專利名稱：檸條轉(zhuǎn)錄因子dreb及其基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物DREB轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因，其功能是提高植物的抗逆性， 屬于植物生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
包括干旱、鹽漬、低溫等非生物逆境脅迫，是制約農(nóng)作物、林草和蔬菜等生產(chǎn)發(fā)展 的重要因素。我國的干旱、半干旱耕地共計(jì)5. 7億畝，占全國耕地面積的38%，每年因缺水 造成糧食減產(chǎn)700-800億公斤。培育和推廣抗逆植物品種是提高其產(chǎn)量與質(zhì)量，保證國家 糧食安全和改善生態(tài)環(huán)境的最有效途徑。雖然利用植物自身抗病基因和一些抗逆相關(guān)基 因，在抗逆育種方面取得了一些進(jìn)展。但目前可利用的抗病和抗逆相關(guān)基因資源有限，并且 存在著抗病品種短壽、抗逆品種不理想等問題，難以滿足目前生產(chǎn)與生態(tài)改良的需求。近 年來，有關(guān)植物抗逆反應(yīng)機(jī)制特別是相關(guān)反應(yīng)途徑研究的進(jìn)展以及基因工程技術(shù)的迅猛發(fā) 展，為運(yùn)用基因工程手段提高植物抗病性與抗逆性展示出誘人的前景。植物在長期進(jìn)化過程中發(fā)展了一系列應(yīng)對生物脅迫和非生物逆境脅迫的反應(yīng)機(jī) 制，以保證其生長發(fā)育。大量研究結(jié)果表明，植物能通過基因感知和識(shí)別逆境脅迫信號，然 后啟動(dòng)級聯(lián)式的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，進(jìn)而誘導(dǎo)一系列下游的具有功能的抗逆基因表達(dá)。生物體 的細(xì)胞能夠?qū)ν饨绛h(huán)境條件的變化做出相應(yīng)的反應(yīng)，在植物中，AP2/DREB家族中的DREB類 轉(zhuǎn)錄因子能夠接受環(huán)境脅迫信號，啟動(dòng)一系列脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)植物對逆境 的耐受力。檸條是能在干旱鹽堿和溫差劇烈變化的干旱沙漠地區(qū)生長的灌木建群樹種，在 我國“三北”地區(qū)廣泛分布。作為天然的抗逆性極強(qiáng)的典型植物，檸條的抗逆性已引起國際 學(xué)術(shù)界的重視。研究、開發(fā)和利用檸條抗逆性基因資源，對于深入植物抗逆性機(jī)理以及定向 培育抗逆植物新品種具有重要的價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供檸條中的一種與抗逆性相關(guān)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基 因，該轉(zhuǎn)錄因子首次在檸條中克隆，該基因的表達(dá)受干旱、寒冷誘導(dǎo)在抗寒和抗旱反應(yīng)中具 有調(diào)控作用。本發(fā)明所提供的DREB類轉(zhuǎn)錄因子來源于檸條，是DREB2家族中的一個(gè)，是具有與 序列表3氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列表3氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或者幾個(gè) 氨基酸殘基的取代、缺失或者添加且具有與序列的氨基酸殘基序列相同活性的由序列衍生 的蛋白質(zhì)序列表中序列氨基酸殘基序列是由286個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，分子量約 32KD，等電點(diǎn)8. 5?；蛉L1554，開放閱讀框從350bp到1210bp計(jì)861bp，擁有序列1所 示的全長DNA序列和序列2所示的完整讀碼框。本發(fā)明的主要?jiǎng)?chuàng)新之點(diǎn)在于1.首次從擰條中克隆了 DREB基因；2.經(jīng)過BLAST，該轉(zhuǎn)錄因子與陸地棉D(zhuǎn)REB2的氨基酸相似性60%，該蛋白含有能與
3DRE順式作用元件結(jié)合的AP2domain，是一個(gè)新DREB基因。見附圖1。


圖1為檸條DREB轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列同源性比較。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1擰條葉片全長cDNA文庫的構(gòu)建檸條植株栽培培養(yǎng)缽中，于溫室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)60天，進(jìn)行干旱處理，至全株出現(xiàn)萎 蔫取幼嫩葉片于液氮中速凍、研磨，TRIzole抽提總RNA，溶于水中。經(jīng)mRNA純化試劑盒處 理得到mRNA。取mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后再合成第二鏈。均一化后與pDNR-LIB載體 連接(具體步驟詳見 CreatorTMSMART cDNA Library Construction Kit(Clontech Cat. No. 634903)。實(shí)施例2cDNA文庫的隨機(jī)EST測序從文庫中隨機(jī)選取3000個(gè)單克隆進(jìn)行5’端 EST測序，將測序成功的序列進(jìn)行BLAST，選擇與經(jīng)驗(yàn)證抗旱相關(guān)基因相似的EST。實(shí)施例3選擇經(jīng)BLAST與抗旱相關(guān)的EST，將它們對應(yīng)的克隆測通，得到候選抗逆 基因的全長DNA序列。實(shí)施例4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測干旱處理下本發(fā)明所涉及的基因的表達(dá)取干旱處理的檸條葉片提取RNA，同時(shí)提取正常生長的葉片提取RNA為對照，反轉(zhuǎn) 錄成⑶NA，根據(jù)本發(fā)明的序列2設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物引物1為5，CTCAACTTCCCTAAACTCCG 3’ ；引物2為5’ TCAGCCAAGCCTTCACAA 3’，該引物對擴(kuò)增出長度為119bp的核苷酸片段，以 SYBR GREENI作為熒光染料，用Roche LightCycler 480進(jìn)行基因表達(dá)的定量分析，采用 2_吣法發(fā)現(xiàn)干旱誘導(dǎo)下本發(fā)明所涉及的基因的表達(dá)比對照提高6倍，足以證明其在抗旱中 可發(fā)揮重要作用。序列 1CGGCCGGGGTCGGACAATTTTTGTTCTTTGTTTTTTCGGGTTTTATTTTGTCAGTCTTAACCTGTTCTTCTGTTTTAGAACGAAGGACGCAGGTTTTAATTTTTCAAGTTATGGCAGCTATGATGGATTTTTACAGCAGCACACAACTTCACTCAGATCCCTTCAGGGGTGAACTAATGGAAGTTCTTGAACCTTTTATCAAAGTACTTCCCCATCCCCTTCTCCTTCTTCTTCTCCTTCTACAGCCTCACCCTCTTATTCAAACTCATCCCTTCCTTCTTCTTCTTCTTCCTCGCCCAACTCCTTCTCTCCCCTTCCTCCTTTCTACACAGATGGTTGCTCAACATCGATGACCCATGTATTTACCGACGGGTTATCCAACGGCCAAAATTTCATAGGCTTCGGTCAACAACCATTTTCTCTTCTTGGCCTCAACCACCTAACCCCATCTCAGATCTATCAGATTCAAGCCCAATTCCAGCACCAGAACATGCCATGGCAAAACCGTCAGCATCAGCATCAGAATCTCAACAACACACTCAGCTTCCTCGGTCCAAAGCCGATCCCGATGAAGCACGTGGGGACTCCTTCAAAACCCACGAAGCTCTACAGAGGGGTGAGGCAGAGGCACTGGGGAAAATGGGTGGCTGAGATCAGACTCCCAAAGAATCGTACAAGGCTGTGGCTTGGTACCTTCGATACCGCTGAAGAAGCTGCTCTGGCTTACGACAAAGCTGCTTACAAGCTCCGAGGTGATTTCGCGAGGCTCAACTTCCCTAAACTCCGACACCAGGGCTCCTCTGTTGGTGGAGATTTCGGTGAGTTCAAGCCTCTTCCTTCCTCTGTTGATGCAAAGCTTCAGGCCATTTGTGAAGGCTTGGCTGAGATGCAGAAACAGGGGAAGTCAGAGAAGTCTTCGAGTTCGTCTAAGAAGTCTTCGTCGGCGCGGTCTAAGAAGGG
GGCTTCGCCGGAGACGGTGACGGCGAATCTCCCGGAGGAGCACTCTTTGAAGGGTTCGTGTTCAGAGAGCTCTTGCAAGGTTGGAGTTTCCTTGTCTCCGGTGATGACTGAGAGCGAGGGTTCTGAAGGTTCTTCGCCCCTTTCGGATCTTACTTTTGCTGATGTTGGTGAGCCACACTGGGATGGTGATTTGGATAATTTTAATTTGCACAAGTACCCCTCTTATGAGATCGATTGGGATTCTCTGTGAAGCCGTGTTTGGTAGTCTTTTGTAGTCTGTGTCTCATATGTAACTTGTTGCTTTTCTAGTGAAGGGTCTCATGCATTATCTATAGTAGTATATTTTTAGGTTCTAGTGTCTCGGGTGGGTGGCTACTGCAATGGAGTTTTTGGCAATTGCAGGGTTACTCATAAGTAGGTACTTTCATGCATAGTTTATATTATTCTGTTAATACCTTGTATAATCTCTTTCTACCTTGGGTCACAGCTGGTTTTTTTTCTTGCTTGGCCGGGGAGAAGACTCTAGTTATGTATTTCATTGTTTATATTAATAGCTATAATCTACTAAAAAGTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA序列 2ATGACCCATGTATTTACCGACGGGTTATCCAACGGCCAAAATTTCATAGGCTTCGGTCAACAACCATTTTCTCTTCTTGGCCTCAACCACCTAACCCCATCTCAGATCTATCAGATTCAAGCCCAATTCCAGCACCAGAACATGCCATGGCAAAACCGTCAGCATCAGCATCAGAATCTCAACAACACACTCAGCTTCCTCGGTCCAAAGCCGATCCCGATGAAGCACGTGGGGACTCCTTCAAAACCCACGAAGCTCTACAGAGGGGTGAGGCAGAGGCACTGGGGAAAATGGGTGGCTGAGATCAGACTCCCAAAGAATCGTACAAGGCTGTGGCTTGGTACCTTCGATACCGCTGAAGAAGCTGCTCTGGCTTACGACAAAGCTGCTTACAAGCTCCGAGGTGATTTCGCGAGGCTCAACTTCCCTAAACTCCGACACCAGGGCTCCTCTGTTGGTGGAGATTTCGGTGAGTTCAAGCCTCTTCCTTCCTCTGTTGATGCAAAGCTTCAGGCCATTTGTGAAGGCTTGGCTGAGATGCAGAAACAGGGGAAGTCAGAGAAGTCTTCGAGTTCGTCTAAGAAGTCTTCGTCGGCGCGGTCTAAGAAGGGGGCTTCGCCGGAGACGGTGACGGCGAATCTCCCGGAGGAGCACTCTTTGAAGGGTTCGTGTTCAGAGAGCTCTTGCAAGGTTGGAGTTTCCTTGTCTCCGGTGATGACTGAGAGCGAGGGTTCTGAAGGTTCTTCGCCCCTTTCGGATCTTACTTTTGCTGATGTTGGTGAGCCACACTGGGATGGTGATTTGGATAATTTTAATTTGCACAAGTACCCCTCTTATGAGATCGATTGGGATTCTCTGTGA序列 3MTHVFTDGLSNGQNFIGFGQQPFSLLGLNHLTPSQIYQIQAQFQHQNMPWQNRQHQHQNLNNTLSFLGPKPIPMKHVGTPSKPTKLYRGVRQRHWGKWVAEIRLPKNRTRLWLGTFDTAEEAALAYDKAAYKLRGDFARLNFPKLRHQGSSVG⑶FGEFKPLPSSVDAKLQAICEGLAEMQKQGKSEKSSSS
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權(quán)利要求
檸條的DREB類轉(zhuǎn)錄因子，它具有與序列表中序列3的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代，缺失或添加且具有與序列3的氨基酸殘基序列相同活性的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。
2.檸條DREB類轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因，序列表中序列1的DNA序列，包括該基因的全部 序列及部分序列均在權(quán)利要求之內(nèi)。
3.序列表中序列2的DNA序列是基因的讀碼框，是權(quán)利要求的重點(diǎn)。
4.將序列表中序列1限定的DNA序列作適當(dāng)突變或偏愛密碼子改造后的基因，編碼相 同功能蛋白質(zhì)，亦在本專利權(quán)利要求之內(nèi)。
5.權(quán)利要求2所述的基因，其開放閱讀框是自5’端第350到第1210位堿基。
6.含有權(quán)利要求3所述的基因的表達(dá)載體。
7.含有權(quán)利要求3所述的基因的細(xì)胞系。
8.權(quán)利要求2所述的基因在培育抗寒和抗旱植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了檸條((Caragana korshinskii)的一個(gè)干旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及其基因。該基因全長1554bp，包括一個(gè)860bp開放閱讀框，編碼產(chǎn)物為由286個(gè)氨基酸殘基組成的干旱誘導(dǎo)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子，具有AP2DNA結(jié)合區(qū)，能與一些干旱相關(guān)下游基因的啟動(dòng)子區(qū)域的干旱反應(yīng)元件相結(jié)合，從而調(diào)控耐旱、耐寒相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，是植物耐旱機(jī)制的關(guān)鍵元件。該基因與陸地棉D(zhuǎn)REB2基因的氨基酸序列相似性為60％，如構(gòu)建該基因的植物表達(dá)載體，并將此耐旱基因?qū)敫黝愔参镏?，將可以提高植物的抗旱耐寒性能?br> 文檔編號C12N15/29GK101863968SQ20091025037
公開日2010年10月20日 申請日期2009年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月7日
發(fā)明者喬慧蕾, 孫國琴, 李曉東, 白晨, 郭九峰 申請人:內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院