專利名稱：鑒定致病性曲霉的專用探針與基因芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鑒定致病性曲霉的專用探針與基因芯片。
背景技術(shù)：
近年來，隨著抗惡性腫瘤治療的深入開展，器官移植尤其是同種異體造血干細(xì)胞移植(HSCT)的不斷實(shí)施，由曲霉感染引起的侵襲性曲霉病(Invasiveaspergillosis， IA)已經(jīng)成為各種重癥免疫受損機(jī)體中最常見的機(jī)會性感染，也是患者致死的最主要原因，如在白血病和HSCT受者中致死率常超過90X。引起IA的病原菌有煙曲霉、黃曲霉、構(gòu)巢曲霉、土曲霉和黑曲霉等，這些IA的不同病原菌對不同的抗真菌藥物的敏感性具有很大的差異。譬如煙曲霉對二性霉素B敏感，但是土曲霉卻對之天然耐藥，而黃曲霉則偶然可以表現(xiàn)出對之耐藥。因此準(zhǔn)確鑒定不同病原性曲霉的菌種，對于臨床上選擇恰當(dāng)?shù)目拐婢幬?，具有十分重要的意義。 傳統(tǒng)用于致病性曲霉的檢查手段主要包括真菌鏡檢、培養(yǎng)、鑒定以及抗真菌藥物敏感性測定等，但是這些方法往往需時(shí)長，大約需要3-4周；而且檢測的陽性率低?？焖佟⒚舾?、特異地檢測致病性曲霉并對其進(jìn)行種水平的鑒定，已成為臨床上迫切需要解決的重要問題，這一問題的解決，對于正確的診斷、合理選擇敏感的藥物并制定治療方案具有十分重要的意義。 分子生物學(xué)相關(guān)的從臨床標(biāo)本中直接檢測真菌的技術(shù)和方法正在不斷發(fā)展中，最為活躍的PCR技術(shù)較真菌培養(yǎng)等方法具有快速、敏感等特點(diǎn)，該技術(shù)可以擴(kuò)增血清、血漿、全血、尿液、痰液、支氣管肺泡灌洗液和膿液等標(biāo)本中的真菌成份。但是，目前仍然不能快速、特異地檢測臨床標(biāo)本中的致病性曲霉并進(jìn)一步進(jìn)行菌種鑒定。 導(dǎo)流雜交技術(shù)(Flow-through hybridization, US專利號6020187和5741647)是將探針固定在質(zhì)基體上，檢測樣品流經(jīng)置于導(dǎo)流雜交裝置的質(zhì)基體時(shí)，耙序列與探針雜交形成復(fù)合體，然后通過顯色來檢測雜交復(fù)合體從而反映出被檢測樣品中的核酸靶分子。這項(xiàng)技術(shù)較傳統(tǒng)的雜交方法具有特異性強(qiáng)、快速的特點(diǎn)，如果能夠?qū)⑦@項(xiàng)技術(shù)與高通量低密度基因芯片技術(shù)和靈敏性高的PCR技術(shù)結(jié)合起來，則可以在檢測臨床標(biāo)本中的常見致病性曲霉，以及進(jìn)行致病性曲霉菌種鑒定時(shí)發(fā)揮快速、特異的積極作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鑒定致病性曲霉的專用探針與基因芯片。
本發(fā)明提供了一種鑒定致病性曲霉的專用探針，由如下20個(gè)DNA片段中的至少一個(gè)組成核苷酸序列分別是序列表的序列1至序列10的10個(gè)DNA片段和核苷酸序列分別是序列表的序列1至序列10的反向互補(bǔ)序列的10個(gè)DNA片段。以上20個(gè)DNA片段，均是根據(jù)不同種的致病性曲霉的保守序列設(shè)計(jì)的，其中每個(gè)DNA片段，或每兩個(gè)DNA片段、每三個(gè)DNA片段、每四個(gè)DNA片段，……，直至全部DNA片段的組合，均可用于鑒定致病性曲霉。
本發(fā)明還保護(hù)用于鑒定致病性曲霉的DNA芯片，含有以上任一所述的專用探針。
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本發(fā)明同時(shí)保護(hù)鑒定致病性曲霉的裝置，包括以上任一所述的專用探針或以上任 一所述的DNA芯片。 所述裝置還可包括序列表的序列11和序列表的序列12所示核苷酸組成的引物 對。為了便于檢測待測DNA與所述探針的雜交結(jié)果，所述引物對上可標(biāo)記有生物素。
以上任一所述的專用探針、以上任一所述的DNA芯片或以上任一所述的裝置均可 應(yīng)用于鑒定致病性曲霉。 以上所述專用探針、所述DNA芯片、所述裝置或所述應(yīng)用中，所述致病性曲霉可為 煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)或土曲霉(Aspergillus teireus)等。 本發(fā)明還保護(hù)一種鑒定致病性曲霉的方法，是將致病性曲霉的rDNA的ITS區(qū)分別 與所述專用探針雜交，根據(jù)雜交結(jié)果鑒定待測致病性曲霉。所述致病性曲霉的rDNA的ITS 區(qū)具體可為以待測致病性曲霉的總DNA為模板，用序列表的序列11和序列表的序列12所 示核苷酸組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的；所述方法中，所述致病性曲霉具體可為煙曲 霉(Aspergillus fumigatus)、黃曲霉(Aspergillusf lavus)、黑曲霉(Aspergillus niger) 或土曲霉(Aspergillus terreus)等。 本發(fā)明還保護(hù)一種檢測樣本中含有致病性曲霉中的哪種或哪幾種的方法，其特征 在于所述致病性曲霉具體可為煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)或土曲霉(Aspergillusterreus);所述方法包括 如下步驟(1)以待測樣本的總DNA為模板，用序列表的序列11和序列表的序列12所示 核苷酸組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目標(biāo)DNA;(2)將目標(biāo)DNA分別與序列表的序列1 至序列表的序列IO所示DNA片段進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交結(jié)果評判如下如果序列l(wèi)(AFl)和 /或序列2(AF2)的雜交結(jié)果為陽性，所述樣本中含有煙曲霉(Aspergillus fumigatus); 如果序列3(AFL1)和/或序列4(AFL2)的雜交結(jié)果為陽性，所述樣本中含有黃曲霉 (Aspergillusf lavus);如果序列5(AN1)和/或序列6 (AN2)的雜交結(jié)果為陽性，所述樣本 中含有黑曲霉(Aspergillus niger);如果序列7(AT1)和/或序列8 (AT2)的雜交結(jié)果為 陽性，所述樣本中含有土曲霉(Aspergillus terreus);如果序列9 (A-P-SPECl)和/或序 列10(A-P-SPEC2)的雜交結(jié)果為陽性，所述樣本中可能含有曲霉。如果僅有一種曲霉菌相 應(yīng)的探針的雜交結(jié)果為陽性，則待測樣本僅含有該一種曲霉菌，如果幾種不同曲霉菌相應(yīng) 的探針的雜交結(jié)果均為陽性，則待測樣本中含有該幾種曲霉菌。 本發(fā)明利用PCR法檢測真菌最常用的靶序列之 一 -內(nèi)轉(zhuǎn)錄間區(qū) (Internaltranscriptional space, ITS)，這是一個(gè)多拷貝的串聯(lián)重復(fù)序歹lj，其28s、5. 8s 和18s rDNA在種間具有保守性，故可以用于設(shè)計(jì)通用引物，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；而ITS1和 ITS2區(qū)具有可變性，因此可以進(jìn)行種特異性探針的選擇。本發(fā)明中將種特異性探針包被 在低密度基因芯片膜上，然后將上述PCR產(chǎn)物通過基于導(dǎo)流雜交技術(shù)的檢測平臺，與低密 度基因芯片膜上的種特異性探針進(jìn)行導(dǎo)流雜交(Flow-through hybridization, US專利號 6020187和5741647)并顯色，從而最終實(shí)現(xiàn)臨床標(biāo)本中致病性曲霉的快速檢測及其準(zhǔn)確的 菌種鑒定。
具體實(shí)施例方式
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)
方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自
常規(guī)生化試劑商店購買得到的。 以下實(shí)施例中所用的DNA片段如下 針對致病性曲霉的核酸rDNA的ITS區(qū)的特異性探針 煙曲霉特異性探針 AF1 (Aspergillus fumigatus) :5，-GCCGTTTCGACGGCCGCCGGGGAGG_3，；序列表的序 列1。 AF2 (Aspergillus fumigatus) :5， -AACATGAACGCTGTTCTGAAAGTATG_3，；序列表的 序列2。 黃曲霉特異性探針 AFL1 (Aspergillus flavus) :5' -CGAACGCAAATCAATCTTTCC-3';序列表的序列3。 AFL2 (Aspergillus flavus) :5' -ACGAACTCTGTCTGATCTAGT-3';序列表的序列4。 黑曲霉特異性探針 AN1 (Aspergillus niger) :5， -GCCGCTTGTCGGCCGCCGG-3，；序列表的序列5。 AN2 (Aspergillus niger) :5， -CACGAACACTGTCTGAAAGCGT-3';序列表的序列6。 土曲霉特異性探針 ATI (Aspergillus terreus) :5，-CGACGCATTTATTTGCAACTTGT_3，；序列表的序列7。 AT2 (Aspergillus terreus) :5，-ATGAACCCTGTTCTGAAAGCTTG_3，；序列表的序列8。 曲霉特異性探針 A-P-SPEC1 :5， -TCCTCGAGCGTATGGGGCT-3';序列表的序列9。 A-P-SPEC2 :5， -CGGCTTGTGTGTTGGG-3';序列表的序列10。 將上述探針分別包被在基因芯片膜(硝酸纖維素膜)上。 擴(kuò)增致病性曲霉的rDNA的ITS區(qū)的引物對(弓|物上標(biāo)記有生物素) Forward :5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCA-3';序列表的序列11 ; Reverse :5' -CGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCG-3';序列表的序列12。 以下實(shí)施例中所用的致病性曲霉樣本分別購自北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心
菌種保藏中心，每個(gè)菌種樣本的編號如下
煙曲霉(Aspergillus f咖igatus) :AF293 ;
黃曲霉(Aspergillus flavus) :BMU002584 ;
黑曲霉(Aspergillus niger) :BMU02090 ;
土曲霉(Aspergillus terreus) :BMU00322。
實(shí)施例1、致病性曲霉的檢測及菌種快速鑒定 分別將含有已知不同菌種的致病性曲霉的樣本按照標(biāo)準(zhǔn)方法提取基因組DNA，然 后用上述引物對(序列表的序列11和序列12)進(jìn)行PCR反應(yīng)(約1. 5小時(shí))，之后將PCR 產(chǎn)物與標(biāo)記有不同探針(分別為序列l(wèi)至序列IO所示探針)的硝酸纖維素膜通過醫(yī)用核酸 分子雜交儀進(jìn)行導(dǎo)流雜交反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)的結(jié)果判斷被檢測樣本中的菌種，所需時(shí)間為3. 5 小時(shí)。結(jié)果見表l。
表1常見致病性曲霉的鑒定結(jié)果
樣本檢測結(jié)果
煙曲霉 (Aspergi1lusfumigatus)AF1、AF2陽性；A-P-SPEC1、A-P-SPEC2陽性； AFL1、AFL2、AN1、AN2、AT1、AT2陰性;
黃曲霉 (Aspergi1lusflavus)AFL1、AFL2陽性;A-P-SPEC1、 A-P-SPEC2陽性; AF1、AF2、AN1、AN2、AT1、AT2陰性;
黑曲霉 (Aspergi1lusniger)AN1、AN2陽性；A-P-SPEC1、A-P-SPEC2陽性； AFL1、AFL2、AF1、AF2、AT1、AT2陰性
土曲霉 (Aspergillusterreus)AT1、AT2陽性；A-P-SPEC1、A-P-SPEC2陽性； AFL1 、 AFL2 、 AN1 、 AN2 、 AF1 、 AF2陰性 實(shí)施例2、致病性曲霉混合菌的檢測及菌種的快速鑒定 將含有已知的致病性曲霉的混合菌的樣本按照標(biāo)準(zhǔn)方法提取基因組DNA，然后用 上述引物對(序列表的序列11和序列12)進(jìn)行PCR反應(yīng)(約1. 5小時(shí))，之后將PCR產(chǎn)物 與標(biāo)記有不同探針(分別為序列1至序列10所示探針)的硝酸纖維素膜通過醫(yī)用核酸分 子雜交儀進(jìn)行導(dǎo)流雜交反應(yīng)(約2小時(shí))，根據(jù)反應(yīng)的結(jié)果可以判斷被檢測樣本中所存在的 混合的菌種，總共所需時(shí)間為3. 5小時(shí)。結(jié)果見表2。
表2致病性曲霉混合樣本的鑒定結(jié)果
標(biāo)本混合菌種標(biāo)本中的菌種檢測結(jié)果
標(biāo)本一煙曲霉、黃曲霉AF1、AF2、AFL1、AFL2、A-P-SPEC1、A-P-SPEC2陽性，其余為陰性
標(biāo)本二煙曲霉、黑曲霉AF1、 AF2、 AN1、 AN2、 A-P-SPEC1、 A-P-SPEC2陽性，其余為陰性
標(biāo)本三黃曲霉、黑曲霉AFL1、 AFL2、 AN1、 AN2、 A-P-SPEC1、 A-P-SPEC2陽性，其余為陰性
標(biāo)本四煙曲霉、黃曲霉、土曲AF1、 AF2、 AFL1、 AFL2、 AT1、 AT2、 A-P-SPEC1、 A-P-SPEC2陽性， 其余為陰性
標(biāo)本五煙曲霉、黑曲霉、土曲AF1 、 AF2 、 AN1 、 AN2 、 ATI 、 AT2、 A—P—SPEC1 、 A—P—SPEC2陽性， 其余為陰性
標(biāo)本六黃曲霉、黑曲霉、土曲AFL1 、 AFL2 、 AN 1 、 AN2 、 ATI 、 AT2、 A-P-SPEC1 、 A-P-SPEC2陽性， 其余為陰性
6
序列表〈110〉北京大學(xué)第一醫(yī)院〈120〉鑒定致病性曲霉的專用探l
〈130〉CGGNARY92637〈160>12〈210>1〈211>25〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>1gccgtttcga cggccgccggggagg<210>2〈211>26〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>2朋c3tgaacg ctgttctg朋3gtatg〈210>3〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<223>〈400>3cgaacgcaaa tcaatctttcc〈210>4〈211>21〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉〈400>4acgaactctg tctgatctagt〈210>5〈211>19
<213>人工序列〈220〉〈223〉〈400>5gccgcttgtc ggccgccgg〈210>6〈211〉22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉6c;acgaac3ct gtctgaaagc<210>7〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>7cgacgcattt atttgcaact〈210〉8〈211>23<212>DNA<213>人工序列〈220〉〈223〉〈400>8atgaaccctg ttctgaaagc<210>9〈211〉19〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉9tcctcgagcg tatggggct〈210>10
〈211>16〈212>DNA〈213〉人工序列〈220>〈223〉〈400>10cggcttgtgt gttggg〈210>11〈211>27〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>11tccgtaggtg aacctgcggaaggatca〈210>12〈211>27〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>12cgcttattga tatgcttaagttcagcg
權(quán)利要求
鑒定致病性曲霉的專用探針，由如下20個(gè)DNA片段中的至少一個(gè)組成核苷酸序列分別是序列表的序列1至序列10的10個(gè)DNA片段和核苷酸序列分別是序列表的序列1至序列10的反向互補(bǔ)序列的10個(gè)DNA片段。
2. 用于鑒定致病性曲霉的DNA芯片，含有權(quán)利要求1所述專用探針。
3. 鑒定致病性曲霉的裝置，包括權(quán)利要求1所述專用探針或權(quán)利要求2所述DNA芯片。
4. 如權(quán)利要求3所述的裝置，其特征在于所述裝置還包括序列表的序列l(wèi)l和序列表 的序列12所示核苷酸組成的引物對。
5. 如權(quán)利要求4所述的裝置，其特征在于所述引物對上標(biāo)記有生物素。
6. 權(quán)利要求1所述專用探針、權(quán)利要求2所述DNA芯片或權(quán)利要求3至5中任一所述 裝置在鑒定致病性曲霉中的應(yīng)用。
7. 如權(quán)利要求1所述的專用探針、如權(quán)利要求2所述的DNA芯片、如權(quán)利要求3至 5中任一所述的裝置或如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述致病性曲霉為煙曲霉 (Aspergillus fumigatus)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger) 或土曲霉(Aspergillus terreus)。
8. —種鑒定致病性曲霉的方法，是將致病性曲霉的rDNA的ITS區(qū)分別與權(quán)利要求1所 述專用探針雜交，根據(jù)雜交結(jié)果鑒定待測致病性曲霉。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述致病性曲霉的rDNA的ITS區(qū)是以待 測致病性曲霉的總DNA為模板，用序列表的序列11和序列表的序列12所示核苷酸組成的 引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的；所述致病性曲霉為煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、黃曲霉 (Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)或土曲霉(Aspergillus terreus)。
10. —種檢測樣本中含有致病性曲霉中的哪種或哪幾種的方法，其特征在于所述致病性曲霉為煙曲霉(Aspergillus f咖igatus)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉 (Aspergillus niger)或土曲霉(Aspergillus terreus);所述方法包括如下步驟(1) 以待測樣本的總DNA為模板，用序列表的序列l(wèi)l和序列表的序列12所示核苷酸組 成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目標(biāo)DNA ;(2) 將目標(biāo)DNA分別與序列表的序列1至序列表的序列IO所示DNA片段進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交結(jié)果評判如下如果序列1和/或序列2的雜交結(jié)果為陽性，所述樣本中含有煙曲霉 (Aspergillusfumigatus);如果序列3和/或序列4的雜交結(jié)果為陽性，所述樣本中含有黃 曲霉(Aspergillus flavus);如果序列5和/或序列6的雜交結(jié)果為陽性，所述樣本中含 有黑曲霉(Aspergillus niger);如果序列7和/或序列8的雜交結(jié)果為陽性，所述樣本中 含有土曲霉(Aspergillus terreus);如果序列9和/或序列10的雜交結(jié)果為陽性，所述 樣本中可能含有曲霉。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒定致病性曲霉的專用探針與基因芯片。本發(fā)明提供的鑒定致病性曲霉專用探針，由如下20個(gè)DNA片段中的至少一個(gè)組成核苷酸序列分別是序列表的序列1至序列10的10個(gè)DNA片段和核苷酸序列分別是序列表的序列1至序列10的反向互補(bǔ)序列的10個(gè)DNA片段。本發(fā)明還提供了含有所述專用探針的用于鑒定致病性曲霉的DNA芯片。所述專用探針、DNA芯片或裝置均可應(yīng)用于鑒定致病性曲霉。本發(fā)明中將種特異性探針包被在低密度基因芯片膜上，然后將待測致病性曲霉的rDNA的ITS區(qū)通過基于導(dǎo)流雜交技術(shù)的檢測平臺，與低密度基因芯片膜上的種特異性探針進(jìn)行導(dǎo)流雜交并顯色，從而最終鑒定出待測致病性曲霉。本發(fā)明具有特異性強(qiáng)、快速的特點(diǎn)，可以在檢測臨床標(biāo)本中的常見致病性曲霉，以及進(jìn)行致病性曲霉菌種鑒定時(shí)發(fā)揮快速、特異的積極作用。
文檔編號C12Q1/04GK101705301SQ200910237228
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月5日
發(fā)明者劉偉, 李若瑜, 許輝 申請人:北京大學(xué)第一醫(yī)院