水稻轉錄因子Os05g49170基因CDS序列在提高水稻抗旱能力中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及基因工程領域，具體地說，設及水稻轉錄因子0s05g49170基因CDS序 列在提高水稻抗旱能力中的應用。
【背景技術】
[0002] 近幾年來，因厄爾尼諾現(xiàn)象造成的大范圍內周期性降水導致±壤分布失衡W及各 地用水不當?shù)仍颍瓜喈敺秶鷥鹊母珊导觿?，農(nóng)用水源日趨緊張已威脅到糧食安全問題。 水稻是我國最重要的糧食作物，而干旱脅迫是影響水稻生長發(fā)育并最終導致減產(chǎn)的重要環(huán) 境因素之一。目前，利用分子生物學技術已發(fā)現(xiàn)了一些能夠提高水稻抗旱能力的基因。隨 著分子生物學，細胞遺傳學及高新技術的發(fā)展，對于水稻抗旱性的研究日趨深入，逐漸開始 從細胞和分子水平對水稻抗旱性進行研究。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供水稻轉錄因子0s05g49170基因CDS序列在提高水稻抗旱能 力中的應用。
[0004] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的水稻轉錄因子0s05g49170基因CDS序列在提 高水稻抗旱能力中的應用，所述應用是通過在水稻中過表達水稻轉錄因子0s05g49170基 因CDS序列，從而提高轉基因水稻的抗旱能力。 陽0化]本發(fā)明中設及的水稻轉錄因子0s05g49170基因CDS序列如SEQIDNo.1所示。
[0006] 具體地，前述應用是指采用In-化Sion技術將水稻轉錄因子0s05g49170基因CDS 序列構建到植物雙元表達載體的化iquitin啟動子的下游，轉化水稻，篩選轉基因水稻植 株。
[0007] 優(yōu)選地，所述植物雙元表達載體的出發(fā)載體為PCAMBIA1390。
[0008] 其中，In-化Sion技術中使用的用于擴增目的基因的引物對為：
[0009] 正向引物F日'-TCTGCACTAGGTACCTGCAGATGTCCATCTCGCTGCGC-3'
[0010]反向引物R 5'-ATGGATCCGTCGACCTGCAG GAACAACATC ATCAAGGGGATAA-3'
[0011] 前述應用中，轉化水稻具體為：采用農(nóng)桿菌介導的方法，將構建的表達載體（SEQ IDNo.2)轉入水稻愈傷組織中，用含誘導劑和農(nóng)桿菌的AAM培養(yǎng)液進行轉化，轉化后的材 料經(jīng)過共培養(yǎng)-篩選-分化-生根-轉基因苗的鍛煉和移栽，篩選轉基因水稻植株。
[0012] 優(yōu)選地，前述應用中轉化的水稻品種為日本晴'kitaake'。
[0013] 更優(yōu)選地，前述的應用是利用潮霉素篩選轉基因水稻植株。
[0014] 本發(fā)明首次利用過表達水稻轉錄因子0s05g49170基因CDS序列提高水稻的抗旱 能力。本發(fā)明提供的提高水稻抗旱能力的方法，對于在生產(chǎn)中提高水稻的抗旱性，詳細闡明 水稻抗旱的分子機理，具有重要的理論價值，并且可W通過轉基因手段，提高水稻在干旱條 件下的生存能力，因此在生產(chǎn)中同樣具有重要意義。
【附圖說明】
[0015] 圖1為本發(fā)明實施例3中Western Blot檢測轉基因陽性水稻株系。
[0016] 圖2為本發(fā)明實施例4中過表達水稻轉錄因子0s05g49170基因CDS序列的水稻 材料抗旱性提高。其中，PEGOd代表水稻材料在長日照（14h光照/1化黑暗）生長21天， 未經(jīng)PEG處理；PEGIOd代表水稻材料經(jīng)PEG處理10天；Rec7d代表水稻材料經(jīng)PEG處理 10天后，移除陽G，復水7天。
[0017] 圖1和圖2中，WT為野生型水稻，0SC0R413-1和0SC0R413-2為轉基因株系。
【具體實施方式】
[0018]W下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:a1油oratorymanual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0019] 實施例1水稻轉錄因子0s05g49170基因CDS序列的獲得及表達載體的構建
[0020] 在植物轉錄因子數(shù)據(jù)庫（ht1:p://;rice.plan憂iology.msu.edu/analyses_ search_locus.shtml)中找到0s05g49170基因，根據(jù)其CDS序列設計PCR擴增引物，W野 生型日本晴'kitaake'水稻總CDNA為模板，進行PCR擴增獲得水稻轉錄因子0s05g49170 基因CDS序列，其核巧酸序列如SEQIDNo. 1所示。按照PrimeSTAR聚合酶擴增體系和 反應程序進行PCR擴增。然后利用In-化Sion技術，將PCR擴增產(chǎn)物純化后克隆到帶有 化iquitin啟動子的過表達載體PCAMBIA1390上，經(jīng)測序鑒定得到與目的基因（即水稻轉 錄因子0s05g49170基因CDS序列）完全相同的序列，，構建的表達載體命名為ubi:L0C_ 0s05g49170(沈QIDNo. 2)。 陽02UIn-化Sion技術中使用的用于擴增目的基因的引物對為：
[0022] 正向引物F日'-TCTGCACTAGGTACCTGCAGATGTCCATCTCGCTGCGC-3'
[0023]反向引物R5'-ATGGATCCGTCGACCTGCAGGAACAACATCATCAAGGGGATAA-3'
[0024] 實施例2轉基因水稻植株的獲得
[00巧]取水稻'kitaake'成熟種子，人工或機械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子經(jīng)消毒 之后接種到誘導培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)。選擇外觀良好，生長力好的水稻愈傷組織為受體 材料，采用農(nóng)桿菌介導法將Ubi:L0C_0s05g49170轉入水稻愈傷組織中，用含有100yM的乙 酷下香酬和OD值為0. 7的農(nóng)桿菌的AAM培養(yǎng)液進行轉化，將轉化液浸泡過的愈傷組織置于 共培養(yǎng)基上進行共培養(yǎng)，25°C暗培養(yǎng)3d后置于篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)約30d，每IOd繼代一次。 然后將篩出的抗性愈傷轉移到分化培養(yǎng)基上分化約20山每IOd繼代一次。將分化出綠色小 苗的抗性愈傷轉移到生根培養(yǎng)基上生根，待約7d長出發(fā)達根系后煉苗，并計算轉化所獲轉 基因苗數(shù)，共獲得70個轉基因植株。煉苗7d后轉移至大田生長。
[0026] 本實施例中設及的培養(yǎng)基配方如下：
[0027] 誘導培養(yǎng)基：N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+銅鉆母液巧.5mg/L2, 4D+0. 6g/L 酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酷胺+30g/L薦糖，W水配制，調抑至5. 8~ 5. 9后加入植物凝膠4g/L。
[0028] 共培養(yǎng)基：N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽巧.5mg/L2, 4D+0. 5g/L谷氨酷胺 +0. 6g/L酸水解酪蛋白+lOg/L葡萄糖+30g/L薦糖，W水配制，調pH至5. 2后加入植物凝膠 4g/L。滅菌后，50°C左右加入AS(乙酷下香酬）100~200yg/mL。
[0029] 篩選培養(yǎng)基：N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+銅鉆母液巧.5mg/L 2, 4D+0.6g/L 酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酷胺+30g/L薦糖，W水配制，調抑至5.8~ 5. 9后加入植物凝膠4g/L。滅菌后加入35mg/L潮霉素（購自上海紐津生物技術有限公司）。 W30]分化培養(yǎng)基：MS無機+MS-B5微量+MS有機+鐵鹽+MS-銅鉆母液+0. 05mg/L NAA巧.Omg/LKinetin(激動素）+30g/L山梨醇巧g/L水解酪蛋白+30g/L薦糖，W水配制， 調抑至5.8~5. 9后加入植物凝膠4g/L。
[0031] 實施例3轉基因陽性株系的鑒定
[0032] 為檢測水稻轉錄因子0s05g49170基因CDS序列已在水稻中過表達，利用Flag抗 體（購自Abmart公司，M20008L)對其在蛋白質水平上進行鑒定。
[0033] 提取轉基因水稻植株0sC0R413-1和0sC0R413-2的總蛋白，經(jīng)過SDS-PAGE蛋白電 泳后，進行免疫巧光反應，經(jīng)Western Blot鑒定結果表明轉基因植株中存在目的蛋白，而野 生型未雜出條帶（圖1)。
[0034] 實施例4轉基因水稻表型分析
[0035] 與野生型水稻'kitaake'相比，轉基因株系0SC0R413-1和0SC0R413-2的抗旱性 明顯提高，野生型水稻在經(jīng)陽G處理并復水后，存活率明顯低于轉基因材料（圖2)。
[0036] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎上，可W對之作一些修改或改進，運對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的運些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【主權項】
1. 水稻轉錄因子0s05g49170基因⑶S序列在提高水稻抗旱能力中的應用。2. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，通過在水稻中過表達水稻轉錄因子 0s05g49170基因⑶S序列，從而提高轉基因水稻的抗旱能力。3. 根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于，所述水稻轉錄因子0s05g49170基因CDS 序列如SEQIDNo. 1所示。4. 根據(jù)權利要求1-3任一項所述的應用，其特征在于，采用In-fusion技術將水稻轉錄 因子0s05g49170基因⑶S序列構建到植物雙元表達載體的Ubiquitin啟動子的下游，轉化 水稻，篩選轉基因水稻植株。5. 根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于，所述植物雙元表達載體的出發(fā)載體為 PCAMBIA1390。6. 根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于，In-fusion技術中使用的用于擴增目的基 因的引物對為： 正向引物F5'-TCTGCACTAGGTACCTGCAGATGTCCATCTCGCTGCGC-3' 反向引物R5'-ATGGATCCGTCGACCTGCAGGAACAACATCATCAAGGGGATAA-3'。7. 根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于，所述轉化水稻具體為：采用農(nóng)桿菌介導的 方法，將構建的表達載體轉入水稻愈傷組織中，用含誘導劑和農(nóng)桿菌的AAM培養(yǎng)液進行轉 化，轉化后的材料經(jīng)過共培養(yǎng)-篩選-分化-生根-轉基因苗的鍛煉和移栽，篩選轉基因水 稻植株。8. 根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于，構建的表達載體的全序列如SEQIDNo. 2 所示。9. 根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于，轉化的水稻品種為日本晴'kitaake'。10. 根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于，利用潮霉素篩選轉基因水稻植株。
【專利摘要】本發(fā)明提供水稻轉錄因子Os05g49170基因CDS序列在提高水稻抗旱能力中的應用，所述應用是通過在水稻中過表達水稻轉錄因子Os05g49170基因CDS序列，從而提高轉基因水稻的抗旱能力。本發(fā)明采用In-fusion技術將水稻轉錄因子Os05g49170基因CDS序列構建到植物雙元表達載體的Ubiquitin啟動子的下游，轉化水稻，篩選轉基因水稻植株。本發(fā)明提供的提高水稻抗旱能力的方法，對于在生產(chǎn)中提高水稻的抗旱性，詳細闡明水稻抗旱的分子機理，具有重要的理論價值，并且可以通過轉基因手段，提高水稻在干旱條件下的生存能力，因此在生產(chǎn)中同樣具有重要意義。
【IPC分類】A01H5/00, C12N15/84
【公開號】CN105154468
【申請?zhí)枴緾N201510543199
【發(fā)明人】劉斌, 張春雨, 趙濤, 李宏宇, 劉軍, 林辰濤
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年8月28日