專利名稱：一株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株及高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明利用一株高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株(細(xì)菌類)，為變形菌綱的一個新種，我們將 其分類命名為Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-Hl及利用該菌株為出發(fā)菌種，經(jīng) 種子培養(yǎng)和已優(yōu)化的培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的方法，所制備的酶可高效水解幾丁質(zhì)，所生 成的N-乙酰-D-氨基葡萄糖，可廣泛用于化工、醫(yī)藥、食品、材料、染料等領(lǐng)域，屬于生物技 術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
幾丁質(zhì)酶可高效降解幾丁質(zhì)，生成N-乙酰-D-氨基葡萄糖。研究表明N-乙 酰-D-氨基葡萄糖是生物細(xì)胞內(nèi)許多重要多糖的基本組成單位，尤其是甲殼類動物的外骨 骼含量最高。它是合成雙歧因子的重要前體，在生物體內(nèi)具有許多重要生理功能。臨床上用 于治療風(fēng)濕性及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。也可以作為食品抗氧化劑及嬰幼兒食品添加劑，糖尿病 患者甜味劑。主要用于臨床增強(qiáng)人體免疫系統(tǒng)的功能，抑制癌細(xì)胞或纖維細(xì)胞的過度生長， 對癌癥和惡性腫癌起到抑制和治療作用；對于各種炎癥，能起到有效的治療，對骨關(guān)節(jié)炎及 關(guān)節(jié)疼痛也有治療作用。幾丁質(zhì)酶的價格極為昂貴，如日本的chitin T-I幾丁質(zhì)酶市價為每50毫克20000
日元由于幾丁質(zhì)酶具有廣闊的應(yīng)用前景和極高的經(jīng)濟(jì)開發(fā)價值，世界上一些發(fā)達(dá)國家 都在進(jìn)行生物技術(shù)生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的研究。為此，我們確定篩選高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的新菌株，并建 立利用新菌株發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的方法作為博士論文研究課題，取得了突破性的進(jìn)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的利用一株高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株(細(xì)菌類)，為變形菌綱的一個新種， 我們將其分類命名為Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1及利用該菌株為出發(fā)菌 種，經(jīng)種子培養(yǎng)和已優(yōu)化的培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的方法，所制備的酶可高效水解幾丁質(zhì)， 生成N-乙酰-D-氨基葡萄糖，可廣泛用于化工、醫(yī)藥、食品、材料、染料等領(lǐng)域，來替代價格 昂貴的進(jìn)口的幾丁質(zhì)酶。本發(fā)明的技術(shù)方案一株高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株(細(xì)菌類)，為變形菌綱的一個新 種，我們將其分類命名為Chitinolyticbacter meiyuanensis) SYBC-Hl已保存于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC3483。用CGMCC3483菌株為出發(fā)菌種，經(jīng)種子培養(yǎng)和已優(yōu)化的培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的 方法；工藝為(1)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基(以質(zhì)量濃度計)磷酸二氫鉀0. 07，磷酸氫二鉀0. 03，硫酸鎂0. 05， 七水硫酸亞鐵0. 001，酵母浸出物0. 4，葡萄糖0. 2，蛋白粉0. 4。培養(yǎng)條件從平板上處于指數(shù)生長期的該菌菌落取兩接種環(huán)接種于盛有50ml種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，pH值7.0，溫度30°C，轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)時間12h。(2)產(chǎn)酶培養(yǎng)產(chǎn)酶培養(yǎng)基磷酸二氫鉀(0. 05-0. 1)，磷酸氫二鉀(0. 02-0. 06)，硫酸鎂 (0. 03-0. 07)，七水硫酸亞鐵(0. 001-0. 005)，酵母浸出物(0. 2-0. 4)，葡萄糖(0. 10-0. 30)， 尿素(0. 4-1. 0)，幾丁質(zhì)粉粒(1-2)。產(chǎn)酶條件再以2% -6%接種量，進(jìn)行5L發(fā)酵罐發(fā)酵，pH 7. 0-8. 5，溫度=26-36, 發(fā)酵時間60-84h，轉(zhuǎn)速200-500prm，通氣量1. 0-2. OL/min/L。根據(jù)上述條件，在5L的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液幾丁質(zhì)酶活最高可達(dá)6U/ml。本發(fā)明從不同環(huán)境條件下的土壤中篩選出一種高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的新菌種，分類命名 為 Chitinolyticbacter meiyuanensisSYBC-Hl。本菌株的篩選和菌種鑒定1. 1采集大量不同環(huán)境條件下的土壤樣品，取Ig 土壤樣本加到滅菌后的含粉 末幾丁質(zhì)的50ml溶液中，培養(yǎng)24h后，對培養(yǎng)液進(jìn)行無菌稀釋適當(dāng)倍數(shù)，涂布于種子培養(yǎng)基 (含瓊脂)平板培養(yǎng)。挑選產(chǎn)生透明圈較大的單菌落進(jìn)行斜面保存。1. 2將篩選到的菌株，用產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行液體搖瓶發(fā)酵。最終篩選到一株產(chǎn)幾丁 質(zhì)酶活力較高的菌株(

圖1)，經(jīng)生理生化鑒定(見表1)和電鏡觀察(見圖2)及16S rDNA 序列鑒定(見序列SEQ ID NO :1)，發(fā)現(xiàn)該菌株為一株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的新種，我們將其分類命 名為 Chitinolyticbacter meiyuanensisSYBC-Hl。表1 SYBC-Hl的部分生理生化試驗(yàn)
項(xiàng)目 \類別淀粉 水解V-P 試驗(yàn)H2S 生成H2O2 的 生成明膠 液化石2S、 牛乳甲基紅 試驗(yàn)乙醇的 氧化SYBC-Hl+---+-+- 2、酶活的測定方法發(fā)酵液經(jīng)6000rpm、4°C、IOmin離心后，取0. 5ml上清液，加入Iml 0. IM醋酸-醋 酸鈉緩沖液(pH 6. 5)，0. 5ml 0. 5%的膠體幾丁質(zhì)(W/V)，37°C保溫30min，取出后加入DNS 試劑0. 5ml，沸水浴IOmin后，迅速用冰水冷至室溫，6000rpm離心8min，530nm處比色，重 復(fù)三次，取平均值作試驗(yàn)結(jié)果，同時以高溫滅活的上清液同樣處理作為對照，最后以O(shè)D53tl的 平均值來計算還原糖的含量，計算出酶活。酶活力定義為在上述條件下每分鐘釋放相當(dāng)于 ImmolNAG所需要的酶量為一個酶活單位(U)。本發(fā)明的有益效果首先提供了一株高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株為出發(fā)菌及利用該出發(fā) 菌采用液體發(fā)酵制備幾丁質(zhì)酶的方法。本發(fā)明的菌種和發(fā)酵產(chǎn)酶方法與其他菌種和制備幾 丁質(zhì)酶方法相比較，具有酶活力高，發(fā)酵技術(shù)簡便和成本低的優(yōu)點(diǎn)，且生產(chǎn)的幾丁質(zhì)酶可高 效水解幾丁質(zhì)，因此，本發(fā)明的菌種和發(fā)酵產(chǎn)酶技術(shù)有著廣泛的工業(yè)使用價值和顯著的經(jīng) 濟(jì)效益前景。附圖表說明圖 IChitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-Hl 的平板菌落。
圖 2Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1 的透射電鏡形態(tài)。生物材料樣品保藏Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1，已保存于中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心，保藏日期2009年11月30日，保藏編號為CGMCC3483。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1產(chǎn)酶培養(yǎng)基(以質(zhì)量濃度計)磷酸二氫鉀(0.05)，磷酸氫二鉀(0.02)，硫酸鎂 (0. 03)，七水硫酸亞鐵(0. 001)，葡萄糖(0. 10)，尿素(0. 4)，幾丁質(zhì)粉粒(0. 4)。產(chǎn)酶條件接種量2%:，進(jìn)行5L發(fā)酵罐發(fā)酵，pH:8.5，溫度26°C，發(fā)酵時間72h， 轉(zhuǎn)速200prm，通氣量1. OL/min/L。在以上條件下發(fā)酵，所得到的粗酶酶活可達(dá)5. 2U/mL。搖瓶對照酶活為5. 5U/mL。實(shí)施例2產(chǎn)酶培養(yǎng)基(以質(zhì)量濃度計)磷酸二氫鉀(0.07)，磷酸氫二鉀(0.05)，硫酸鎂 (0. 06，七水硫酸亞鐵(0. 001)，葡萄糖(0. 12)，尿素(0. 4)，幾丁質(zhì)粉粒(0. 4)。產(chǎn)酶條件接種量5%，進(jìn)行5L發(fā)酵罐發(fā)酵，pH:7.5，溫度28°C，發(fā)酵時間60h， 轉(zhuǎn)速200prm，通氣量2. OL/min/L。在以上條件下發(fā)酵，所得到的粗酶酶活可達(dá)6. OU/mL。搖瓶對照酶活為5. 7U/mL.實(shí)施例3產(chǎn)酶培養(yǎng)基(以質(zhì)量濃度計)磷酸二氫鉀(0. 10)，磷酸氫二鉀(0.06)，硫酸鎂 (0. 07)，七水硫酸亞鐵(0. 001)，葡萄糖(0. 3)，尿素(1. 0)，幾丁質(zhì)粉粒(1. 0)。產(chǎn)酶條件接種量5%:，進(jìn)行5L發(fā)酵罐發(fā)酵，pH 8. 0，溫度36°C，發(fā)酵時間72h， 轉(zhuǎn)速500prm，通氣量2. OL/min/L。在以上條件下發(fā)酵，所得到的粗酶酶活可達(dá)5. 4U/mL。搖瓶對照酶活為5. 3U/mL。序列表<210>SEQ ID NO 1<211>1526<212>DNA<213>Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-Hlagagtttgatcctggctcagcttgaacgctggcggcatgctttacacatgcaagtcgaac60
ggtaacagggacttcggtccgctgacgagtggcgaacgggtgagtaatacatcggaacgt120
gcctattagtgggggatagcccggcgaaagccggattaataccgcatacgccctgagggg180
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aggccggttaccacggtaggattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtagg1500
ggaacctgcggctggatcacctcctt152權(quán)利要求
一株高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株(細(xì)菌類)，為變形菌綱的一個新種，我們將其分類命名為Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC H1，已保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC3483。
2.用權(quán)利要求1所述的菌株發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的方法，其特征在于用該菌為出發(fā)菌 種，經(jīng)種子培養(yǎng)和已優(yōu)化的培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶工藝為(1)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基(以質(zhì)量濃度計)磷酸二氫鉀0.07，磷酸氫二鉀0.03，硫酸鎂0.05，七水 硫酸亞鐵0. 001，酵母浸出物0. 4，葡萄糖0. 2，蛋白粉0. 4。培養(yǎng)條件從平板上處于指數(shù)生長期的該菌菌落取兩接種環(huán)接種于盛有50ml種子培 養(yǎng)基的250ml三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，pH值7.0，溫度30°C，轉(zhuǎn)速200prm，培養(yǎng)時間12h。(2)產(chǎn)酶培養(yǎng)產(chǎn)酶培養(yǎng)基磷酸二氫鉀(0. 05-0. 1)，磷酸氫二鉀(0. 02-0. 06)，硫酸鎂(0. 03-0. 07)， 七水硫酸亞鐵(0. 001-0. 005)，酵母浸出物(0. 2-0. 4)，葡萄糖(0. 10-0. 30)，尿素 (0. 4-1. 0)，幾丁質(zhì)粉粒(0. 4-1. 0)。發(fā)酵條件再以2% -6%接種量，進(jìn)行5L發(fā)酵罐發(fā)酵，pH 6. 5-8. 5，溫度26_36°C，發(fā) 酵時間60-84h，轉(zhuǎn)速200-500rpm，通氣量1. 0-2. OL/min/L。
全文摘要
一株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株及高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一株高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株(Chitinolyticbactermeiyuanensis)SYBC-H1。已保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC3483，保藏日期2009年11月30日。同時還發(fā)明了以該菌為出發(fā)菌種，經(jīng)種子培養(yǎng)和已優(yōu)化的產(chǎn)酶培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的方法，發(fā)酵液酶活最高可達(dá)6.0U/ml以上。所制備的酶可高效水解幾丁質(zhì)，生成N-乙酰-D-氨基葡萄糖，可廣泛用于化工、醫(yī)藥、食品、材料、染料等領(lǐng)域。
文檔編號C12N9/42GK101942401SQ20091026420
公開日2011年1月12日 申請日期2009年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日
發(fā)明者廖祥儒, 張峰, 蔡宇杰, 郝之奎 申請人:江南大學(xué)