專利名稱：中期因子表達量的實時熒光定量rt-pcr檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測組織或細胞內中期因子(MK)的兩步實時熒光定量RT-PCR試 劑盒，屬于生物技術領域。該試劑盒可以用于直接檢測組織或細胞內的中期因子的mRNA含 量，從而對中期因子相關疾病，尤其是癌癥的診斷起到指導和參考的作用。
背景技術：
中期因子(midkine，MK)是一個新發(fā)現的促血管生成因子，它是經過研究所選定 的靶向序列。MK蛋是一種具有促細胞轉化、促有絲分裂作用、促腫瘤血管生成、抗細胞凋亡 和增強纖維蛋白溶解等腫瘤形成相關活性的堿性肝素結合性蛋白質。MK基因主要在胚胎期 表達，隨著發(fā)育的進展表達組織逐漸局限，成年期僅在小腸黏膜、甲狀腺、肺、腎、脾組織中 微量表達，而且(增添)表達量逐漸減少(移動)。研究證實，MK能調節(jié)細胞生長、存活和 分化，在許多不同類型的腫瘤中表達增強，包括食管癌、胃癌、結直腸癌、胰腺癌、膽囊癌、肺 癌、甲狀腺、乳腺、膀胱、子宮、卵巢、前列腺和肝癌、神經細胞瘤、惡性膠質瘤，陽性表達率介 于45% 90%之間。MK在腫瘤早期、潛伏期和癌前病變階段也呈高水平表達。最新研究也 發(fā)現肝細胞癌Ofepatocellular Carcinoma, HCC)高表達MK，可能參與肝內侵襲、轉移，并 與肝癌的發(fā)生、浸潤轉移，血管生成及預后密切相關。這表明MK在許多類型的腫瘤發(fā)生和生物學行為起重要作用。Friedrich等通過實 驗證實了 MK在腫瘤發(fā)生中的作用，在體內MK促進腫瘤細胞的生長，這種生長與腫瘤血管密 度的增加有關，同時證實MK有促進腫瘤血管生成的作用。Ruan等研究證實人口腔癌中MK 的表達與腫瘤血管生成相關。血管生成是腫瘤生長和轉移的基礎，腫瘤細胞生長超過2 3mm就需要有新生血管的生成。生理情況下，血管的生成是由內皮細胞生長因子和內皮細胞 抑制因子共同調節(jié)的，而腫瘤血管的生成正是這種平衡被破壞，內皮細胞刺激因子過度表 達或內皮細胞抑制因子的低表達都可以引起腫瘤血管的生成。MK在腫瘤組織中的過度表達 促進了腫瘤血管的形成，促進了腫瘤的生長和浸潤。多項有關MK功能的研究證實其參與腫瘤的生長、分化及腫瘤血管生成等過程，表 明MK在腫瘤演化過程中可能具有直接作用。由于MK特異表達于多種腫瘤組織，因而MK成 為腫瘤治療的新靶點，如利用MK抗體能抑制腫瘤細胞的生長。一些針對MK的基因治療也 有顯著的抗腫瘤作用。根據MK與肝癌相關研究，MK可能是抗血管生成治療肝癌的理想靶 位。本發(fā)明采用實時熒光定量PCR檢測組織或細胞中的MK mRNA表達情況，與Wfestern blotting等蛋白水平上的檢測方法相比，本發(fā)明具有靈敏度高和準確性好的優(yōu)點，是藥物 研究領域中的一個強有力的檢測手段。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的旨在提供一種簡便和靈敏度較高的用于檢測組織或細胞內的中期 因子表達量的試劑盒。
本發(fā)明采用的技術方案如下一種中期因子表達量的實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，主要包括中期因子DNA 標準品、特異性引物、PCR緩沖液、脫氧核糖核苷酸混合物(dNTP) ,DNA聚合酶和DNA熒光染 料，所述特異性引物序列如下上游弓丨物 MK up :5，-CtC CgC ggt cgc caa aaa gaa aga_3，；下游弓I物 MK down :5，-ccc cca tea cac gca ccc cag tt_3，為達到定量檢測的要求，本發(fā)明試劑盒中還可包括中期因子DNA標準品，所述中 期因子DNA標準品序列如下5，-ctccgcggtcgccaaaaagaaagataaggtgaagaagggcggcccggggagcgagtgcgctgagtg ggcctgggggccctgcacccccagcagcaaggattgcggcgtgggtttccgcgagggcacctgcggggcccagaccc agcgcatccggtgcagggtgccctgcaactggaagaaggagtttggagccgactgcaagtacaagtttgagaactgg ggtgcgtgtgatggggg-3 ‘ ο所述試劑盒中還可包括內參引物GAPDH作為對照，所述內參基因的引物序列如 下上游弓I物 GAPDH up :5，-gga gcc aaa agg gtc ate ate t_3，下游弓I物 GAPDH down :5，-agg ggc cat cca cag tct tct_3，所述GAPDH基因DNA標準品序列如下5，-ggagccaaaagggtcatcatctctgccccctctgctgatgcccccatgttcgtcatgggtgtgaac catgagaagtatgacaacagcctcaagatcatcagcaatgcctcctgcaccaccaactgcttagcacccctggccaa ggtcatccatgacaactttggtatcgtggaaggactcatgaccacagtccatgccatcactgccacccagaagactg tggatggcccct-3 ‘ ο本發(fā)明在對人中期因子mRNA序列分析和NCBI的blast驗證基礎上，設計出一對 特異性引物，采用Takara PrimeScriprt RT-PCR kit進行檢測。本發(fā)明關鍵在于特異性 引物的設計，試劑盒中其他組分比如緩沖液、dNTP、DNA聚合酶和DNA熒光染料的選擇及其 用量，可按本領域常規(guī)方法選擇。也可采用已將上述輔助組分按比例配制好的試劑盒，比如 Takara 公司的 STOR Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time)試劑盒等。所述試劑盒應用于實時檢測中期因子表達量時，可按本領域常規(guī)方法進行，具體 的方法如下提取樣品組織或細胞RNA，進行逆轉錄，逆轉錄產物與特異性引物、PCR緩沖液、脫 氧核糖核苷酸混合物、DNA聚合酶和DNA熒光染料配成PCR反應體系，進行熒光PCR擴增反 應，擴增產物置于定量熒光PCR儀進行熒光檢測；根據測得的樣品Ct值，獲得樣品中的中期 因子mRNA的相對表達量。為達到定量檢測的要求，所述方法也可包括配制梯度濃度的中期因子DNA標準 品溶液，中期因子DNA標準品溶液、特異性引物、PCR緩沖液、脫氧核糖核苷酸混合物、DNA 聚合酶和DNA熒光染料配成PCR反應體系，進行熒光PCR擴增反應，擴增產物置于定量熒光 PCR儀進行熒光檢測；根據Ct值與DNA標準品溶液濃度對數值關系，繪制標準曲線；根據測 得的樣品Ct值，對照制標準曲線，獲得樣品細胞中的中期因子表達量。所述方法也可同時以內參基因GAPDH的引物和內參基因DNA標準品進行PCR擴增反應，根據獲得得出待測樣品中期因子的Ct值，與內參基因GAPDH的Ct值相比較，計算出 校正后的中期因子mRNA相對數量。所述PCR反應條件為本領域常規(guī)反應條件。所述步驟中，PCR反應條件如下950C，2min ；95°C，20s ；56°C，20s ；72°C，40s40個循環(huán)；在延伸階段收集熒光。本發(fā)明具有靈敏度高和準確性好的優(yōu)點，是一個潛在的藥物研究檢測手段。使用 本發(fā)明設計的引物，可對組織或細胞中提取的人中期因子mRNA進行RT-PCR擴增，靈敏度極 高地檢測到表達的mRNA。


圖1為內參基因GAPDH實時熒光定量PCR的標準曲線圖。圖2為中期因子MK實時熒光定量PCR的標準曲線圖。圖3為實時熒光定量PCR擴增對數圖。圖4為MK基因表達情況。從左至右依次為空納米組，0. IuM MK反義寡核苷酸 + 納米組(0. IuM ASON+nano)，0. 2uM MK 反義寡核苷酸 + 納米組(0. 2uMAS0N+nano)，0. 4uM MK反義寡核苷酸+納米組(0. 4uM ASON+nano)，0. 8uMMK反義寡核苷酸+納米組(0. 8uM ASON+nano), 0. 8uM MK 反義寡核苷酸 + 脂質體組(0. 8uM ASON+lipo)。圖5為MK基因的抑制情況。從左至右依次為空納米組，0. IuM MK反義寡核苷酸 + 納米組(0. IuM ASON+nano)，0. 2uM MK 反義寡核苷酸 + 納米組(0. 2uMAS0N+nano), 0. 4uM MK反義寡核苷酸+納米組(0. 4uM ASON+nano)，0. 8uMMK反義寡核苷酸+納米組(0. 8uM ASON+nano),0. 8uM MK 反義寡核苷酸 + 脂質體組(0. 8uM ASON+lipo)。圖6為實時熒光定量PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖；空納米組，0. IuM MK反義寡核 苷酸 + 納米組(0. IuM ASON+nano)，0. 2uM MK 反義寡核苷酸 + 納米組(0. 2uM ASON+nano)， 0. 4uM MK反義寡核苷酸+納米組(0. 4uM ASON+nano), 0. 8uM MK反義寡核苷酸+納米組 (0. 8uM ASON+nano),0. 8uM MK 反義寡核苷酸 + 脂質體組(0. 8uM ASON+lipo)。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此實施例1 轉染細胞中期因子表達量實時熒光檢測1、中期因子(MK)的兩步實時熒光定量試劑盒組成一對特異性引物和內參引物、Takara SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect RealTime) 試劑盒、中期因子DNA標準品。2、中期因子(MK)的特異引物和內參引物MK up :5，-ctc cgc ggt cgc caa aaa gaa aga_3，禾口 MK down :5，-ccc cca tea cacgca ccc cag tt-3'0另夕卜，內參弓丨物 GAPDH up :5，-gga gcc aaa agg gtc ate ate t_3，GAPDH down -agg ggc cat cca cag tct tct-3'0
兩對引物均由Takara公司合成。3、試驗材料和試驗儀器H 印 G2(肝癌細胞)，AS0DN(反義寡核苷酸5，-CCCCGGGCCGCCCTTCTTCA-3，)和納米 制劑(酰氯膽固醇溶于無水氯仿，滴加N’，N’ - 二甲基乙二胺，滴加完畢后，減壓蒸發(fā)，無水 乙醇重結晶、洗滌，真空干燥，制得DC-Chol。將IOmg的DC-Chol與8mg的DOPE用IOml的無 水氯仿溶解，置旋轉蒸發(fā)儀上于氮氣氛圍中、40°C減壓蒸發(fā)去除氯仿，直至形成均勻類脂薄 膜，加入5% (w/v)葡萄糖水溶液10mL，水浴超聲波處理得到初脂質體混懸液，混懸液通過 高壓勻質機擠壓通過0. Iym的膜，反復6次，得到200nm左右的納米脂制劑，濃度1.86mM。) 均由浙江大學分子醫(yī)學生物技術實驗室提供。1640培養(yǎng)基，10%小牛血清，購自promega。 lipofectin2000購自invitrogen。試驗儀器是熒光定量PCR儀7300購自ABI ；Biorad分 光光度計。4、轉染試劑配制150 μ M反義寡核苷酸與納米制劑(1. 86mM)體積比為1:1.8，設置實驗組如下空白nano組1. 44 μ L納米制劑，150 μ L 1640培養(yǎng)基；0. luMASODN+nano 組0. 1 μ LAS0DN+0. 18 μ L 納米制劑，150 μ L 1640 培養(yǎng)基；0. 2uM ASODN+nano 組0. 2 μ LAS0DN+0. 36 μ L 納米制劑，150 μ L 1640 培養(yǎng)基；0. 4uMAS0DN+nano 組0. 4 μ LAS0DN+0. 72 μ L 納米制劑，150 μ L 1640 培養(yǎng)基；0. 8uMAS0DN+nano 組0. 8 μ LASODN+1. 44 μ L 納米制劑，150 μ L 1640 培養(yǎng)基；0. 8uM ASODN+lipo 組0. 4 μ LAS0DN+0. 25 μ L lipofectin2000,150 μ L 1640 培養(yǎng) 基；5、細胞轉染及收集肝癌細胞0fepG2)在37°C ,5% CO2條件下培養(yǎng)至對數生長中期，接種6孔板，每孔 細胞數為IO4個，培養(yǎng)基為2mL，培養(yǎng)24h后，轉染，培養(yǎng)4 他換用含10%小牛血清的1640 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)Mh，收集細胞。6、RNA 抽提每孔收集的細胞加入ImL Trizol液裂解。室溫放置5min，然后以每ImLTrizol液 加入0. 2mL的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15s。室溫放置15min，4°C 下12000g離心lOmin。取上層水相于一新的離心管，按每mL Trizol液加0. 5ml異丙醇的 比例加入異丙醇，室溫放置lOmin，12000g離心lOmin。棄去上清液，按每mL Trizol液加入 至少ImL的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4°C下7500g離心5min。小心棄去上清液，然后 室溫干燥5 IOmin。然后將RNA溶于水中。Biorad分光光度計定量RNA濃度。7、逆轉錄及實時熒光定量PCR擴增Biorad分光光度計定量RNA濃度，定量后稀釋濃度到250ng/μ 1，取500ng (2 μ L) 做逆轉錄。逆轉錄操作按照iTakara PrimeScriprt RT-PCR kit操作手則進行。a)實時熒光定量PCR將逆轉錄產物終體積調整至15 μ 1，取2ul做PCR模板，按照Takara SYBRPremix Ex TaqTM(Perfect Real Time)試劑盒操作手冊進行熒光定量PCR。以GAPDH作為內參照 基因。PCR條件如下95°C，2min ;95°C，20s ;56°C，20s ;72°C，40s。40 個循環(huán)。
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在延伸階段收集熒光。另外，內參基因GAPDH和中期因子標準品分別按照Takara SYBR Premix ExTaqTM (Perfect Real Time)試劑盒操作手冊進行熒光定量PCR，根據Ct值與DNA標準品 溶液濃度對數值關系，繪制標準曲線。內參基因GAPDH實時熒光定量PCR的標準曲線圖見 圖1。中期因子MK實時熒光定量PCR的標準曲線圖見圖2。圖3為中期因子MK標準品實 時熒光定量PCR擴增對數圖。b)檢測本發(fā)明使用ABI Prism 7300實時熒光定量PCR儀進行檢測，圖6為實時熒光定量 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖。c)結果判斷定性分析熒光強度和轉染細胞的中期因子表達量的關系(見圖4 圖5)，表1為 圖4的定量分析結果。表1 定量分析結果
權利要求
1.一種中期因子表達量的實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，主要包括特異性引物、 PCR緩沖液、脫氧核糖核苷酸混合物、DNA聚合酶和DNA熒光染料，其特征在于所述特異性 引物序列如下上游弓丨物 MK up :5，-ctc cgc ggt cgc caa aaa gaa aga_3，； 下游弓I物 MK down :5，-ccc cca tea cac gca ccc cag tt_3，。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括中期因子DNA標準品，所 述中期因子DNA標準品序列如下
3.如權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括擴增和檢測內參 基因GAPDH的引物和內參基因DNA標準品；所述內參引物序列如下上游弓I物 GAPDH up :5，-gga gcc aaa agg gtc ate ate t_3， 下游弓I物 GAPDH down :5‘ -agg ggc cat cca cag tct tct_3'； 所述內參基因DNA標準品序列如下
全文摘要
本發(fā)明涉及細胞及組織中中期因子(MK)表達量的實時熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法。所述中期因子表達量的實時熒光檢測試劑盒，主要包括中期因子DNA標準品、特異性引物、PCR緩沖液、脫氧核糖核苷酸混合物(dNTP)、DNA聚合酶和DNA熒光染料，所述特異性引物序列如下上游引物MK up5’-ctc cgc ggt cgc caa aaa gaa aga-3’；下游引物MK down5’-ccc cca tcacac gca ccc cag tt-3’；本發(fā)明具有靈敏度高和準確性好的優(yōu)點，是一個潛在的藥物研究檢測手段。
文檔編號C12Q1/68GK102121047SQ20091026628
公開日2011年7月13日 申請日期2009年12月25日 優(yōu)先權日2008年12月25日
發(fā)明者姚行, 戴利成, 王翔 申請人:湖州市中心醫(yī)院