一種奶牛瘤胃utb基因的轉(zhuǎn)錄因子gata2及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種奶牛瘤胃尿素轉(zhuǎn)運因子UTB基因的轉(zhuǎn)錄因子GATA2。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，反當家畜肉和奶生產(chǎn)中對環(huán)境的污染問題日益受到關(guān)注。Meta分析表明， 決定奶牛糞污總氮排出的主要因素是飼糧氮攝入量，牛對飼糧氮的有效利用率只有23%， 瘤胃代謝已被確定為反當動物氮利用效率低的最重要原因。瘤胃內(nèi)產(chǎn)生的氨除被微生物用 于合成菌體蛋白外，其余的氨經(jīng)消化道上皮吸收入口靜脈，隨血液進入肝臟合成尿素。肝臟 中產(chǎn)生的尿素91 %可通過再循環(huán)重新進入消化道內(nèi)，運就形成了反當動物尿素氮的再循環(huán) 利用。運種氮的再循環(huán)對維持反當動物體內(nèi)氮的平衡，尤其是在低氮飼糧條件下具有重要 意義。研究表明，低氮飼糧條件下，再循環(huán)至瘤胃的尿素氮顯著增加。探明氮再循環(huán)過程中 尿素轉(zhuǎn)運的調(diào)控機制有利于采取針對性措施提高不同飼糧和生理條件下反當動物的氮利 用。尿素轉(zhuǎn)運因子扣Ts)是高選擇性快速通透尿素的膜通道蛋白分子，在牛瘤胃中表達的 尿素轉(zhuǎn)運因子UTB通過參與尿素在瘤胃上皮細胞中的跨膜轉(zhuǎn)運，構(gòu)成了牛瘤胃尿素氮再循 環(huán)過程的重要部分，對于維持其氮平衡至關(guān)重要。UTB介導的經(jīng)上皮細胞的尿素轉(zhuǎn)運是經(jīng)刺 激后產(chǎn)生的，且不受已知尿素轉(zhuǎn)運因子UTA調(diào)控因子的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于探明奶牛瘤胃UTB基因的轉(zhuǎn)錄因子GATA2。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種奶牛瘤胃UTB基因的轉(zhuǎn)錄因子GATA2,所述奶牛瘤胃 UTB基因的轉(zhuǎn)錄因子GATA2基因的序列如SEQIDN0. 1所示。 陽0化]所述的奶牛瘤胃UTB基因的轉(zhuǎn)錄因子GATA2的構(gòu)建方法，（1)構(gòu)建GATA2轉(zhuǎn)錄因 子蛋白真核表達載體，將轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達載體分別與Ξ個缺失片段的UTB基因啟動子載 體共轉(zhuǎn)染293細胞，巧光素酶報告基因分析轉(zhuǎn)錄因子對于UTB啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用；（2) 根據(jù)牛UTB(AY838799. 1)基因啟動子信息，設(shè)計兩條能夠與GATA2蛋白相結(jié)合的探針并標 記，進行EMSA，確證GATA2與UTB啟動子位點的特異結(jié)合。
[0006] 轉(zhuǎn)錄因子GATA2應用于對奶牛瘤胃UTB基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。
[0007] 本發(fā)明的有益效果是：通過雙巧光素酶報告基因系統(tǒng)及EMSA探明奶牛瘤胃UTB基 因的轉(zhuǎn)錄因子一一GATA2,對于掲示奶牛瘤胃UTB基因轉(zhuǎn)錄機制，探明其瘤胃氮素再循環(huán)機 理，進而提高奶牛氮素利用、降低氮素排放。
【附圖說明】
[0008] 圖1為UTB基因測序方向圖；
[0009] 圖2為部分UTB-1測序結(jié)果；
[0010] 圖3為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染載體圖； W11] 圖4為UTB啟動子載體圖； 陽01引 圖5為PCDNA3. 1-GATA2載體圖；
[0013] 圖6為部分PCDNA3. 1-GATA2測序結(jié)果；
[0014] 圖7為EMSA試驗結(jié)果。
【具體實施方式】
[0015] 一種奶牛瘤胃UTB基因的轉(zhuǎn)錄因子GATA2,所述奶牛瘤胃UTB基因的轉(zhuǎn)錄因子 GATA2基因的序列如沈QIDN0. 1所示。
[0016] 所述的奶牛瘤胃UTB基因的轉(zhuǎn)錄因子GATA2的構(gòu)建方法，（1)構(gòu)建GATA2轉(zhuǎn)錄因 子蛋白真核表達載體，將轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達載體分別與Ξ個缺失片段的UTB基因啟動子載 體共轉(zhuǎn)染293細胞，巧光素酶報告基因分析轉(zhuǎn)錄因子對于UTB啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用；（2) 根據(jù)牛UTB(AY838799. 1)基因啟動子信息，設(shè)計兩條能夠與GATA2蛋白相結(jié)合的探針并標 記，進行EMSA，確證GATA2與UTB啟動子位點的特異結(jié)合。
[0017] 轉(zhuǎn)錄因子GATA2應用于對奶牛瘤胃UTB基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。
[0018] 本發(fā)明的有益效果是：通過雙巧光素酶報告基因系統(tǒng)及EMSA探明奶牛瘤胃UTB基 因的轉(zhuǎn)錄因子一一GATA2,對于掲示奶牛瘤胃UTB基因轉(zhuǎn)錄機制，探明其瘤胃氮素再循環(huán)機 理，進而提高奶牛氮素利用、降低氮素排放。
[0019] 具體實驗過程如下：
[0020] 1奶牛瘤胃上皮細胞UTB核屯、啟動子區(qū)域的確定
[0021] 1.1試驗材料
[0022] 試劑；內(nèi)切酶（F'ermentas);引物Oligo(Invitrogen合成）；TaqDNA化lymer ase(109660；34,Invitrogen) ;T4DNAligase(lU/yL)GiPOOGLF'ermentas);凝膠回收試 劑盒（AP-GX_250,A巧gen) ;GeneRyLerDNALadde;r(SM0332,F'ermentas)等，質(zhì)粒小抽試 劑盒（AP-MN-P-250，Ayxgen)，質(zhì)粒中抽試劑盒（AP-MD-P-25，Ayxgen)，質(zhì)粒大抽試劑盒 (ΑΡ-ΜΧ-Ρ-25,Ayxgen)；
[0023] 293 細胞（華大）；DMEM培養(yǎng)基 +10 %FBS(Invitrogen);轉(zhuǎn)染試劑： lipofectamine2000(Invit;rogen);雙巧光素酶報告基因檢測試劑盒（Promega)。
[0024]儀器：臺式冷凍離屯、機（Neofugel3R,HealF'orce)，生物安全柜 化FSafe-1800,Heal化rce)，PCR儀燈 100TM,Bio-Rad)，電泳成像系統(tǒng)燈anonieOO,天能）， 干式恒溫儀（TU-100C，一恒科技）溫控搖床燈監(jiān)-98,太倉）等；
[00巧]Mudulus測定儀（Tu;rne;rBiosystems) ;6 孔細胞培養(yǎng)板（Corning) ;C02 培養(yǎng)箱 (Thermo);巧光顯微鏡（Olympus)。 陽0%] 1. 2試驗方法
[0027] 1.2. 1啟動子載體構(gòu)建
[0028] 啟動子載體構(gòu)建采用PCR法，具體方法如下： 陽〇29] 設(shè)計引物
[0030] 根據(jù)根據(jù)Genbank中公布的UTB序列（AY838799. 1)，利用生物信息學方法對奶牛 UTB啟動子的核酸片段進行了生物學信息分析，每個祀基因序列設(shè)計并合成2條PCR擴增引 物（帶酶切位點）。
[0031] 1.2.2目的基因片段準備
[0032] (l)DNA提?。翰杉赡旰伤固鼓膛Ａ鑫干掀そM織，提取基因組DM并定量。 陽03引 似PCR反應：按照W下表格配制PCR反應體系。
[0034]
[0035] 擴增條件：按照W下條件在PCR擴增儀上進行PCR反應；
[0036]
[0037]
[0038] (3)凝回收：PCR產(chǎn)物割取目的條帶后經(jīng)Axygen凝膠回收試劑盒純化（按照產(chǎn)品 說明書操作）；
[0039] (4)定量：純化后PCR產(chǎn)物進行0D質(zhì)檢并定量；
[0040] 巧)PCR產(chǎn)物酶切及回收純化：按如下體系37°C水浴化，酶切后割膠回收純化（按 照Axygen凝膠回收試劑盒說明書操作）。
[0041 ]
[0042] (6)純化后酶切片段進行OD質(zhì)檢并定量。
[0043] 1. 2. 3骨架載體構(gòu)建
[0044] (1)骨架載體酶切反應和回收純化：按照下述體系37°C水浴化，酶切后膠回收 (按照Axygen膠回收試劑盒說明書操作）
[0045]
[0046] (2)純化后酶切片段進行0D質(zhì)檢并定量。
[0047] 1. 2. 4連接轉(zhuǎn)化與測序驗證
[0048] 連接反應：按W下體系于恒溫儀上進行連接，連接條件：16°C，過夜。
[0049] 陽化0]
[0051] 1.2. 5轉(zhuǎn)化、菌檢和測序
[0052] (1)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌，涂板過夜培養(yǎng)，
[0053] (2)從平板上隨機挑選完全落單的菌落，用菌檢PCR方法檢測，
[0054] (3)挑取陽性克隆測序驗證。
[0055] 1. 2. 6質(zhì)粒抽提和檢驗 陽056] 測序正確的菌液放大培養(yǎng)，利用Axygen質(zhì)粒抽提試劑盒和方法抽提質(zhì)粒，抽提的 質(zhì)粒進行0D測定。
[0057] 1.2. 7啟動子載體檢測
[0058] 啟動子載體活性檢測采用巧光素酶報告基因進行。
[0059] (1)細胞培養(yǎng)：于二氧化碳培養(yǎng)箱中用DMEM+10 %胎牛血清 (化ta化ovineserum，F(xiàn)B巧培養(yǎng)基按常規(guī)培養(yǎng)293細胞，維持良好生長狀態(tài)； W60] 似接種：轉(zhuǎn)染前一天接種6孔板，每孔細胞量約5X1〇5,培養(yǎng)過夜；
[OOW] 做轉(zhuǎn)染：待細胞融合度達90%W上時，按轉(zhuǎn)染試劑盒說明將1. 1構(gòu)建的載體進行 轉(zhuǎn)染，同時設(shè)立空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染載體作為對照。
[0062] (4)繼續(xù)培養(yǎng)：轉(zhuǎn)染過夜后換液，并繼續(xù)培養(yǎng)36h。 陽06引 妨裂解細胞：將細胞用PBS洗兩遍，加細胞裂解液300μL，置冰上裂解lOmin，收 集裂解液，13000巧m離屯、5min;
[0064] (6)巧光素酶檢測：在巧光顯微鏡下觀察空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染載體及UTB啟動子載體。 W65] 1. 3結(jié)果
[0066] 1. 3. 1UTB潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點確定
[0067] 根據(jù)Genebank中公布的UTB序列（AY838799. 1)，利用生物信息學方法對奶牛UTB 啟動子的核酸片段進行了生物學信息分析，初步確定潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，如：GATA2 及HSF等。
[0068] 1. 3. 2UTB啟動子載體的構(gòu)建
[0069] 從奶牛的瘤胃上皮組織中提取基因組DNA，根據(jù)Genebank中公布的UTB序列 (AY838799. 1)分別設(shè)計Ξ段引物，引物信息見表1，在引物的兩端加上油〇1和Hindlll的 酶切位點，WDNA為模板擴增包含不同區(qū)域的UTB啟動子序列，分別采用油〇1和化ndnI進 行雙酶切，克隆進入PGL3-basic巧光素酶報告基因載體，測序驗證重組序列的方向正確， 見圖1、圖2,獲得正確的載體：UTB-UUTB-2及UTB-3。
[0070] 表1引物序列及預計擴增片段長度
[0071]
[0072] 1. 3. 3 UTB啟動子載體的檢測
[0073] 在巧光顯微鏡下觀察空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染載體及UTB啟動子載體，見圖3及圖4,可見構(gòu)建 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果較好，轉(zhuǎn)染效率較高，可用于后續(xù)試驗。
[0074] 2GATA2轉(zhuǎn)錄因子對UTB啟動子的作用
[00巧]構(gòu)建GATA2轉(zhuǎn)錄因子蛋白真