本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及能同時結(jié)合腫瘤壞死因子α(TNFα)及白細(xì)胞介素17A(IL-17A)的IgG雜合型抗TNFα和IL-17A雙特異性抗體。

背景技術(shù)：

目前采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的單克隆抗體在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中發(fā)揮著重要的作用，但是由于許多重大疾病并不是由單一抗原引起的，例如腫瘤及自身免疫性疾病，往往是由多種細(xì)胞因子(包括腫瘤壞死因子α(TNFα)及白細(xì)胞介素17A(IL-17A)等驅(qū)動的，單克隆抗體用于治療這類疾病具有一定的局限性。因此，如能夠生產(chǎn)可以結(jié)合兩種或兩種以上抗原的抗體，則可大大降低單克隆抗體治療疾病的局限性，十分有利于腫瘤及自身免疫性疾病的治療。

雙特異性抗體含有兩種不同抗原結(jié)合位點，是可以結(jié)合兩種不同的抗原分子的抗體，雙特異性抗體在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)展迅速，并且在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也取得了較大的成就，如腫瘤與自身免疫性疾病的治療。在雙特異性抗體臨床應(yīng)用中，許多需要完整的IgG結(jié)構(gòu)，所以雙特異性抗體載體的構(gòu)建與宿主細(xì)胞的表達(dá)對于其療效以及臨床應(yīng)用起到了決定性的作用。

目前，廣泛用于研究抗體表達(dá)的宿主系統(tǒng)是大腸桿菌和哺乳動物細(xì)胞。然而，諸多的已經(jīng)報道的抗體表達(dá)系統(tǒng)如大腸桿菌、酵母以及昆蟲細(xì)胞均存在蛋白活性低、系統(tǒng)無法進行連續(xù)性表達(dá)、對純化工藝要求嚴(yán)格等缺點。哺乳動物細(xì)胞具有高效表達(dá)內(nèi)源性重、輕鏈基因，將抗體糖基化、正確折疊和裝配以及分泌活性抗體的能力，便于對抗體親和力、特異性等的鑒定。其中HEK293F表達(dá)系統(tǒng)具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達(dá)的蛋白接近于天然蛋白分子；具有產(chǎn)物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的內(nèi)源蛋白，便于下游產(chǎn)物分離純化；能以懸浮培養(yǎng)方式或在無血清培養(yǎng)基中達(dá)到高密度培養(yǎng)，產(chǎn)量較高。

雖然雙特性抗體的構(gòu)型與種類越來越多，但是現(xiàn)有雙特異性抗體也存在許多相應(yīng)的問題。首先構(gòu)型方面，現(xiàn)有的雙特異性抗體許多構(gòu)型與天然存在的抗體構(gòu)型差別較大，使得抗體的穩(wěn)定性差，特異性差，容易產(chǎn)生同源二聚體，沒有良好的藥代動力學(xué)特征，甚至產(chǎn)生免疫原性。因此，提供一種與人體的IgG的分子量、構(gòu)型接近的IgG雜合型抗TNFα和IL-17A雙特異性抗體是本領(lǐng)域亟待解決的技術(shù)問題之一。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種IgG雜合型抗TNFα和IL-17A雙特異性抗體或來源于該抗體的能夠特異性結(jié)合TNFα和IL-17A的生物活性片段。

本發(fā)明的另一目的在于提供編碼所述IgG雜合型抗TNFα和IL-17A雙特異性抗體的核苷酸序列。

本發(fā)明的另一目的在于提供分泌本發(fā)明所述的IgG雜合型抗TNFα和IL-17A雙特異性抗體的哺乳動物細(xì)胞系。

本發(fā)明的另一目在于提供一種產(chǎn)生本發(fā)明所述IgG雜合型抗TNFα和IL-17A雙特異性抗體的方法。

本發(fā)明的另一目在于提供包含本發(fā)明所述IgG雜合型抗TNFα和IL-17A雙特異性或其生物活性片段的藥物組合物。

本發(fā)明的另一目的在于提供本發(fā)明所述的IgG雜合型抗TNFα和IL-17A雙特異性抗體或其生物活性片段或所述的藥物組合物的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測TNFα或IL-17A水平的試劑盒。

為實現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種IgG雜合型抗TNFα和IL-17A雙特異性抗體或來源于該雙特異性抗體的能夠特異性結(jié)合TNFα和IL-17A的生物活性片段，所述雙特異性抗體具有人源IgG型用于特異性結(jié)合TNFα的第一重鏈及第一輕鏈，及人源IgG型用于特異性結(jié)合IL-17A的第二重鏈及第二輕鏈；

其中，所述第一重鏈中的可變區(qū)為人源IgG型TNFα的抗體中的輕鏈的可變區(qū)；所述第一輕鏈中的可變區(qū)為該人源IgG型TNFα的抗體的重鏈中的可變區(qū)；和/或

所述第二重鏈中的可變區(qū)為人源IgG型IL-17A抗體的輕鏈中的可變區(qū)；所述第二輕鏈中的可變區(qū)為該人源IgG型IL-17A的抗體的重鏈中的可變區(qū)；

所述第一重鏈與第二重鏈中的恒定區(qū)依靠增強的靜電作用和/或疏水作用相互結(jié)合。

優(yōu)選地，所述增強的靜電作用是通過將所述人源IgG型TNFα的抗體的重鏈中的恒定區(qū)進行D360K和/或D403K突變，將人源IgG型IL-17A的抗體的重鏈中的恒定區(qū)進行K402D和/或K419D突變得以實現(xiàn)的。

更優(yōu)選地，所述人源IgG型TNFα的抗體的重鏈為SEQ ID NO:1，在該人源IgG型TNFα的抗體的重鏈中的第360、403位氨基酸均由Asp替換為Lys；所述人源IgG型IL-17A的抗體的重鏈為SEQ ID NO:2，所述人源IgG型IL-17A的抗體的重鏈中的第402、419位由Lys替換為Asp。

由于天然的抗體是同源二聚體，為了產(chǎn)生異源二聚體并使異源二聚體的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于同源二聚體的表達(dá)量，本發(fā)明解決了重鏈的異源二聚體的結(jié)合以及輕鏈異源二聚體的結(jié)合的技術(shù)問題，具體而言，本發(fā)明通過增強的靜電作用或疏水作用使得異源的所述第一重鏈與第二重鏈的結(jié)合大于同源重鏈之間的結(jié)合，例如將抗體的Fc段用定點突變的方法，改變抗體Fc段的作用力，使得同源二聚體相互排斥，而異源二聚體相互作用力增強；更具體地，例如將人源IgG型TNFα的抗體的重鏈的Fc段進行D360K/D403K的突變，將人源IgG型IL-17A的抗體的重鏈的Fc段進行K402D/K419D的突變，從而使得第一重鏈與第二重鏈通過靜電作用結(jié)合形成異源二聚體。為了防止輕鏈與重鏈之間的錯配，本發(fā)明將重鏈可變區(qū)與該重鏈對應(yīng)的輕鏈的可變區(qū)互換，例如將IL-17A抗體的輕鏈可變區(qū)V_L與該IL-17A抗體的重鏈可變區(qū)V_H位置互換，又由于抗體分子輕鏈只與重鏈作用，從而防止了輕鏈之間的錯配。與現(xiàn)有雙特異性抗體相比，本發(fā)明所述雙特異性抗體在構(gòu)型方面，尤其是Fc段的構(gòu)型設(shè)計上，其穩(wěn)定性及異源二聚體結(jié)合的特異性方面優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)。

本發(fā)明采用ELISA檢測雙特異性抗體對IL-17A與TNFα的親和力，相較于抗TNFα、抗IL-17A的單克隆抗體，本發(fā)明所述雙特異性抗體與抗原親和力與單克隆抗體相比沒有顯著的差異；采用用圓二色譜CD檢測雙特異性抗體的熱穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)其熱穩(wěn)定性與天然的單克隆抗體幾乎沒有差別。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，在本發(fā)明所述的IgG雜合型抗TNFα和IL-17A雙特異性抗體或來源于該抗體的能夠特異性結(jié)合TNFα和IL-17A的生物活性片段中，其中，所述第一重鏈具有如SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述第一輕鏈具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列，所述第二重鏈具有如SEQ ID NO:5的氨基酸序列，所述第二輕鏈具有如SEQ ID NO:6的氨基酸序列；

本發(fā)明提供的具有SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:6的雙特異性抗體具有較小的分子量(150kDa)，相較于現(xiàn)有技術(shù)提供的大于200kDa的雙特異性抗體，本發(fā)明提供雙特異性抗體更接近天然的人源IgG抗體分子，使其有更好的生物相容性。

另一方面，本發(fā)明提供一種編碼本發(fā)明所述的IgG雜合型抗TNFα和IL-17A雙特異性抗體或其生物活性片段的DNA分子，其包含編碼具有SEQ ID NO:3的氨基酸的核苷酸序列，優(yōu)選地，該核苷酸序列為SEQ ID NO:7。

本發(fā)明提供一種編碼本發(fā)明所述的IgG雜合型抗TNFα和IL-17A雙特異性抗體或其生物活性片段的DNA分子，其包含編碼具有SEQ ID NO:5的氨基酸的核苷酸序列，優(yōu)選地，該核苷酸序列為SEQ ID NO:9。

本發(fā)明提供一種編碼本發(fā)明所述的IgG雜合型抗TNFα和IL-17A雙特異性抗體或其生物活性片段的DNA分子，其包含編碼具有SEQ ID NO:6的氨基酸的核苷酸序列，優(yōu)選地，該核苷酸序列為SEQ ID NO:10。

另一方面，本發(fā)明提供分泌本發(fā)明所述的IgG雜合型抗TNFα和IL-17A雙特異性抗體的HEK293F人腎胚細(xì)胞，其包含編碼具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6的氨基酸的核苷酸序列，以及編碼具有SEQ ID NO:4的氨基酸的核苷酸序列，優(yōu)選地，該核苷酸序列為SEQ ID NO:8；

優(yōu)選地，編碼具有所述SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6的氨基酸的核苷酸序列被整合在質(zhì)粒上；該質(zhì)?？赏ㄟ^電轉(zhuǎn)化方法或化學(xué)轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染到293F細(xì)胞株中進行表達(dá)。本發(fā)明通過SDS-PAGE及western blot檢測表明抗體表達(dá)的結(jié)構(gòu)功能正確。

另一方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生IgG雜合型抗TNFα和IL-17A雙特異性抗體的方法，其包含在使得該雙特異性抗體表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明所述的HEK293F人腎胚細(xì)胞，及回收所表達(dá)的雙特異性抗體。

另一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含本發(fā)明所述的IgG雜合型抗TNFα和IL-17A雙特異性抗體或其生物活性片段。

另一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明所述的IgG雜合型抗TNFα和IL-17A雙特異性抗體或其生物活性片段或所述的藥物組合物在制備用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、牛皮癬、銀屑病或腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

另一方面，本發(fā)明提供一種檢測TNFα或IL-17A水平的試劑盒，其含有本發(fā)明所述的IgG雜合型抗TNFα和IL-17A雙特異性抗體或其生物活性片段；優(yōu)選所述的試劑盒還含有第二抗體和用于檢測的酶或熒光或放射標(biāo)記物，以及緩沖液；優(yōu)選所述第二抗體為抗本發(fā)明所述雙特異性抗體的抗抗體或抗TNFα或IL-17A的多抗。

本發(fā)明開發(fā)的新型穩(wěn)定人源IgG型雙特異性抗體(BiAbs)，是針對TNFα和IL-17A這兩種抗原的分子，既保留了抗TNFα的抗體結(jié)合的功能特性，又具有和T細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-17A結(jié)合的附加活性，因此這種分子相較于單純針對其中一個分子的單克隆抗體對于炎癥性疾病以及自身免疫性疾病都有更好的治療效果，本發(fā)明通過體外實驗證明可以阻斷炎癥因子對細(xì)胞的損傷，與單克隆抗體相比，有明顯的優(yōu)勢，具有廣闊的應(yīng)用前景。更為重要的是，本發(fā)明所述的雙特異性抗體具有較小的分子量(150kDa)，相較于現(xiàn)有技術(shù)提供的大于200kDa的雙特異性抗體，更接近天然的人源IgG抗體分子，使其有更好的生物相容性。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明所述雙特異性抗體在構(gòu)型方面，尤其是Fc段的構(gòu)型設(shè)計上，其穩(wěn)定性，及異源二聚體結(jié)合的特異性方面優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)；

(2)與抗TNFα或抗IL-17A單克隆抗體相比，本發(fā)明所述雙特異性抗體在親和力、穩(wěn)定性、純度方法無差異；

(3)與現(xiàn)有技術(shù)提供的雙特異性抗體比較，具有SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:6的的雙特異性具有較小的分子量(150kDa)，更接近天然的人源IgG抗體分子，使其有更好的生物相容性；

(4)與現(xiàn)有的原核表達(dá)載體比較，本發(fā)明的載體為真核表達(dá)系統(tǒng)，符合國家FDA臨床審批藥物的標(biāo)準(zhǔn)。

附圖說明

圖1為構(gòu)建本發(fā)明雙特異抗體的示意圖；

圖2為實施例1中所使用的pcDNA3.1(+)-GS-intron-IRES-CH質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖；

圖3A～圖3D為實施例1ELSA實驗結(jié)果圖；

圖4為實施例1SDS-PAGE實驗結(jié)果圖；

圖5為實施例1用L929細(xì)胞檢測雙特異性抗體對TNF-α的拮抗作用的實驗結(jié)果圖；

圖6A～6E為實施例1實時PCR實驗結(jié)果圖；

圖7為實施例1圓二色譜CD測量抗體的T_m值的實驗結(jié)果圖。

具體實施方式

為了對本發(fā)明的技術(shù)特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，現(xiàn)結(jié)合具體實施例及附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進行以下詳細(xì)說明，應(yīng)理解這些實例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中，各原始試劑材料均可商購獲得，未注明具體條件的實驗方法為所屬領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法和常規(guī)條件，或按照儀器制造商所建議的條件。

實施例1

(1)質(zhì)粒的構(gòu)建

(1.1)抗TNFα抗體基因的重組載體構(gòu)建

(1.1.1)含抗TNFαV_H基因(SEQ ID NO:11)的重組載體pcDNA3.1(+)-GS-intron-IRES-V_H-C_H的構(gòu)建

(1.1.1.1)全基因合成抗TNFα的V_H(SEQ ID NO:11)核苷酸序列DNA分子，提取其質(zhì)粒分別采用BamHI以及NheI限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別于37℃酶切過夜，酶切后膠回收450bp酶切片段；

(1.1.1.2)提取pcDNA3.1(+)-GS-intron-IRES-C_H質(zhì)粒(該質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)如圖2所示，該質(zhì)粒中CH即為TNFα的C_H基因)，將步驟(1.1.1.1)回收的V_H基因及所述pcDNA3.1(+)-GS-intron-IRES-CH質(zhì)粒分別采用BamHI以及NheI內(nèi)切酶進行酶切，分別于37℃酶切過夜酶切后膠回收酶切片段，膠回收步驟參見Genstar貨號為D205-04的說明書；

(1.1.1.3)抗TNFαV_H基因和pcDNA3.1(+)-GS-intron-IRES-CH質(zhì)粒的連接；

取酶切后回收的pcDNA3.1(+)-GS-intron-IRES-CH質(zhì)粒，與膠回收的V_H基因采用Thermo貨號為EL0011的T4連接酶進行連接；

22℃恒溫金屬浴上連接1h后轉(zhuǎn)化DH5α，涂布Amp⁺LB平板，37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置過夜培養(yǎng)；

(1.1.1.4)菌液PCR鑒定

涂布于含Amp的LB固體平板培養(yǎng)基，挑取6個Amp⁺LB平板上的單菌落接種至4ml Amp⁺LB培養(yǎng)基中，37℃200rpm培養(yǎng)4h后進行菌落PCR鑒定是否含有陽性克隆，陽性克隆即表示抗TNFαV_H基因與pcDNA3.1(+)-GS-intron-IRES-CH質(zhì)粒成功連接。

(1.1.2)含抗TNFαV_L-C_L基因的重組載體pcDNA3.1(+)-GS-intron-LC-IRES-V_H-CH的構(gòu)建

(1.1.2.1)V_L基因(SEQ ID NO：12)的克隆

a)提供上游引物和下游引物，其中，該上游引物的堿基序列tctGCGGCCGCGCCGCCACCATG(SEQ ID NO：13)，該下游引物的堿基序列g(shù)agggggcggccacggtcttgatttccaccttggt(SEQ ID NO：14)；

b)全基因合成核苷酸序列V_L(SEQ ID NO：12)為PCR模板，采用PCR擴增V_L基因；

PCR完成后，膠回收400bp附近的條帶，膠回收步驟參見Genstar貨號為D205-04的說明書；

(1.1.2.2)C_L基因(SEQ ID NO：15)的克隆

a)提供上游引物accaaggtggaaatcaagaccgtggccgccccctc(SEQ ID NO:16)和下游引物agaCTCGAGCTAGCACTCG(SEQ ID NO:17)；

b)全基因合成核苷酸序列C_L基因(SEQ ID NO：15)的DNA分子作為PCR模板，采用PCR擴增C_L基因；

PCR完成后，膠回收400bp附件的條帶，膠回收步驟參見Genstar貨號為D205-04的說明書。

(1.1.2.3)重疊PCR擴增V_L(SEQ ID NO：12)和C_L(SEQ ID NO：15)

配置擴增體系如下:

PCR擴增程序為：

循環(huán)結(jié)束后加入如下引物V_L-F及引物C_L-R，繼續(xù)擴增；

引物V_L-F:tctGCGGCCGCGCCGCCACCATG(SEQ ID NO:18)；

引物C_L-R：agaCTCGAGCTAGCACTCG(SEQ IN NO:19)；

上述引物V_L-F(20mM) 0.5μl

上述引物C_L-R(20mM) 0.5μl

PCR擴增程序如下：

PCR完成后，膠回收700bp附件的條帶，膠回收步驟參見Genstar貨號為D205-04的說明書；

(1.1.2.4)pcDNA3.1(+)-GS-intron-IRES-V_H-CH質(zhì)粒的酶切；

提取由步驟(1.1.1)獲得的含抗TNFαV_H基因(SEQ ID NO:11)的重組載體pcDNA3.1(+)-GS-intron-IRES-V_H-CH質(zhì)粒，將步驟(1.1.2.3)回收的V_L-C_L基因及所述pcDNA3.1(+)-GS-intron-IRES-V_H-CH質(zhì)粒分別采用NotI以及XhoI內(nèi)切酶進行酶切；

37℃過夜酶切約6h后膠回收酶切片段；

(1.1.2.5)V_L-C_L基因和pcDNA3.1(+)-GS-intron-IRES-V_H-CH質(zhì)粒的連接；

取酶切后回收的pcDNA3.1(+)-GS-intron-IRES-V_H-CH質(zhì)粒，與膠回收的V_L-C_L基因采用Thermo貨號為EL0011的T4連接酶進行連接；

22℃恒溫金屬浴上連接1h后轉(zhuǎn)化DH5α，涂布Amp⁺LB平板，37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置過夜培養(yǎng)；

(1.1.2.6)菌液PCR鑒定

涂布于含Amp的LB固體平板培養(yǎng)基，挑取4個Amp⁺LB平板上的單菌落接種至4ml Amp⁺LB培養(yǎng)基中，37℃200rpm培養(yǎng)4h后進行菌落PCR鑒定是否含有陽性克隆，陽性克隆即表示抗TNFαV_L-C_L基因與pcDNA3.1(+)-GS-intron–IRES-V_H-C_H質(zhì)粒成功連接，即構(gòu)建好抗TNFα單克隆抗體質(zhì)粒。

(1.2)抗IL-17A抗體基因的重組載體的構(gòu)建

(1.2.1)含抗IL-17A V_H基因(SEQ ID NO:20)的重組載體pcDNA3.1(+)-GS-intron-IRES-V_H-CH的構(gòu)建

(1.2.1.1)全基因合成抗IL-17A的V_H核苷酸序列(SEQ ID NO:20)DNA分子，提取其質(zhì)粒分別采用BamHI以及NheI限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別于37℃酶切過夜酶切后膠回收450bp酶切片段；

(1.2.1.2)提取pcDNA3.1(+)-GS-intron-IRES-CH質(zhì)粒(該質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)如圖2所示，該質(zhì)粒中CH即為IL-17A的C_H基因)，將步驟(1.2.1.1)回收的V_H基因及所述pcDNA3.1(+)-GS-intron-IRES-CH質(zhì)粒分別采用BamHI以及NheI內(nèi)切酶進行酶切；分別于37℃酶切過夜酶切后膠回收酶切片段；膠回收步驟參見Genstar貨號為D205-04的說明書；

(1.2.1.3)抗IL-17A V_H基因和pcDNA3.1(+)-GS-intron-IRES-CH質(zhì)粒的連接；

取酶切后回收的pcDNA3.1(+)-GS-intron-IRES-CH質(zhì)粒，與膠回收的V_H基因采用Thermo貨號為EL0011的T4連接酶進行連接；

22℃恒溫金屬浴上連接1h后轉(zhuǎn)化DH5α，涂布Amp⁺LB平板，37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置過夜培養(yǎng)；

(1.2.1.4)菌液PCR鑒定

涂布于含Amp的LB固體平板培養(yǎng)基，挑取6個Amp⁺LB平板上的單菌落接種至4ml Amp⁺LB培養(yǎng)基中，37℃200rpm培養(yǎng)4h后進行菌落PCR鑒定是否含有陽性克隆，陽性克隆即表示抗IL-17A V_H基因與pcDNA3.1(+)-GS-intron-IRES-CH質(zhì)粒成功連接。

(1.2.2)含抗IL-17A V_L-C_L基因的重組載體pcDNA3.1(+)-GS-intron-LC-IRES-V_H-C_H的構(gòu)建

(1.2.2.1)V_L基因(SEQ ID NO:21)的克隆

a)提供上游引物和下游引物，其中，該上游引物的堿基序列tctGCGGCCGCGCCGCCACCATG(SEQ ID NO:22)，該下游引物的堿基序列g(shù)agggggcggccacggtccgcttgatttccagtcT(SEQ ID NO:23)；

b)全基因合成V_L核苷酸序列(SEQ ID NO:21)為PCR模板，采用PCR擴增V_L基因；

PCR完成后，膠回收400bp附近的條帶，膠回收步驟參見Genstar貨號為D205-04的說明書；

(1.2.2.2)C_L基因(SEQ ID NO:15)的克隆

a)提供上游引物Agactggaaatcaagcggaccgtggccgccccctc(SEQ ID NO:24)和下游引物agaCTCGAGCTAGCACTCG(SEQ ID NO:25)；

b)全基因合成C_L核苷酸序列(SEQ ID NO:15)的DNA分子作為PCR模板，采用PCR擴增C_L基因。

PCR完成后，膠回收400bp附件的條帶，膠回收步驟參見Genstar貨號為D205-04的說明書。

(1.2.2.3)重疊PCR擴增V_L(SEQ ID NO:21)和C_L(SEQ ID NO:15)

配置擴增體系如下:

PCR擴增程序為：

循環(huán)結(jié)束后加入如下引物V_L-F及引物C_L-R，繼續(xù)擴增；

該引物V_L-F具有序列：tctGCGGCCGCGCCGCCACCATG(SEQ ID NO:26)；

該引物C_L-R具有序列：agaCTCGAGCTAGCACTCG(SEQ ID NO:27)；

上述引物V_L-F(20mM) 0.5μl

上述引物C_L-R(20mM) 0.5μl

PCR擴增程序如下：

PCR完成后，膠回收700bp附件的條帶，膠回收步驟參見Genstar貨號為D205-04的說明書。

(1.2.2.4)pcDNA3.1(+)-GS-intron-IRES-V_H-CH質(zhì)粒的酶切；

提取步驟(1.2.1)制得的含抗IL-17A V_H基因(SEQ ID NO:20)的重組載體pcDNA3.1(+)-GS-intron-IRES-V_H-CH質(zhì)粒，將步驟(1.2.2.3)回收的V_L-C_L基因及所述pcDNA3.1(+)-GS-intron-IRES-V_H-CH質(zhì)粒分別采用NotI以及XhoI內(nèi)切酶進行酶切。

37℃過夜酶切約6h，后膠回收酶切片段。

(1.2.2.5)V_L-C_L和pcDNA3.1(+)-GS-intron-IRES-V_H-CH質(zhì)粒的連接；

取酶切后回收的pcDNA3.1(+)-GS-intron-IRES-V_H-CH質(zhì)粒，與膠回收的V_L-C_L因采用Thermo貨號為EL0011的T4連接酶進行連接；

22℃恒溫金屬浴上連接1h后轉(zhuǎn)化DH5α，涂布Amp⁺LB平板，37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置過夜培養(yǎng)。

(1.2.2.6)菌液PCR鑒定

涂布于含Amp的LB固體平板培養(yǎng)基，挑取4個Amp⁺LB平板上的單菌落接種至4ml Amp⁺LB培養(yǎng)基中，37℃200rpm培養(yǎng)4h后進行菌落PCR鑒定是否含有陽性克隆，陽性克隆即表示抗IL-17A V_L-C_L基因與pcDNA3.1(+)-GS-intron–IRES-V_H-CH質(zhì)粒成功連接，即構(gòu)建好抗IL-17A單克隆抗體質(zhì)粒。

以上構(gòu)建了抗TNFα單克隆抗體質(zhì)粒及抗IL-17A的單克隆抗體的質(zhì)粒。

(1.3)雙特異性抗體質(zhì)粒的構(gòu)建(構(gòu)建過程如圖1所示)：

(1.3.1)CH基因片段定點突變

(1.3.1.1)將構(gòu)建完成的如上的抗TNFα單克隆抗體的質(zhì)粒的CH片段處DNA序列進行定點突變，第一個突變點為：

D360K

引物對1

上游引物:5'CTGCCCCCATCCCGGAAGGAGCTGACCAAGAAC 3'(SEQ ID NO:28)

下游引物:5'GTTCTTGGTCAGCTCCTTCCGGGATGGGGGCAG 3'(SEQ ID NO:29)

配置擴增體系如下:

PCR擴增程序如下：

擴增16個循環(huán)以后將PCR產(chǎn)物用NEB的Dpn1酶進行切割，去除PCR模板37℃恒溫金屬浴上連接1h后轉(zhuǎn)化DH5α；

37℃過夜培養(yǎng)挑取4個Amp⁺LB平板上的單菌落接種至4ml Amp⁺LB培養(yǎng)基中，37℃200rpm培養(yǎng)4h送去測序公司進行測序。

(1.3.1.2)測序正確后進行第二個定點突變D403K

引物序列如下：

引物對2

上游引物:5'GCCTCCCGTGCTGAAGTCCGACGGCTCC 3'(SEQ ID NO:30)；

下游引物:5'GGAGCCGTCGGACTTCAGCACGGGAGGC 3'(SEQ ID NO:31)；

突變過程同上步驟(1.3.1.1)；

(1.3.1.3)將構(gòu)建完成如上的抗IL-17A單克隆抗體的質(zhì)粒的CH片段DNA序列進行定點突變

第一個突變點為K402D

引物對3

上游引物:5'CCGGAGAACAACTACGACACCACGCCTCCCGTG 3'(SEQ ID NO:32)；

下游引物:5'CACGGGAGGCGTGGTGTCGTAGTTGTTCTCCGG 3'(SEQ ID NO:33)；

(1.3.1.4)第二個突變點為K419D

引物對4

上游引物:5'CCTTCTTCCTCTACAGCGACCTCACCGTGGACAAGAG 3'(SEQ ID NO:34)

下游引物:5'CTCTTGTCCACGGTGAGGTCGCTGTAGAGGAAGAAGG 3'(SEQ ID NO:35)

實驗過程同上步驟(1.3.1.1)；

(1.3.2)將CH基因序列含有抗IL-17A的區(qū)域突變的質(zhì)粒的V_L(SEQ ID NO:21)區(qū)域交換到V_H(SEQ ID NO:20)區(qū)域

(1.3.2.1)將V_L區(qū)域進行PCR

a)提供上游引物和下游引物，其中，該上游引物的堿基序列tctGGATCCCCGCCACCATGGGCTG(SEQ ID NO:36)，該下游引物的堿基序列TCTGCTAGCTTGGTGGAGGCccgcttgatttccagt(SEQ ID NO:37)；

b)全基因合成V_L核苷酸序列為PCR模板，采用PCR擴增V_L基因。

PCR完成后，膠回收400bp附近的條帶，膠回收步驟參見Genstar貨號為D205-04的說明書；

(1.3.2.2)片段與質(zhì)粒進行酶切

a)將PCR片段分別采用BamHI以及NheI限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別于37℃酶切過夜酶切后膠回收400bp酶切片段；

b)將構(gòu)建好的CH基因序列突變的抗IL-17A的質(zhì)粒分別采用BamHI以及NheI限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別于37℃酶切過夜酶切后膠回收酶切片段；

(1.3.2.3)將酶切好的片段及質(zhì)粒的連接，采用Thermo貨號為EL0011的T4連接酶進行連接；

22℃恒溫金屬浴上連接1h后轉(zhuǎn)化DH5α，涂布Amp⁺LB平板，37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置過夜培養(yǎng)；

(1.3.2.4)菌液PCR鑒定

涂布于含Amp的LB固體平板培養(yǎng)基，挑取6個Amp⁺LB平板上的單菌落接種至4ml Amp⁺LB培養(yǎng)基中，37℃200rpm培養(yǎng)4h后進行菌落PCR鑒定是否含有陽性克隆，陽性克隆表示已通過PCR將連接進去的片段PCR擴增出來。

(1.3.3)將CH基因序列含有抗IL-17A的區(qū)域突變的質(zhì)粒的V_H(SEQ ID NO:20)區(qū)域交換到V_L(SEQ ID NO:21)區(qū)域

(1.3.3.1)全基因合成V_H核苷酸序列為PCR模板，采用PCR擴增V_H基因；提供上游引物和下游引物，其中，該上游引物的堿基序列tctGGATCCCGCCACCATGGGCTG(SEQ ID NO:38)，該下游引物的堿基序列CGGAGGGGGCGGCCACGGTAGATGACACGGTCACG(SEQ ID NO:39)；PCR完成后，膠回收450bp附近的條帶，膠回收步驟參見Genstar貨號為D205-04的說明書；

(1.3.3.2)C_L(SEQ ID NO:15)基因的克隆

本實施例所有的C_L基因均是相同的，抗體的輕鏈恒定區(qū)都是C_L，輕鏈恒定區(qū)在抗體里是恒定的，本實施例抗TNFα的單克隆抗體的C_L與抗IL-17A的單克隆抗體的C_L以及后續(xù)雙特異性抗體(BsAb)的C_L都是一個C_L序列，即SEQ ID NO：15；

a)提供上游引物CGTGACCGTGTCATCTACCGTGGCCGCCCCCTCCG(SEQ ID NO:40)和下游引物agaCTCGAGCTAGCACTCG(SEQ ID NO:41)；

b)全基因合成C_L核苷酸序列的DNA分子作為PCR模板，采用PCR擴增C_L基因；PCR完成后，膠回收400bp附件的條帶，膠回收步驟參見Genstar貨號為D205-04的說明書；

(1.3.3.3)然后用重疊PCR將V_H區(qū)域C_L連接在一起

配置擴增體系如下:

PCR擴增程序為：

循環(huán)結(jié)束后加入上下游引物引物，繼續(xù)擴增；

引物序列：

TctGGATCCCCGCCACCATGGGCTG(SEQ ID NO:42)

AgaCTCGAGCTAGCACTCG(SEQ ID NO:43)

PCR擴增程序如下：

PCR完成后，膠回收800bp附件的條帶，膠回收步驟參見Genstar貨號為D205-04的說明書；

(1.3.3.4)將重疊PCR產(chǎn)物與CH基因序列突變的抗IL-17A質(zhì)粒進行雙酶切

分別采用NotI以及XhoI內(nèi)切酶進行酶切；

37℃過夜酶切約6h，后膠回收酶切片段；

(1.3.3.5)取酶切后回收的重疊PCR產(chǎn)物與CH基因序列突變的抗IL-17A質(zhì)粒用Thermo貨號為EL0011的T4連接酶進行連接，22℃恒溫金屬浴上連接1h后轉(zhuǎn)化DH5α，涂布Amp⁺LB平板，37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置過夜培養(yǎng)；

(1.3.3.6)菌液PCR鑒定以及酶切鑒定

涂布于含Amp的LB固體平板培養(yǎng)基，挑取4個Amp⁺LB平板上的單菌落接種至4ml Amp⁺LB培養(yǎng)基中，37℃200rpm培養(yǎng)4h后進行菌落PCR鑒定是否含有陽性克隆，陽性克隆表示已通過PCR將連接進去的片段PCR擴增出來。

(2)將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293F細(xì)胞中進行表達(dá)

本實施例采用瞬時轉(zhuǎn)染的方法將步驟(1)中構(gòu)建好的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HEK293F細(xì)胞株內(nèi)，其中，所述質(zhì)粒分別為如上構(gòu)建好的抗TNFα單克隆抗體的質(zhì)粒及抗IL-17A單克隆抗體的質(zhì)粒，用于分別表達(dá)兩個單克隆抗體，以及如上構(gòu)建好的CH突變的抗TNFα質(zhì)粒與CH突變的且V_H與V_L互換的抗IL-17A的質(zhì)粒，其中，CH突變的抗TNFα質(zhì)粒與CH突變的且V_H與V_L互換的抗IL17A的質(zhì)粒質(zhì)量比為1:1，即每種質(zhì)粒25μg，總量50μg進行轉(zhuǎn)染，用來表達(dá)雙特異性抗體(BsAb)；

瞬時轉(zhuǎn)染所用轉(zhuǎn)染試劑為PEI25000，且質(zhì)粒：PEI25000轉(zhuǎn)染的質(zhì)量比例為1:2，轉(zhuǎn)染步驟包括：

(2.1)轉(zhuǎn)染前24h細(xì)胞稀釋到5×10⁵個/ml；

(2.2)轉(zhuǎn)染的時候，將PBS預(yù)熱到解凍DNA和PEI25000；

(2.3)用細(xì)胞計數(shù)器確認(rèn)細(xì)胞的密度和活性，細(xì)胞密度應(yīng)該在5×10⁸個/ml到1.2×10⁶個/ml之間，活性應(yīng)該大于95％；

(2.4)取45ml細(xì)胞放到一個新的搖瓶當(dāng)中；

(2.5)取5mlPBS放到15ml離心桶當(dāng)中，分別取20μg取步驟(1)制備好的質(zhì)粒加入到15ml離心桶當(dāng)中混勻；

(2.6)加入40μl濃度為1mg/ml的PEI25000溶液，放入離心桶當(dāng)中，混勻，渦旋震蕩3次，每次3秒鐘；

(2.7)將溶液放置室溫15分鐘；將細(xì)胞培養(yǎng)瓶取出，加入質(zhì)粒/PEI25000混合溶液，邊震蕩邊加入，將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為4天；

(2.8)4天后，將細(xì)胞離心，收集細(xì)胞上清液。

(3)ELISA檢測

(3.1)細(xì)胞因子TNFα與IL-17A用包被液稀釋后，每孔加入50ng的細(xì)胞因子，4℃冰箱過夜包；

(3.2)用PBST洗滌5次；

(3.3)加10g/LBSA，于37℃封閉2h；

(3.4)用PBST洗滌5次；

(3.5)加入三種抗體上清液，每個濃度的抗體設(shè)兩個復(fù)孔，抗-TNFα、抗-IL-17A、雙特異性抗體，三種抗體上清液3倍3倍用PBS進行稀釋，最高濃度為上清原液；以未轉(zhuǎn)入HEK293F細(xì)胞上清液為陰性對照，以BSA稀釋液為空白對照；37℃1h。抗-TNFα抗體只加入到細(xì)胞因子TNFα包被的孔中，抗-IL 17A的抗體只加入到細(xì)胞因子IL17A包被的孔中，而BsAb則分別加入到這兩種細(xì)胞因子包被的孔中；

(3.6)用PBST洗滌5次；

(3.7)加入HRP抗-人-IgG；

(3.8)用PBST洗滌5次；

(3.9)加入TMD底物顯色；

(3.10)加入2mol/L硫酸終止反應(yīng)；

(3.11)用酶聯(lián)儀測OD450nm的吸光值；

陽性孔ELISA的實驗結(jié)果如圖3A～3D所示，從圖3A～3D中可以看出所構(gòu)建表達(dá)的抗TNFα抗體與抗原TNFα有很強的結(jié)合作用，所構(gòu)建表達(dá)的抗IL17A抗體與抗原IL17A有很強的結(jié)合作用，所構(gòu)建表達(dá)的雙特異性抗體與兩種抗原都有很強的結(jié)合作用，而且結(jié)合作用與單克隆抗體類似。

(4)抗體的純化：將收集的上清液，準(zhǔn)備純化抗體蛋白。所有表達(dá)，純化，都是三種抗體同時進行的，抗-TNFα，抗-IL17A及雙特異性抗體(BsAb)；

用蛋白質(zhì)A(Protein A)純化IgG

(4.1)純化前將細(xì)胞上清液用0.45μm的濾膜過濾一下；

(4.2)準(zhǔn)備0.3ml蛋白質(zhì)A放入濃縮色譜柱中(BIO-RAD poly-prep chromatography columns)，用pH7.4的PBS洗滌柱子一次；

(4.3)用細(xì)胞上清液過柱子兩次；

(4.4)2×10mL PBS清洗；

(4.5)用1ml濃度為的醋酸鈉(pH3)和0.25mL 1M Tris-HCl pH8.0進行中和。醋酸的濃度為50mM，氯化鈉的濃度為0.15M；

(4.6)用10K的超濾管對濃縮后的抗體進一步進行超濾濃縮；

(5)SDS-PAGE鑒定：其中分離膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12％

分別取適量樣品加等量2×SDS上樣緩沖液，用微量移液器加入加樣槽，以8v/cm電壓電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)前沿進入分離膠后，以12v/cm電壓電泳，溴酚藍(lán)電泳至分離膠底部后，取出凝膠，考馬斯亮藍(lán)染色液染色，脫色液脫色至蛋白條帶清晰，所得結(jié)果如圖4所示，圖4中左側(cè)是變性蛋白，右側(cè)是未變性蛋白，該未變性的蛋白是蛋白電泳中的上樣緩沖液(loading Buffer)沒有加巰基乙醇，蛋白電泳上樣前，沒有煮樣，該變性蛋白是上樣緩沖液(loading buffer)里邊加了巰基乙醇，上樣之前在105℃下煮樣10min，從圖4可以看出抗體的總大小150KD左右，其與天然抗體的大小相似；

本實施例所得抗TNFα的單克隆抗體即為阿達(dá)木單抗(Adalimumab)，參見US6090382；

本實施例所得抗IL-17A的單克隆抗體即為secukinumab單抗，參見US20130202610；

本實施例所得雙特異性抗體(BsAb)具有SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

(6)用L929細(xì)胞檢測雙特異性抗體對TNF-α的拮抗作用

L929細(xì)胞對TNF-α敏感，用人重組TNF-α及放線菌素D對細(xì)胞進行聯(lián)合誘導(dǎo)，細(xì)胞迅速死亡，加入抗體后，細(xì)胞存活率明顯升高；細(xì)胞培養(yǎng)條件：RPMI1640+10％FBS，37℃培養(yǎng)，CO₂濃度為5％；當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期的時候?qū)⒓?xì)胞用胰酶消化，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞的密度調(diào)整為1×10⁵個/mL，將細(xì)胞均勻加入96孔板中，每孔100μl，過夜培養(yǎng)；將細(xì)胞分為空白組，雙特異性抗體組(BsAb)，TNFα抗體組及IL 17A抗體組，這三種抗體均為本實施例所得；空白組用人重組TNFα及放線菌素D進行聯(lián)合誘導(dǎo)，其余四組先用人重組TNFα及放線菌素D與抗體蛋白混合，其中，放線菌素D終濃度為4μg/mL，人重組TNFα為25ng/mL，抗體蛋白濃度為50ng/mL；37℃放置1h后，加入L929細(xì)胞當(dāng)中；24h后用MTT方法檢測細(xì)胞的存活率，所得結(jié)果如圖5所示，從圖5中可以看出雙特異性抗體與抗原TNFα的結(jié)合能力與TNFα抗體與抗原結(jié)合能力幾乎一直，都能阻礙人重組蛋白TNFα與L929細(xì)胞的結(jié)合。

(7)實時PCR實驗

該實驗用于檢測本實施例所得雙特異性抗體(BsAb)、TNFα抗體及IL-17A抗體對HT-29細(xì)胞分泌趨化因子的效果；

HT-29為人結(jié)腸癌細(xì)胞，同時具有IL17A及TNFα蛋白的受體，當(dāng)與這兩種蛋白結(jié)合的時候，細(xì)胞當(dāng)中趨化因子的含量會顯著提高，為了檢測本實施例所得雙特異性抗體對這兩種細(xì)胞因子的拮抗作用，設(shè)計了如下實驗：

HT-29細(xì)胞培養(yǎng)條件：RPMI1640+10％FBS，37℃，5％CO₂；當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，用胰酶將細(xì)胞消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10⁶/mL，將細(xì)胞放入6孔板當(dāng)中，每孔加入2mL細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)24h后，將細(xì)胞培養(yǎng)基上清去掉，換成含0.5％血清的培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)后，將細(xì)胞分為五組，空白組，誘導(dǎo)組，TNFα抗體組，IL 17A抗體組，雙特異性抗體(BsAb)組，加藥處理；空白組不加任何藥品，誘導(dǎo)組加入重組人TNFα及IL 17A細(xì)胞因子，TNFα濃度為0.5ng/mL，IL 17A濃度為50ng/mL；其余幾組除加入上述濃度的重組人細(xì)胞因子外，還需要加入相應(yīng)抗體，抗體的濃度均為100ng/mL；加藥處理12h后，提取細(xì)胞的總RNA，用實時PCR檢測HT-29細(xì)胞趨化因子表達(dá)情況，所得結(jié)果如圖6A～6E所示，其分別代表趨化因子CXCL1，CXCL2，CXCL6，IL8，CCL20的結(jié)果圖，從圖6A～6E中可以看出在重組人TNFα及IL 17A細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下，HT-29細(xì)胞趨化因子CXCL1，CXCL2，CXCL6，IL8，CCL20的表達(dá)量明顯上調(diào)，在抗TNFα抗體和抗IL17A抗體的以及雙特異性抗體的作用下，這幾種趨化因子的表達(dá)量都顯著下調(diào)，而且還可以看出，雙特異性抗體的作用要比單克隆抗體的效果更好。

(8)圓二色譜CD測量抗體的T_m值的實驗

采用圓二色譜CD測量本實施例所得抗體的T_m值，該實驗采用的儀器型號為JASCO J-815，其包括如下步驟：

(8.1)樣品濃度為0.5mg/ml，將200μl樣品加入到樣品杯當(dāng)中，樣品杯靠近左側(cè)放置，用后面的卡槽卡緊；

(8.2)T_m值的測定是在222nm波長下進行的；

(8.3)在軟件頁面處選擇溫度/波長(temperature/wave lengthe)界面進入T_m值測定；

選擇手型工具進行參數(shù)設(shè)定

溫度選擇從0度到100度，開始執(zhí)行即可；

所測得的結(jié)果如圖7所示，從圖7中可以看出抗IL-17A抗體的T_m值在82℃左右，雙特異性抗體與抗TNFα抗體的T_m值相近，大約在68℃左右，發(fā)現(xiàn)其熱穩(wěn)定性與天然的單克隆抗體幾乎沒有差別。