為TNF-α的PCR擴(kuò)增電泳圖。
圖4為TNF-α的測序圖。
圖5為人卡介苗穿梭表達(dá)質(zhì)粒pMSTNF-α的酶切電泳圖。
圖6為人卡介苗穿梭表達(dá)質(zhì)粒pMSTNF-α的測序圖。
圖7為rBCGTNF-α的抗酸染色圖。
圖8為rBCGTNF-α抽提質(zhì)粒DNA的PCR擴(kuò)增電泳圖。
圖9為rBCGTNF-α的SDS-PAGE結(jié)果。
圖10為rBCGTNF-α的Western Blotting結(jié)果。
圖11為ELISA檢測rBCGTNF-α的分泌結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述。
實(shí)施例1步驟1卡介苗穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定1.合成擴(kuò)增引物根據(jù)GeneBank已有的卡介苗主要分泌抗原Ag85B信號肽和TNF-α的基因序列，分別設(shè)計(jì)Ag85B信號肽和TNF-α的擴(kuò)增引物，分別為Ag85B sense5′-GGATCCATGACAGACGTGAG-3′antisense5′-CTGCCGTGCCGATCATCAAT-3′TNF-α sense5′-AGCGAATTCATGAGCACTGAAAGCATGAT-3′antisense5′-AGCGTCGACTCACAGGGCAATGATCCCAA-3′pMV261載體上的測序引物5′-GACAACTTGAGCCGTCCGTC-3′2.Ag85B信號肽基因裝載到pMV261載體中合成信號肽基因并將其克隆到pUCm-T載體中連接(TAKARA)體系pUCm-T載體1μl信號肽片段(約50ng/μl)4μlSolμtion I 5μl16℃，連接過夜。
次日將pUCm-TAg85B質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5a，步驟如下(1).取出凍存的DH5a(200μl/Tube)，冰中溶解；(2).取5μl連接液加入菌液中，輕輕混勻，冰浴30min；(3).42℃熱休克1min 30sec，冰浴2min；(4).加入500μl LB液體培養(yǎng)基，于37℃搖床培養(yǎng)，100rpm×45min；(5).取200μl涂布至含有氨芐抗性的培養(yǎng)板上(100μg/ml)；(6).37℃倒置培養(yǎng)過夜，至菌落長出；(7).挑取單克隆至3ml含有氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中，于37℃搖床培養(yǎng)，250rpm培養(yǎng)過夜。
抽提pUCm-TAg85B質(zhì)粒DNA
挑選沒有突變的菌落，抽提質(zhì)粒。按照質(zhì)粒抽提試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟如下(1).將培養(yǎng)過夜的2ml菌液移至2ml離心管中，最高速離心30sec，棄盡上清；(2).在細(xì)菌沉淀中加入250μl Solution1液，振蕩至徹底懸??；(3).加入250μl Solution 2溶液，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管5-10次以混勻，使菌體充分裂解直至形成透亮的溶液，此步驟應(yīng)在5min內(nèi)完成；(4).加400μ14℃預(yù)冷的Solution 3溶液，立即溫和并充分地翻轉(zhuǎn)離心管5-10次以混勻，室溫靜置2min，最高速離心10min；(5).將上清倒入新的離心管中，再次最高速離心10min；(6).小心吸取上清轉(zhuǎn)移到DNA吸附柱中(吸附柱置于廢液收集管中)，離心1min，棄濾液，并將吸附柱置于同一收集管中；(7).在吸附柱中加入500μlW1液，離心30sec，棄濾液，并將吸附柱置于同一收集管中；(8).在吸附柱中加入700μl W2液，離心30sec，棄濾液，并將吸附柱置于同一收集管中，重復(fù)一次；(9).最高速離心1min；(10).將吸附柱移入新的干凈的1.5ml離心管中，在DNA吸附膜中央加入60μl預(yù)熱到60℃的去離子水，室溫靜置1min，最高速離心1min，得到的即為質(zhì)粒DNA溶液。
PCR擴(kuò)增及電泳以抽提質(zhì)粒DNA為模板，用合成的信號肽兩端引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
反應(yīng)體系去離子水40.5μlbuffer 5μldNTPs 1μlPrimer sig-F1μlPrimer sig-R1μlTemplate1μlTaq酶 0.5μl
反應(yīng)條件94℃ 3min94℃ 30sec54℃ 1min72℃ 30sec30cycles72℃ 10min結(jié)果圖1示2-5為PCR擴(kuò)增條帶，與分子質(zhì)量標(biāo)記比較顯示約120bp，與理論上所得的擴(kuò)增片段大小相同。
對抽提的pUCm-TAg85B質(zhì)粒DNA進(jìn)行測序鑒定測序結(jié)果見圖2，通過NCBI網(wǎng)站BLAST對照，堿基序列與Ag85B信號肽基因完全一致。表明PCR擴(kuò)增得到的Ag85B信號肽基因完全正確。
將信號肽基因克隆到pMV261載體中(1).分別酶切信號肽基因所在的T載體和pMV261載體酶切體系去離子水 2μl 去離子水7μlbuffer 2μl buffer 2μlpUCm-TAg85B15μl pMV261 10μlEcoR I 0.5μlEcoR I 0.5μlBamHI 0.5μlBamHI 0.5μl37℃作用2hr，1％瓊脂糖凝膠電泳。
(2).回收信號肽片段和切后的pMV261載體(申友凝膠回收試劑盒)，步驟如下①.在紫外燈切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體并切碎，計(jì)算凝膠重量；②.加入三個(gè)凝膠體積的DE-A溶液，混勻后于75℃加熱，期間混和幾次，直至凝膠塊完全溶化(約5min)③.加入1/2個(gè)DE-A體積的DE-B溶液，混和均勻；④.吸取上述步驟中的混和液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管(置于2ml離心管)中，離心3600rpm×1min，棄濾液；
⑤.將制備管置回離心管，加500μl W1溶液，離心3600rpm×30sec，棄濾液；⑥.將制備管置回離心管，加700μl W2溶液，離心3600rpm×30sec，棄濾液；以同樣的方法再用W2溶液洗滌一次；⑦.將制備管置回離心管中，最高速離心1min，凈棄W2溶液；⑧.將制備管置于潔凈的1.5ml離心管中，在DNA制備膜正中央加25μl預(yù)熱到60℃的水，室溫靜置1min，最高速離心lmin，得到DNA溶液。
(3).連接信號肽和pMV261連接體系連接buffer 1μlpMV261載體 3μl信號肽片段 5.5μl連接酶 0.5μl16℃連接過夜，得到含有信號肽基因的質(zhì)粒pMS。
(4).轉(zhuǎn)化(化轉(zhuǎn)，步驟同前，菌液的抗性為卡那霉素)3.目的基因TNF-α電泳鑒定和DNA測序以抽提的質(zhì)粒DNA為模板，用合成的TNF-α基因的兩端引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
反應(yīng)體系去離子水 40.5μlbuffer 5μldNTPs1μlPrimer F 1μlPrimer R 1μlTemplate 1μlTaq酶0.5μl反應(yīng)條件94℃ 3min94℃ 30sec54℃ 1min
72℃ 30sec35cycles72℃ 10min1％瓊脂糖凝膠電泳，DNA Marker證實(shí)。圖3示IL為PCR擴(kuò)增條帶，與分子質(zhì)量標(biāo)記比較顯示約702bp，與理論上所得的擴(kuò)增片段大小相同。
DNA測序驗(yàn)證目的基因TNF-α將TNF-α的PCR產(chǎn)物連接到pUCm-T載體中(步驟同信號肽克隆到pUCm-T載體)，得到質(zhì)粒pUCm-TTNF-α，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5a，分別抽提質(zhì)粒DNA后，進(jìn)行DNA測序，測序結(jié)果如圖4，通過NCBI網(wǎng)站BLAST對照，堿基序列與TNF-α基因完全一致。表明PCR擴(kuò)增得到的目的基因片段完全正確。目的基因TNF-α全長cDNA裝載入穿梭質(zhì)粒pMS中回收TNF-α片斷酶切pMS和pUCm-TTNF-α酶切體系water 2μlbuffer 2μlpUCm-TTNF-α 10μlEcoR I 0.5μlSal I 0.5μl37℃作用2hr，1％瓊脂糖凝膠電泳，DNA Marker證實(shí)片斷大小分別為4602bp和702bp。回收pMS載體、TNF-α片段。
連接反應(yīng)分別將pMS載體和TNF-α片段行體外連接，得到穿梭表達(dá)質(zhì)粒pMSTNF-α連接體系連接buffer 1μlpMS載體 2μl外源基因片段6.5μl連接酶 0.5μl酶切驗(yàn)證穿梭表達(dá)質(zhì)粒酶切體系water 2μlbuffer2μl穿梭表達(dá)質(zhì)粒 15μlEcoR I0.5μlSal I 0.5μl37℃作用2hr，1％瓊脂糖凝膠電泳，DNA Marker證實(shí)。圖5示IL為pMSTNF-α以EcoR I、SalI雙酶切結(jié)果為4.6kb、702bp兩條條帶，同預(yù)期結(jié)果。
測序驗(yàn)證構(gòu)建的穿梭表達(dá)質(zhì)粒用pMV261載體上的測序引物對抽提的穿梭表達(dá)質(zhì)粒pMSTNF-α進(jìn)行測序驗(yàn)證。測序結(jié)果見圖6，通過NCBI網(wǎng)站BLAST對照，堿基序列與TNF-α基因+Ag85B信號肽基因完全一致。
步驟2 卡介苗的培養(yǎng)選取卡介苗BCG為上海丹麥株(H37Rv56209)，由上海生物制品所提供。BCG專用液體培養(yǎng)基為含有10％的營養(yǎng)劑ADC(albumin-extrose-catalase)、0.5％吐溫80和0.2％甘油的Middlebrook7H9 broth(Difco產(chǎn)品)。將卡介苗放在含有液體培養(yǎng)基的燒瓶中進(jìn)行搖床培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)100轉(zhuǎn)/分，三周后卡介苗處于對數(shù)生長期(OD600值＝0.6)，按照下列步驟制備感受態(tài)卡介苗◆BCG在Middlebrook 7H9培養(yǎng)基37℃搖床培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速為100-120rpm)◆待培養(yǎng)液OD600值約0.6時(shí)將BCG菌液加入離心管中，冰浴2hr；◆將BCG菌液加入離心管中，在冰盒中預(yù)冷2hr；◆4℃離心8000g/min×15min，丟棄上清；用原始體積的1/10、預(yù)冷的濃度為10％甘油重懸菌體；◆重復(fù)上述操作共五次；◆棄上清，加入原始體積1/50的10％甘油重懸菌體即得到感受態(tài)細(xì)菌，放置室溫下備用。
本發(fā)明所用的液體培養(yǎng)基中還可以加入青霉素100μg/ml、放線菌酮100μg/ml預(yù)防細(xì)菌感染。
步驟3 電轉(zhuǎn)化技術(shù)構(gòu)建重組卡介苗rBCGTNF-α◆在一離心管中混勻400μl感受態(tài)BCG(1×108)和2μl穿梭表達(dá)質(zhì)粒(0.4μg)；◆冰浴10min后，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2CM的電擊轉(zhuǎn)化杯中再冰浴10min，置于基因脈沖儀中進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)參數(shù)電壓為2500V，電流為25μF，電阻為1000Ω；◆質(zhì)粒pMSTNF-α、pMV261及單純BCG的作用時(shí)間分別為23.5、25、26毫秒；◆電轉(zhuǎn)完成后，迅速加入1000μl培養(yǎng)基(MADC2Tw)，37℃下培養(yǎng)3hr；◆取100-200μl菌液涂抹于含有50μg/ml卡那霉素的固體培養(yǎng)基中，先正面朝上培養(yǎng)，3hr后翻轉(zhuǎn)平皿，繼續(xù)培養(yǎng)；◆兩周后挑選陽性克隆，在含2-3ml液體培養(yǎng)基的試管里搖床生長。
▲注此處感受態(tài)BCG在轉(zhuǎn)化時(shí)各做一陽性對照pBCG(BCG中只含有空白質(zhì)粒pMV261)及陰性對照(BCG)。
電轉(zhuǎn)化構(gòu)建rBCGTNF-α后，采用含有50μg/ml卡那霉素的固體培養(yǎng)基Middlebrook 7H10(Difco產(chǎn)品)進(jìn)行抗性篩選，液體培養(yǎng)基為含有50μg/ml卡那霉素的Middlebrook 7H9 broth，還可加入青霉素100μg/ml、放線菌酮100μg/ml預(yù)防細(xì)菌感染。
步驟4 重組卡介苗rBCGTNF-α的鑒定與功能檢測1.rBCGTNF-α的Z-N法抗酸染色(初步鑒定)結(jié)果見圖7染色后光學(xué)顯微鏡鏡檢(目鏡10×，油鏡100×)。在淡藍(lán)色背景下，抗酸桿菌呈紅色。
2.rBCGTNF-αDNA水平鑒定(PCR擴(kuò)增、電泳鑒定)rBCGTNF-α質(zhì)粒DNA的提取◆rBCG質(zhì)粒DNA的提取將在三角燒瓶內(nèi)培養(yǎng)四周的rBCG分瓶至15ml試管中，再在試管里搖床培養(yǎng)2周后使OD600約為1，收獲前加入甘氨酸至20mg/ml以干擾胞壁的合成，繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間后收集菌體；◆菌體用生理鹽水洗兩次后懸浮在裂解液(2mg/ml溶菌酶，0.3mol/L蔗糖，25mmol/L Tris-C1(pH＝8.0)，25mmol/L EDTA(pH＝8.0)，0.2mg/ml溴甲酚綠)中溫浴24-48hr后，加入堿性SDS(20mg/mlSDS，3mol/LNaOH)；◆37℃水浴12-48hr直至液體清亮，加入3mol/L的NaAc(pH＝4.8)；◆40℃水浴12hr，離心收集上清；◆往溶解的菌體里加入600μl預(yù)冷的Nuclei Lysis Solution，輕微振蕩10sec；◆加入3μlRNase Solution混合均勻。37℃放置15-30min；◆加入200μlProtein Precipitation Solution混合均勻，置于冰上5min；◆離心13000rpm×4min；◆將上清轉(zhuǎn)入含有600μl的異丙醇里，上下混合均勻，離心13000rpm×1min；◆棄上清，用70％乙醇洗滌一次，離心13000rpm×1min；◆小心吸棄上清，室溫干燥，加入TE溶解DNA。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)及電泳鑒定PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件、方法同步驟1。電泳鑒定結(jié)果見圖8示1-9為PCR擴(kuò)增條帶，與分子質(zhì)量標(biāo)記比較顯示約702bp，與理論上所得的擴(kuò)增片段大小相同。
3.rBCGTNF-α蛋白水平鑒定在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600值約為1時(shí)，先誘導(dǎo)兩種rBCG分泌表達(dá)細(xì)胞因子(45℃，30min)，4000g/min×10min，離心2次，收獲菌體及上清后，菌體先用超聲裂解法破碎，再加入裂解液(2％SDS，0.1M DT，0.01％溴甲酚綠，0.06M Tris-Cl，10％甘油)煮沸5min提取蛋白。分別將樣品用1×PBS洗滌三遍，以去除培養(yǎng)液中的白蛋白。收集第一遍洗滌液和最終的沉淀進(jìn)行western blot鑒定。
SDS-PAGE分離rBCGTNF-α總蛋白將洗滌液和2×SDS上樣緩沖液按1∶1混合(10μl+10μl)，沸水中變性10min后直接上樣。
制備凝膠板按下列條件配制12％的分離膠和5％的濃縮膠
12％分離膠(6ml)5％濃縮膠(3ml)30％丙烯酰胺溶液2.4ml 0.5ml1.5mmol/L Tris-HCl PH8.81.55ml /0.5mmol/L Tris-HCl PH6.8/ 0.38ml去離子水1.93ml 2.1ml10％SDS 60μl 30μl10％APS 60μl 30μlTEMED 2.4μl 3μl電泳濃縮膠用8V/cm，分離膠用15V/cm，恒壓電泳2hr，待溴酚藍(lán)到達(dá)底部時(shí)結(jié)束。染色觀察。
結(jié)果見圖9示泳道1顯示為TNF-α蛋白的條帶(相對分子質(zhì)量約26KD)，泳道2顯示為IFN-α2a蛋白的條帶(約19KD)，泳道3顯示為IL-2蛋白的條帶(約15.5KD)，泳道4及5在相應(yīng)位置未見蛋白條帶。
Western blotting檢測TNF-α蛋白表達(dá)◆常規(guī)蛋白電泳分離樣品；PVDF膜用甲醇浸濕，去離子水沖洗，再轉(zhuǎn)移到Transferring buffer中平衡20min，電泳膠置Transferring buffer中平衡20min，裁4張與膠同樣大小的Whatman 3mm濾紙，置Transferring buffer中平衡；◆按下列順序裝好blot負(fù)極—2層濾紙—電泳膠—PVDF膜—2層濾紙—正極，在這一步，要注意PAGE膠上的預(yù)染Marker是否清楚，為了避免在轉(zhuǎn)膜之后膜上的Marker不清楚，可以在這一步，當(dāng)膠和膜疊在一起時(shí)，對應(yīng)膠上的Marker，用圓珠筆在膜的相應(yīng)位置做上記號；◆5％脫脂牛奶/PBST 20ml，水平搖床，室溫封閉1hr；也可以先室溫封閉若干時(shí)間，4℃過夜；◆用PBST稀釋一抗，5％BSA，稀釋倍數(shù)1000倍，將膜封在塑料袋中，不留氣泡，用膠帶固定在可垂直旋轉(zhuǎn)的小搖床上，偏轉(zhuǎn)角度70-80度，水平搖床，室溫1hr；先用PBST短暫地洗2次，再用＞4ml/cm2(膜面積)的PBST，室溫洗15min；◆用PBST稀釋二抗，5000倍或10000倍稀釋5％BSA，水平搖床，室溫1hr；先用PBST短暫地洗2次，再用＞4ml/cm2(膜面積)的PBST，室溫洗15min；◆將檢測試劑(ECL plus)從4℃取出，在打開前平衡至室溫，檢測試劑的A液與B液以40∶1的比例混合，檢測試劑的用量為0.1ml/cm2；◆膜置于吸水紙上干燥，蛋白面朝上，檢測試劑加在膜上，覆蓋整個(gè)膜表面，室溫2min；◆用鑷子夾起PVDF膜，使膜的下邊角搭在紙巾上，吸干多余的檢測試劑；◆PVDF膜用保鮮膜封起，暗室曝光，時(shí)間10sec。
結(jié)果圖10示1-2分別為rBCGTNF-α中的菌體和培養(yǎng)上清，均可見26KD的TNF-α蛋白表達(dá)；3-4為pBCG的菌體和培養(yǎng)上清，未見蛋白表達(dá)；5-6為BCG的菌體和培養(yǎng)上清，未見蛋白表達(dá)。
3.rBCGTNF-α自分泌TNF-α的測定rBCGTNF-α在試管中搖床培養(yǎng)10天，OD600值約為0.5時(shí)，裝入離心管中，離心2000rpm×10min，仔細(xì)吸取上清。按照ELISA試劑盒說明書的操作步驟檢測培養(yǎng)上清中TNF-α的水平。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，測得的標(biāo)準(zhǔn)品OD620值作縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；通過待測標(biāo)本的OD620值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出濃度。結(jié)果見圖11示，與rBCGIFN-α2a和rBCGIL-2相比，只在rBCGTNF-α培養(yǎng)上清中檢測到高表達(dá)的TNF-α為665.21pg/ml；而pBCG和BCG的培養(yǎng)上清中均未檢測到TNF-α的表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種分泌腫瘤壞死因子-α的重組卡介苗的構(gòu)建方法，其特征在于包括下述步驟1)卡介苗穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建分別設(shè)計(jì)Ag85B和TNF-α的擴(kuò)增引物，Ag85B信號肽的上下游酶切位點(diǎn)分別為BamHI和EcorI，TNF-α的上下游酶切位點(diǎn)分別為EcorI和SalI，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分別合成Ag85B信號肽和TNF-α基因片段，將Ag85B信號肽克隆到pMV261載體中，得到pMS，再將TNF-α基因片段與pMS載體的信號肽連接，得到穿梭表達(dá)載體pMSTNF-α；2)卡介苗的培養(yǎng)選取卡介苗為上海丹麥株，將卡介苗放在含有液體培養(yǎng)基的燒瓶中進(jìn)行搖床培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基含有10％的營養(yǎng)劑ADC、0.5％吐溫80和0.2％甘油，搖床培養(yǎng)100轉(zhuǎn)/分，三周后卡介苗處于對數(shù)生長期，OD600值＝0.6，制得感受態(tài)卡介苗；3)電轉(zhuǎn)化技術(shù)構(gòu)建分泌人TNF-α的重組卡介苗rBCGTNF-α在一離心管中混勻400μl含1×108cfu的感受態(tài)卡介苗和2μl含0.4μg的穿梭表達(dá)質(zhì)粒pMSTNF-α，置于基因脈沖儀中進(jìn)行電轉(zhuǎn)化得到陽性重組子，電轉(zhuǎn)參數(shù)電壓為2500V，電流為25μF，電阻為1000Ω，陽性重組子先在含有50μg/ml卡那霉素的固體培養(yǎng)基中篩選，培養(yǎng)兩周后得到陽性克隆rBCGTNF-α，然后接種在含有50μg/ml卡那霉素的液體培養(yǎng)基搖床生長，大量培養(yǎng)；4)重組卡介苗rBCGTNF-α的鑒定與功能檢測進(jìn)行Z-N法抗酸染色證實(shí)為抗酸桿菌，抽提rBCGTNF-α質(zhì)粒DNA后，PCR擴(kuò)增得到TNF-α基因片斷，WesternBlot檢測到rBCGTNF-α培養(yǎng)上清中和菌體中有TNF-α蛋白的表達(dá)，ELISA方法檢測到rBCGTNF-α培養(yǎng)上清中有高含量的TNF-α。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的分泌腫瘤壞死因子-α的重組卡介苗的構(gòu)建方法，其特征在于所述的Ag85B和TNF-α的擴(kuò)增引物分別為Ag85B sense5′-GGATCCATGACAGACGTGAG-3′antisense5′-CTGCCGTGCCGATCATCAAT-3′TNF-αsense5′-AGCGAATTCATGAGCACTGAAAGCATGAT-3′antisense5′-AGCGTCGACTCACAGGGCAATGATCCCAA-3′ 。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的分泌腫瘤壞死因子-α的重組卡介苗的構(gòu)建方法，其特征在于所述pMV261載體上的測序引物為5′-GACAACTTGAGCCGTCCGTC-3′。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的分泌腫瘤壞死因子-α的重組卡介苗的構(gòu)建方法，其特征在于所述液體和固體培養(yǎng)基中均含有100μ/ml青霉素和100μg/ml放線菌酮。
5.一種采用權(quán)利要求1或2的方法構(gòu)建的分泌腫瘤壞死因子-α的重組卡介苗，其特征在于重組卡介苗包含Ag85B信號肽和TNF-α基因片段。
6.一種權(quán)利要求5的分泌腫瘤壞死因子-α的重組卡介苗的應(yīng)用，其特征在于用于人膀胱腫瘤的預(yù)防和治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分泌腫瘤壞死因子－α的重組卡介苗及其構(gòu)建方法，利用基因工程技術(shù)將起分泌作用的卡介苗Ag85B信號肽和TNF－α的基因片段克隆至pMV261，得到卡介苗穿梭表達(dá)載體pMSTNF－α，然后采用電轉(zhuǎn)化技術(shù)將pMSTNF－α導(dǎo)入BCG構(gòu)建重組卡介苗rBCGTNF－α，依靠pMSTNF－α在BCG的復(fù)制和信號肽的分泌作用，能夠高效分泌TNF－α。本發(fā)明得到的重組卡介苗rBCGTNF－α具有BCG和TNF－α的雙重效果，能夠有效預(yù)防和治療淺表性膀胱腫瘤；利用重組卡介苗rBCGTNF－α在膀胱腔內(nèi)的局部協(xié)同作用減少BCG和外用TNF－α的用量，可以克服BCG治療的毒副作用。
文檔編號C12N15/09GK1710073SQ20051002577
公開日2005年12月21日 申請日期2005年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月12日
發(fā)明者夏術(shù)階, 劉海濤, 孫曉文 申請人:上海交通大學(xué)