專利名稱：：一種檢測兔骨形態(tài)蛋白2基因的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種檢測兔骨形態(tài)蛋白2基因的方法及試劑
背景技術(shù)：
：骨形態(tài)蛋白(bonemorphogeneticprotein)是一簇能夠誘導(dǎo)骨和軟骨形成的細(xì)胞因子。骨形態(tài)蛋白與細(xì)胞表面的骨形態(tài)蛋白受體結(jié)合，引起細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，使SMAD家族蛋白激活。最初發(fā)現(xiàn)了7種骨形態(tài)蛋白，其中骨形態(tài)蛋白2-7屬于TGF-P家族蛋白，骨形態(tài)蛋白l屬于金屬硫蛋白。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了20種骨形態(tài)蛋白，骨形態(tài)蛋白2和骨形態(tài)蛋白7有兩種骨形態(tài)蛋白已經(jīng)通過美國FDA認(rèn)證。骨形態(tài)蛋白2和其他的骨形態(tài)蛋白一樣，在骨和軟骨的發(fā)育過程中起著重要的角色，骨形態(tài)蛋白2具備成骨能力，能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞向其他類型細(xì)胞的分化。在膠原中加入骨形態(tài)蛋白2來治療骨缺損、以及各種骨傷疾病已經(jīng)廣泛得到應(yīng)用，如在口腔臨床治療中，大量的應(yīng)用的重組骨形態(tài)蛋白2。整形外科和口腔外科也已經(jīng)廣泛的使用骨形態(tài)蛋白進(jìn)行臨床的治療。在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，骨折損傷可在骨形態(tài)蛋白持續(xù)作用下完成愈合。目前，基因表達(dá)水平檢測主要是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)來完成，PCR是一項廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的實驗技術(shù)，通過熱穩(wěn)定的TaqDNA多聚酶，使模板中的單個或幾個拷貝的基因片斷在經(jīng)過幾十個熱循環(huán)后進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，達(dá)到數(shù)以百萬計的拷貝，是目前常用的基因表達(dá)相對定量檢測方法，PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳檢測目的基因的表達(dá)量，由于不能夠?qū)崟r的監(jiān)測反應(yīng)的進(jìn)行，所以實驗的重復(fù)性、可靠性相對較差。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，以及光電子技術(shù)的進(jìn)步，近些年來實時熒光定量PCR(RealtimePCR)技術(shù)得到了很大的發(fā)展。實時熒光定量PCR通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析，能夠全程實時檢測PCR反應(yīng)的進(jìn)行，因此具有良好的實驗可靠性，重復(fù)性。實時熒光定量PCR分為熒光染料摻入法和探針法。熒光染料摻入法是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料SYBRGreen，SYBRGreenI是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈DNA結(jié)合染料。與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)。在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。變性時，DNA雙鏈分開，無熒光信號，因此必須在延伸結(jié)束階段采集熒光信號。SYBRGreen也能和非特異的雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光，所以必須在反應(yīng)結(jié)束時做熔解曲線分析產(chǎn)物的特異性。探針法如T叫Man探針是一種寡核苷酸探針，是在寡核苷酸兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)，熒光基團(tuán)連接在探針的5'末端，而淬滅劑則在3'末端。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對時，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3'端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時，聚合酶的5'外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，使得熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，探針被打碎，這樣報告熒光基團(tuán)不再被淬滅。隨著引物的退火，產(chǎn)物的不斷擴(kuò)增，熒光基團(tuán)不斷被DNA聚合酶從探針上剪切下來，從而不斷發(fā)射出熒光信號，因此應(yīng)用T叫man探針法能夠快速準(zhǔn)確的檢測組織和細(xì)胞中的基因的表達(dá)變化。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的檢測兔骨形態(tài)蛋白2基因的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案—種檢測兔骨形態(tài)蛋白2基因的方法，包括(i)用核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的上游引物、核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的下游引物擴(kuò)增生物樣品；(ii)用探針對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，所述探針序列如SEQIDNO.3所示。優(yōu)選地，步驟(i)所述擴(kuò)增與步驟(ii)所述檢測同時進(jìn)行。更優(yōu)選地，采用實時熒光定量PCR法進(jìn)行步驟(i)所述擴(kuò)增與步驟(ii)所述檢測。所述實時熒光PCR法反應(yīng)程序優(yōu)選為95。ClOmin;95。C30sec;58。Clmin;72。Clmin為一個循環(huán)，設(shè)定45個循環(huán)。更優(yōu)選地，步驟(ii)所述探針為T叫Man探針。所述T叫Man探針其5'端標(biāo)記6-FAM、TET、HEX、TAMRA、R0X、CY5、CY3、J0E、TexasRed其中一種，3'端標(biāo)記TAMRA、BHQ-1、Eclipse、IowaBlack其中——禾中。本發(fā)明還提供一種檢測兔骨形態(tài)蛋白2基因的試劑盒，包含用于擴(kuò)增兔骨形態(tài)蛋白2基因的引物，所述引物為核苷酸序列如SEQIDN0.1所示的核酸片段、核苷酸序列如SEQIDN0.2所示的核酸片段中的至少一種。更優(yōu)選的，本發(fā)明所述試劑盒還包含核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的探針。更優(yōu)選的，本發(fā)明所述試劑盒還包含用于檢測兔GAPDH基因的引物和探針；其上游引物的核苷酸序列如SEQIDN0.4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，探針序列如SEQIDNO.6所示。本發(fā)明還提供一種用于檢測兔骨形態(tài)蛋白2基因的引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.l所示。本發(fā)明還提供一種用于檢測兔骨形態(tài)蛋白2基因的引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本發(fā)明的術(shù)語"引物"指作為合成引物延伸產(chǎn)物的起始位點(diǎn)的單鏈寡核苷酸序列，其與待復(fù)制的核酸鏈互補(bǔ)，長度和序列必須適合于延伸產(chǎn)物的合成。本發(fā)明術(shù)語"探針"指單鏈寡核苷酸，用于與核酸片段特異性雜交。"特異性雜交"指所述探針與核酸的整個區(qū)域或一部分在特定的實驗條件下形成雙鏈體，且在這些條件下，所述探針不與待檢測樣品中存在的其他核酸或核酸的其他區(qū)域形成雙鏈體。本發(fā)明所述"T叫Man探針"是一種寡核苷酸探針，是在寡核苷酸兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)，報告熒光基團(tuán)連接在探針的5'末端，而淬滅熒光基團(tuán)則在3'末端。4所述TaqMan探針的5'端標(biāo)記6_FAM、TET、HEX、TAMRA、R0X、CY5、CY3、JOE、TexasRed其中一種，探針的3'端標(biāo)記TAMRA、BHQ-l、Eclipse、IowaBlack其中一種探針和核酸片段雜交后，可以通過任意合適的方式，進(jìn)行雜交的檢測，例如可以檢測的標(biāo)記探針和/或核酸片段，為了輔助檢測，優(yōu)選實時熒光PCR法擴(kuò)增。本發(fā)明試劑盒還可包含PCR緩沖液、dNTPs、Taq酶、R0X、對照品等。對照品分陰性對照和陽性對照，陰性對照為無菌三蒸水，陽性對照為兔肌肉組織的cDNA樣品。本發(fā)明所述試劑盒保存條件為-2(TC，盡量避免反復(fù)凍融。本發(fā)明所述試劑盒的使用方法是將待測樣品兔組織或體外培養(yǎng)細(xì)胞用Trizol提取總RNA，提取的總RNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，建立25ii1的PCR反應(yīng)體系如下2.5ii110XPCRBuffer、0.3ii1的R0X、2ii1的10mMdNTPs、0.5ii1的5yM上游引物0.5y1的5yM下游引物、兔cDNA2y1、0.5iU的5iiM特異性Taqman探針、Taq酶lU、補(bǔ)充無核酶水至25ii1。反應(yīng)條件為95。C30sec;58。Clmin;72°Clmin;45個循環(huán)。每個樣品分別做3個骨形態(tài)蛋白2和GAPDH反應(yīng)，并且每次實驗做兔骨形態(tài)蛋白2和GAPDH陰性對照和陽性對照實驗，將兔cDNA模板以5倍稀釋不同濃度梯度，繪制骨形態(tài)蛋白2兔實時定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以及實驗所用的相應(yīng)軟件相對定量樣品中兔骨形態(tài)蛋白2基因。術(shù)語"Ct值":為了便于對所檢測樣本進(jìn)行比較，在實時熒光PCR反應(yīng)的指數(shù)期，首先需設(shè)定一定熒光信號的域值，一般這個域值是以PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置是315個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。如果檢測到熒光信號超過域值被認(rèn)為是真正的信號，它可用于定義樣本的域值循環(huán)數(shù)(Ct)。Ct值的含義是每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。本發(fā)明所述檢測兔骨形態(tài)蛋白2的方法，對比現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于(1)檢測速度快，效率高，能夠?qū)崟r檢測PCR反應(yīng)的結(jié)果，不需要電泳和染色過程，比普通的PCR方法相比步驟簡單、實驗周期短、重復(fù)性好；(2)靈敏度高，可檢測到基因的最小濃度為10個拷貝；(3)特異性強(qiáng)，與SYBRGreen熒光染料嵌入式Real-timePCR方法相比，Taqman探針法能夠特異性與目的基因結(jié)合，不會與非特異性PCR產(chǎn)物和引物二聚體結(jié)合，因此具有良好的特異性和可靠性；(4)操作簡單，結(jié)果穩(wěn)定。圖1為本發(fā)明所述實時定量PCR方法檢測兔骨形態(tài)蛋白2基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2為本發(fā)明所述實時定量PCR方法檢測兔GAPDH基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖3為對實施例3標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定的電泳圖；泳道1:100bpDNAMarker圖4為本發(fā)明所述方法檢測缺損部位HA與PLGA共混材料的兔骨形態(tài)蛋白2基因的表達(dá)的統(tǒng)計圖5為本發(fā)明所述方法檢測種植在不同接枝率HA與PLGA共混材料上的兔成骨細(xì)胞中骨形態(tài)蛋白2基因表達(dá)的統(tǒng)計圖。具體實施例方式實施例1:設(shè)計和制備引物、探針序列兔骨形態(tài)蛋白2基因的GENEBANK登錄號為gi-2773387，應(yīng)用引物設(shè)計軟件Beacondesigner7設(shè)計了兔骨形態(tài)蛋白2基因和兔GAPDH基因的實時定量PCR引物和探針，經(jīng)過軟件Beacondesigner7分析排除了引物間/內(nèi)二聚體以及發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并經(jīng)BLAST驗證引物的特異性和與相近基因的同源性，設(shè)計出下列引物和探針。兔骨形態(tài)蛋白2特異性引物分為上游引物和下游引物上游引物序列5'-GAAATTCCCCGCCACCAGAC-3'(其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示)下游引物序列5'-TCACTTCCACCACAAACCCATG-3'(其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示)兔骨形態(tài)蛋白2特異性Taqman探針序列為5'6-FAMCGTGTCCCTGTGCAGTCCACCGC3'TAMRA(其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示)為了避免由于樣品間加入的核酸總量的差別，以及樣品在RNA抽提以及逆轉(zhuǎn)錄過程中效率的不同而導(dǎo)致的樣品間基因表達(dá)量的差別，通常采用管家基因進(jìn)行校正來消除這些客觀的差異。一些基因在外界因素改變時表達(dá)相對比較恒定，我們把這些基因用來實時定量PCR的校正，GAPDH是最通用的管家基因，本發(fā)明采用GAPDH基因作為管家基因?qū)γ總€待測樣品進(jìn)行校正以兔GAPDH基因為內(nèi)參，GAPDH基因GENEBANK登錄號為NM-001082253，設(shè)計上游引物為5'-GATGGTGAAGGTCGGAGTG-3'(其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示)兔GAPDH基因下游引物為5'-TGTAGTGGAGGTCAATGAATGG-3'(其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示)兔GAPDH特異性Taqman探針序列5'6-FAMCAGCCTTGACCGTGCCGTGGAACT3'TAMRA(其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示)實施例2:制備本發(fā)明所述試劑盒本發(fā)明所述試劑盒組成為1.25ml10XPCRBuffer、200ii1的2yM的ROX、lml的10mMdNTPs、250的5yM上游引物、250的5yM下游引物、250的5yM熒光標(biāo)記的Taqman探針、Taq酶500U、無核酶水2ml，標(biāo)準(zhǔn)品(1010拷貝)20iU。所述引物包括實施例1制備的兔骨形態(tài)蛋白2的上游引物和下游引物、兔GAPDH基因的上游引物和下游引物；所述探針包括兔骨形態(tài)蛋白2的探針和兔GAPDH基因的探針。對照品分陰性對照和陽性對照，陰性對照為無核酶水，陽性對照為兔肌肉組織的cDNA樣品。應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，如將試劑盒的組分等比例增加，也應(yīng)視為在本發(fā)明要求保護(hù)的范圍之內(nèi)。實施例3:檢測骨缺損部位HA與PLGA共混材料的兔骨形態(tài)蛋白2基因的表達(dá)手術(shù)截斷兔前腿橈骨造成骨缺損2cm，骨缺損部位植入單純的PLGA和不同接枝率HA與PLGA共混材料，共混材料中HA與PLGA質(zhì)量百分比分別是80%和20%。接枝的HA的接枝率分別是1%、3%、5%、7%、10%。用于動物實驗的骨修復(fù)材料分別為PLGA、PLGA+HA、PLGA+HA(1%)、PLGA+HA(3%)PLGA+HA(5%)、PLGA+HA(7%)PLGA+HA(10%)。術(shù)后3個月后從骨缺損部位取出材料，稱取lOOmg，在研缽中加入液氮搗碎，用Trizol提取材料中的總RNA，取lug總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用這些cDNA分別和骨形態(tài)蛋白2引物和GAPDH引物進(jìn)行Real-timePCR反應(yīng)，每個樣品分別設(shè)置3平行樣。實驗設(shè)置GAPDH為內(nèi)參組，用以校正每個樣品起始模板量的差異對實驗帶來的誤差。反應(yīng)組份如表1。表1、實時熒光定量PCR的擴(kuò)增體系<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>兔骨形態(tài)蛋白2基因的GENEBANK登錄號為gi-2773387，根據(jù)NCBI搜索選取其特異性基因序列為兔骨形態(tài)蛋白2基因的418-814片段(397bp)，其核苷酸序列如SEQIDN0.7所示。以兔骨形態(tài)蛋白2基因的418-814片段為標(biāo)準(zhǔn)品，兔骨形態(tài)蛋白2基因的418-814片段核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。標(biāo)準(zhǔn)品濃度為101Q拷貝/yl，將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后，分為l(T拷貝/111、108拷貝/111、106拷貝/111、104拷貝/111、102拷貝/iil，104考貝/Pl進(jìn)行Real-timePCR反應(yīng)，反應(yīng)條件是95。C預(yù)變性10min，然后95。C30秒、58。C60秒、72t:60秒共進(jìn)行45個循環(huán)，結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。將標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，紫外燈檢測并拍照，結(jié)果見圖3，可見在接近400bp出有一明顯的條帶，即為目的基因兔骨形態(tài)蛋白2基因的418-814片段(397bp)?？芍景l(fā)明所述方法可擴(kuò)增兔骨形態(tài)蛋白2基因，靈敏度范圍是10-1(T拷貝。本發(fā)明所用Trizol試劑購自Invitrogen，01igo-dT、dNTP、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶和RNA酶抑制劑購自Promega公司，ROX購自Stratagene公司，。設(shè)定Real-timePCR反應(yīng)條件95。C預(yù)變性10min，然后95°C30秒、58。C60秒、72°C60秒共進(jìn)行45個循環(huán)，樣品在StratagenMx3005P機(jī)器上運(yùn)行，結(jié)束后軟件分析結(jié)果見圖3。從圖3可以看出術(shù)后3個月后，材料PLGA+HA(7X)中兔骨形態(tài)蛋白2基因表達(dá)量最高，因此材料PLGA+HA(7%)更有利于兔骨形態(tài)蛋白2基因的表達(dá)，促進(jìn)骨的形成，加速骨缺損部位的恢復(fù)。實施例4:實時熒光定量法檢測種植在不同接枝率HA與PLGA共混材料上的兔成骨細(xì)胞中BMP-2(骨形態(tài)蛋白2)基因的表達(dá)。取3天新生兔的顱骨，顱骨剪碎后加DMEM+10XFBS培養(yǎng)基培養(yǎng)兔成骨細(xì)胞。單純的PLGA和不同接枝率HA與PLGA共混材料，共混材料中HA與PLGA質(zhì)量百分比分別是80%和20%。接枝的HA的接枝率分別是1%、3%、5%、7%、10%。用于成骨細(xì)胞培養(yǎng)的復(fù)合材料分別為PLGA、PLGA+HA、PLGA+HA(1%)、PLGA+HA(3%)PLGA+HA(5%)、PLGA+HA(7%)、PLGA+HA(10%)。材料用氯仿溶解后在硅化的蓋玻片上鋪膜。成骨細(xì)胞種植于涂有不同復(fù)合材料的薄膜上。培養(yǎng)l周后，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，Real-timePCR檢測BMP-2表達(dá)。成骨細(xì)胞用Trizol提取總RNA，取lug總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用這些cDNA和BMP-2引物和GAPDH引物進(jìn)行Real-timePCR反應(yīng)，反應(yīng)組份如表2:表2、實時熒光定量PCR的擴(kuò)增體系名稱體積lOXPCRBuffer2.5u1ROX(2uM)0.3u1dNTPs(10mM)2u1上游引物(5uM)0.5u1下游引物(5uM)0.5u1T叫man探針(5uM)0.5u1cDNA2u1Taq酶(4U/u1)0.25u1H2016.45u1Real-timePCR反應(yīng)條件是，95°C預(yù)變性10min，然后95。C30秒、58。C60秒、72°C60秒共進(jìn)行45個循環(huán)，樣品在StratagenMx3005P機(jī)器上運(yùn)行，結(jié)束后軟件分析結(jié)果見圖4。從圖4可以看出成骨細(xì)胞在不同復(fù)合材料上培養(yǎng)1周后，材料PLGA+HA(5X)中BMP-2基因表達(dá)量最高，因此材料PLGA+HA(5X)更有利于體外培養(yǎng)的兔成骨細(xì)胞中BMP-2基因的表達(dá)。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQUENCELISTING〈110〉中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所〈120〉一種檢測兔骨形態(tài)蛋白2基因的方法及試劑盒〈130>MP097634〈160>7〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>20〈212>DNA〈213〉兔骨形態(tài)蛋白2基因的上游引物8:0085]:0086]〈400>1:0087]〈210>2:0088]〈211>22:0089]〈212>DNA:0090]〈213〉兔骨形態(tài)蛋白2基因的上游引物:0091]〈400>2.0092]tcacttccaccacaaacccatg22:0093]〈210>3:0094]〈211>23:0095]〈212>DNA:0096]〈213〉兔骨形態(tài)蛋白2基因的探針:0097]〈400>3.0098]cgtgtccctgtgcagtccaccgc23:0099]〈210>4:0100]〈211>19:0101]〈212>DNA:0102]〈213〉兔GAPDH基因上游引物:0103]〈400>4.0104]gatggtgaaggtcggagtg19:0105]〈210>5:0106]〈211>22:0107]〈212>DNA:010S]〈213〉兔GAPDH基因下游引物:0109]〈400>5.0110]tgtagtggaggtcaatgaatgg22:0111]〈210>6:0112]〈211>24:0113]〈212>DNA:0114]〈213〉兔GAPDH基因探針:0115]〈400>6.0116]cagccttgaccgtgccgtggaact24:0117]〈210>7:0118]〈211>397:0119]〈212>DNA:0120]〈213〉兔骨形態(tài)蛋白2基因序列的418-814片段:0121]〈400>7.0122]ttggaagaactgccagaaacaagtgggaaaaccacccggcgattcttcttteattteact60.0123]tccattcccccggaggagtttetcacctctgcagaacttcaggtttttcgagaacagatg120caggaagctttgggagacgacagcggtttccatcategaatteatetttetgaaattete180aagcctgcaacagccaactcgaaattccccgccaccagactgctggacaccaggttggtg240aatcagaacacgagccggtgggagagcttcgacgtcacccctgccgtgatgcggtggact300gcaragggac3cgcc皿ccatgggtttgtggtgg皿gtgacccacttggaggag皿gc皿360ggtgtctccaagagacacgtgaggattegcaggtctt39權(quán)利要求一種檢測兔骨形態(tài)蛋白2基因的方法，包括(i)用核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的上游引物、核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的下游引物擴(kuò)增生物樣品；(ii)用探針對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，所述探針序列如SEQIDNO.3所示。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(i)所述擴(kuò)增與步驟(ii)所述檢測同時進(jìn)行。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，采用實時熒光定量PCR法進(jìn)行步驟(i)所述擴(kuò)增與步驟(ii)所述檢測。4.根據(jù)權(quán)利要求l-3任一項所述的方法，其特征在于，步驟(ii)所述探針為T叫Man探針。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述實時熒光定量PCR反應(yīng)程序為95°ClOmin;95。C30sec;58。Clmin;72。Clmin為一個循環(huán)，設(shè)定45個循環(huán)。6.—種檢測兔骨形態(tài)蛋白2基因的試劑盒，其特征在于，包含核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的引物和核苷酸序列如SEQIDN0.2所示的引物中的至少一種。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包含核苷酸序列如SEQIDN0.3所示的探針。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，還包含用于檢測兔GAPDH基因的引物和探針；其上游引物的核苷酸序列如SEQIDN0.4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDN0.5所示，探針序列如SEQIDNO.6所示。9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于，所述探針為TaqMan探針，其5'端標(biāo)記6-FAM、TET、HEX、TAMRA、R0X、CY5、CY3、JOE、TexasRed其中一種，3'端標(biāo)記TAMRA、BHQ-l、Eclipse、IowaBlack其中一種。10.檢測兔骨形態(tài)蛋白2基因的引物，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.l所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。全文摘要本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，公開了一種檢測兔骨形態(tài)蛋白2基因的方法，包括用核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的上游引物、核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的下游引物擴(kuò)增生物樣品，以及用序列如SEQIDNO.3所示的探針進(jìn)行檢測步驟。本發(fā)明還提供一種檢測兔骨形態(tài)蛋白2基因的試劑盒。本發(fā)明所述方法檢測兔骨形態(tài)蛋白2基因靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡單，樣本范圍廣，具有廣泛的應(yīng)用前景。文檔編號C12Q1/68GK101775437SQ200910266199公開日2010年7月14日申請日期2009年12月31日優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日發(fā)明者崔立國,王宇,王宗良,章培標(biāo),陳學(xué)思申請人:中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所