專利名稱：高通量檢測(cè)脊椎動(dòng)物病原體基因芯片的探針設(shè)計(jì)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物芯片探針的一種設(shè)計(jì)方法。尤其是基于此方法設(shè)計(jì)得到的探針用來對(duì)以脊椎動(dòng)物為宿主的病毒、細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物進(jìn)行高通量檢測(cè)，本發(fā)明對(duì)不同類型的病原體分別采用了有針對(duì)性的設(shè)計(jì)流程。
背景技術(shù)：
傳染病是由各種病原體引起的能在人與人、動(dòng)物與動(dòng)物或人與動(dòng)物之間相互傳播的一類疾病。每種傳染病都有其特異的病原體，包括病毒、細(xì)菌、真菌、原蟲、螺旋體、立克茨體等。傳染病與其他種類疾病相比，具有發(fā)病強(qiáng)度高、傳播速度快、波及范圍廣、地域性和季節(jié)性強(qiáng)等特點(diǎn)，傳染病產(chǎn)生的危害性極大，不但患者死亡率高，而且容易導(dǎo)致社會(huì)恐慌心理，產(chǎn)生的次級(jí)危害往往更大，直接影響社會(huì)的經(jīng)濟(jì)活動(dòng)和人的正常生活秩序。雖然傳染病理論上分為人與人、動(dòng)物與動(dòng)物或人與動(dòng)物專有傳染病，但是許多傳染性疾病，甚至包括流行病，都起于人畜共通的特性，要區(qū)分哪些疾病從感染動(dòng)物逐步演化成可以感染人類并不簡(jiǎn)單，但有證據(jù)顯示麻疹、天花、流行性感冒、白喉等皆是如此。而艾滋病、感冒和結(jié)核也都來自人類以外的物種。人畜通病在國(guó)際間引起密切關(guān)注，因?yàn)樗鼈兺ǔＪ沁^去未被發(fā)現(xiàn)的疾病，或是毒力在演化過程中增強(qiáng)，或偶然傳入不具對(duì)抗該疾病之免疫力的族群或物種。因此，對(duì)以脊椎動(dòng)物為宿主的病原體進(jìn)行系統(tǒng)地監(jiān)測(cè)，是有效進(jìn)行傳染病防控的一個(gè)必要環(huán)節(jié)。在傳染病爆發(fā)過程中，人類由以前被動(dòng)承受，到治療控制，再到提前預(yù)防控制，積累了大量和傳染病做斗爭(zhēng)的技術(shù)經(jīng)驗(yàn)。特別是隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，人類已經(jīng)建立起了多種具體傳染病檢測(cè)方法，I)微生物培養(yǎng)法；2)血清學(xué)標(biāo)記物檢測(cè)法；3)血液或分泌物中所含病毒和病原相關(guān)蛋白質(zhì)檢測(cè)，其中包括ELISA、膠體金等方法；4)通過傳染源核酸序列，進(jìn)行特異性的熒光定量PCR檢測(cè)法；5)快速發(fā)展的生物芯片微陣列高通量方法。微生物培養(yǎng)法由于直觀方便等特點(diǎn)，還是最主要的傳染病診斷工具，但有些傳染原如病毒和鉤端螺旋體無法進(jìn)行人工培養(yǎng)，就只能借助其他診斷工具；血清學(xué)標(biāo)記物檢測(cè)法，也是通過病原體感染機(jī)體后產(chǎn)生的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，通行的抗體檢測(cè)由于存在“血清學(xué)窗口期”，只能在感染2-4周后才能確診，而且該方法還需要和微生物培養(yǎng)法相互引證；基于血液或分泌物的病原蛋白質(zhì)檢測(cè)，如ELISA和膠體金法也是對(duì)血清學(xué)檢測(cè)方法的改進(jìn)，也同樣存在以上弊端；新近涌現(xiàn)的針對(duì)病原體的RNA或DNA的熒光定量PCR檢測(cè)方法，有靈敏性高，準(zhǔn)確率高，能夠有效縮短“病原窗口期”等特點(diǎn)。但該檢測(cè)方法也只能針對(duì)已知病原體設(shè)計(jì)特異的PCR引物和探針，不能實(shí)現(xiàn)高通量檢驗(yàn)檢測(cè)，不能滿足新發(fā)與突發(fā)性傳染病的快速、準(zhǔn)確、靈敏的診斷需求，是重大傳染性疾病的防疫防控與及時(shí)救治的主要技術(shù)瓶頸之一。生物芯片方法，在考慮了傳統(tǒng)和現(xiàn)有傳染病檢測(cè)方法的局限性基礎(chǔ)之上，結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)高通量技術(shù)優(yōu)勢(shì)，而建立起來的傳染病病原體診斷檢測(cè)方法。該方法主要技術(shù)優(yōu)點(diǎn)包括:1)高通量。一張芯片上的一個(gè)點(diǎn)陣可以對(duì)一份樣本同時(shí)分析成千上萬種的病原體，而一張芯片上有可以同時(shí)分析數(shù)十個(gè)臨床樣本；2)快速、準(zhǔn)確和靈敏。單次檢測(cè)I天即可完成，加之高通量特異性，檢測(cè)效力明顯優(yōu)于現(xiàn)有的其他方法；由于檢測(cè)過程中采用全封閉的熒光自動(dòng)化檢測(cè)系統(tǒng)，集合特異性探針，檢測(cè)準(zhǔn)確度高、靈敏度好；3)可檢測(cè)未知病原體。現(xiàn)有病原體檢測(cè)方法，只能對(duì)已知病原體進(jìn)行確認(rèn)，對(duì)于未知病原體檢測(cè)則無能為力，例如熒光定量PCR方法，有很多技術(shù)優(yōu)勢(shì)，但前提必須知道被檢病原體核酸序列，否則將無法檢測(cè)。而生物芯片檢測(cè)系統(tǒng)，由于探針設(shè)計(jì)本身就具有兼容性，檢測(cè)序列發(fā)生突變將不會(huì)影響雜交檢測(cè)。大部分病原體新品種其實(shí)都是已知病原體在藥物和環(huán)境壓力下的突變體，序列具有很高同源性。由于生物芯片檢測(cè)技術(shù)本身技術(shù)優(yōu)點(diǎn)和臨床應(yīng)用的潛在價(jià)值，使得國(guó)內(nèi)外眾多科技專家專注于生物芯片檢測(cè)技術(shù)在傳染病學(xué)中的研究。例如，美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校DeRisi實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的能檢測(cè)多種病毒的Virochip芯片，美國(guó)哥倫比亞大學(xué)Lipkin實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的能同時(shí)檢測(cè)多種病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲的GreeneChip芯片等。生物芯片探針設(shè)計(jì)的目的在于:經(jīng)過計(jì)算方法優(yōu)化后的探針能夠在檢測(cè)到更多的生物分子的同時(shí)，保證有較高的檢測(cè)可靠性，即同時(shí)兼顧覆蓋率和準(zhǔn)確率兩個(gè)方面，對(duì)于高通量的病原體檢測(cè)這一點(diǎn)是至關(guān)重要的。通常的做法是首先查詢?nèi)鏓MBL和GenBank等國(guó)際公共數(shù)據(jù)庫，取得相應(yīng)的DNA序列數(shù)據(jù)作為生物芯片探針設(shè)計(jì)的參照目標(biāo)序列，然后從中選擇特異性很高的核苷酸片段來設(shè)計(jì)探針。特異性是指目標(biāo)物種和非目標(biāo)物種間的存在的差異，是檢測(cè)型生物芯片鑒別物種的核心依據(jù)。特異性探針的選擇是探針設(shè)計(jì)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，探針優(yōu)化設(shè)計(jì)算法研究已成為檢測(cè)型基因芯片信息處理中一個(gè)急需解決的問題。對(duì)于小規(guī)模物種的鑒別，主要是通過序列比對(duì)的結(jié)果依靠人工分析選擇，但是隨著對(duì)單個(gè)芯片檢測(cè)物種數(shù)量需求的快速增加，待分析的序列越來越多，再加上探針設(shè)計(jì)還要考慮很多其他方面的復(fù)雜因素，人工設(shè)計(jì)不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且質(zhì)量難以保證，因此計(jì)算方法在探針設(shè)計(jì)方面得到了廣泛的應(yīng)用。Waibhav提出了一套從病原體全基因組序列出發(fā)的探針設(shè)計(jì)流程，Satya在此流程基礎(chǔ)之上又進(jìn)行了改進(jìn)，除了有效地減少了計(jì)算時(shí)間以外，還使用了多套度量探針專一性的判據(jù)對(duì)探針質(zhì)量進(jìn)行了理論評(píng)估。Jabado等人進(jìn)行了針對(duì)于病毒檢測(cè)芯片的探針設(shè)計(jì)工作，他們認(rèn)為在序列保守性分析方面，使用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)比對(duì)相較于核酸序列之間的比對(duì)更有優(yōu)勢(shì)，因此他們提出了基于一套從病毒蛋白質(zhì)序列出發(fā)的探針設(shè)計(jì)流程。為了兼顧對(duì)探針高覆蓋率的要求，還補(bǔ)充了一些以非編碼區(qū)域?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)出來的探針。綜上所述，目前的生物芯片探針設(shè)計(jì)方法，更加科學(xué)、合理，所設(shè)計(jì)出的探針有著比較好的覆蓋率和準(zhǔn)確率，能夠滿足高通量檢測(cè)的需求。但是這些設(shè)計(jì)方法也存在著兩方面的主要不足:1)計(jì)算耗時(shí)，設(shè)計(jì)效率較低。以Satya等人的TOF1-beta流程為例，在74個(gè)CPU上設(shè)計(jì)一個(gè)物種Brucella melitensis的檢測(cè)探針,就需要21個(gè)小時(shí)；2)很多的探針設(shè)計(jì)流程，由于序列資源的限制，只能在屬的層次上得到滿足條件檢測(cè)探針，難以做到更加精細(xì)的檢測(cè)。隨著序列資源的不斷豐富，檢測(cè)種或者亞種層次上的病原體都將成為可能，而現(xiàn)有的設(shè)計(jì)流程都缺少一個(gè)動(dòng)態(tài)的數(shù)據(jù)管理更新系統(tǒng)，不能做到與快速增長(zhǎng)的序列數(shù)據(jù)庫做到同步更新
發(fā)明內(nèi)容
生物芯片是在現(xiàn)代分子生物學(xué)高通量技術(shù)的基礎(chǔ)之上，建立起來的可用于病原體診斷檢測(cè)方法。隨著序列資源的不斷豐富，檢測(cè)屬、種甚至于亞種層次上的病原體都將成為可能，各大醫(yī)療和公共衛(wèi)生機(jī)構(gòu)對(duì)單個(gè)芯片檢測(cè)物種數(shù)量需求也相應(yīng)地在快速增加。傳統(tǒng)的探針設(shè)計(jì)方法主要集中于對(duì)小規(guī)模物種的鑒別，主要是通過序列比對(duì)的結(jié)果依靠人工分析選擇，設(shè)計(jì)效率較低，且質(zhì)量不高。本發(fā)明在整合了國(guó)際上最先進(jìn)的探針設(shè)計(jì)方法的基礎(chǔ)之上，進(jìn)行了有針對(duì)性的改進(jìn)。對(duì)于細(xì)菌、病毒、真菌等不同類型的病原體，采用了不同的序列模板進(jìn)行探針設(shè)計(jì)。在設(shè)計(jì)流程中，充分考慮了病原體序列的情況，盡量在從屬到種再到亞種，越來越精細(xì)的層次上設(shè)計(jì)檢測(cè)探針。同時(shí)兼顧了探針的覆蓋率和準(zhǔn)確率，這對(duì)于高通量的病原體檢測(cè)是非常重要的。


圖1是針對(duì)檢測(cè)對(duì)象為細(xì)菌、真菌以及原生動(dòng)物三類病原體的，以rRNA為模板的探針設(shè)計(jì)流程。圖2是針對(duì)檢測(cè)對(duì)象為病毒，以結(jié)構(gòu)蛋白編碼序列為模板的探針設(shè)計(jì)流程。圖3為細(xì)菌Brevibacterium epidermidis中四條序列進(jìn)行多序列比對(duì)后的片段圖4是從進(jìn)化樹的分支上尋找細(xì)菌Brevibacterium epidermidis最近鄰菌種的示意圖
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)例及附圖對(duì)本方法作進(jìn)一步說明。一、針對(duì)細(xì)菌、真菌以及原生動(dòng)物的以rRNA為模板的設(shè)計(jì)流程我們將細(xì)菌Brevibacterium epidermidis作為目標(biāo)物種，并以它為例介紹圖1所示的探針設(shè)計(jì)流程。首先,從Ribosomal Database Project (RDP)數(shù)據(jù)庫里得到目標(biāo)物種的16S rRNA序列。根據(jù)這些16S rRNA序列，進(jìn)行序列比對(duì)，從GenBank中抽提出該物種更多的16S rRNA序列，同時(shí)對(duì)序列的種屬描述信息進(jìn)行校正，確保為目標(biāo)物種的16S rRNA序列。對(duì)目標(biāo)物種的多條16SrRNA進(jìn)行多序列比對(duì)，抽提出種內(nèi)保守的序列區(qū)域。圖3所示為其中的一段保守序列片段。通過系統(tǒng)發(fā)生分析，對(duì)所研究額全部細(xì)菌菌種的代表性序列構(gòu)建進(jìn)化樹，從進(jìn)化樹的分支中可以找到目標(biāo)物種的最近鄰物種，如圖4所示，細(xì)菌Brevibacteriumepidermidis的最近鄰菌種為Kineosporia aurantiaca。將兩個(gè)菌種進(jìn)行序列比對(duì)，得到種間的保守區(qū)。從Brevibacterium epidermidis的種內(nèi)保守區(qū)域中去除這部分種間保守區(qū)，即得到了目標(biāo)菌種的特異性區(qū)域，作為備選序列進(jìn)行下一步的探針設(shè)計(jì)。根據(jù)如下的幾類實(shí)驗(yàn)條件，包括探針長(zhǎng)度為60mer，所有探針的理論融解溫度在2度內(nèi)波動(dòng)，GC含量在30% -70%的范圍內(nèi)等等，從備選序列中抽提出滿足條件的備選探針集合。構(gòu)建將脊椎動(dòng)物序列和相應(yīng)的病原體序列整合到一起的非目標(biāo)物種序列庫，通過Blastn對(duì)備選探針進(jìn)行同源性檢測(cè)。我們?cè)O(shè)置的特異性標(biāo)準(zhǔn)是備選探針對(duì)于非目標(biāo)物種基因的連續(xù)互補(bǔ)片段長(zhǎng)度小于15bp，總的互補(bǔ)長(zhǎng)度應(yīng)小于75%。通過篩選，去除掉可能與非目標(biāo)物種序列產(chǎn)生交叉雜交的結(jié)果，得到高專一性的探針。
二、針對(duì)病毒以蛋白質(zhì)編碼序列為模板的設(shè)計(jì)流程圖2所示的探針設(shè)計(jì)流程為針對(duì)病毒的，并以蛋白質(zhì)編碼序列為模板的設(shè)計(jì)流程。首先，從European Molecular Biology Laboratory(EMBL)數(shù)據(jù)庫中下載病毒序列標(biāo)準(zhǔn)文件。從中抽提整理屬于目標(biāo)病毒的序列，根據(jù)序列文件提供的信息，進(jìn)一步抽提出編碼結(jié)構(gòu)蛋白的核酸序列以及所編碼的蛋白質(zhì)序列。將這些蛋白質(zhì)序列與Pfam proteinfamilies database中的種子序列進(jìn)行比對(duì)，得到保守的序列區(qū)域，將其對(duì)應(yīng)的核酸編碼區(qū)作為下一步設(shè)計(jì)的備選序列。對(duì)于那些不能夠通過與Pfam數(shù)據(jù)庫比對(duì)得到保守區(qū)的序列，直接將它們的核酸編碼區(qū)進(jìn)行序列比對(duì)、聚類，得到保守區(qū)域，作為備選序列的另一個(gè)來源。從備選序列出發(fā)設(shè)計(jì)探針的步驟與以rRNA為模板的設(shè)計(jì)流程中后面的步驟是是一致的。
權(quán)利要求
1.一種針對(duì)細(xì)菌、真菌以及原生動(dòng)物三類病原體的探針，其特征是一種基于16SrRNA或18S rRNA序列模板的設(shè)計(jì)方法為基礎(chǔ)的探針，包括:從RibosomalDatabaseProject(RDP)數(shù)據(jù)庫里得到目標(biāo)物種的rRNA序列，抽提出物種內(nèi)部的保守的序列區(qū)域； (1)通過系統(tǒng)發(fā)生分析，對(duì)多個(gè)物種的代表性序列構(gòu)建進(jìn)化樹，從進(jìn)化樹的分支中找到目標(biāo)物種的最近鄰物種； (2)將兩個(gè)物種進(jìn)行序列比對(duì)得到種間的保守區(qū)； (3)從目標(biāo)物種的種內(nèi)保守區(qū)域中去除這部分種間保守區(qū)，得到目標(biāo)物種的特異性區(qū)域，作為備選序列； (4)針對(duì)該備選序列進(jìn)行探針設(shè)計(jì)，對(duì)得到的備選探針進(jìn)行特異性評(píng)估，去除那些可能產(chǎn)生交叉雜交的低質(zhì)量探針。
2.一種針對(duì)病毒的探針，其特征是一種基于結(jié)構(gòu)蛋白編碼序列的設(shè)計(jì)方法為基礎(chǔ)的探針，通過蛋白-蛋白比對(duì)獲取保守區(qū)域的信息，包括: (1)從EMBL數(shù)據(jù)庫中下載病毒序列標(biāo)準(zhǔn)文件，從中抽提出編碼結(jié)構(gòu)蛋白的核酸序列以及相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列； (2)將這些蛋白質(zhì)序列與Pfam數(shù)據(jù)庫中的種子序列進(jìn)行比對(duì)，得到保守的序列區(qū)域，將與其對(duì)應(yīng)的核酸編碼區(qū)作為下一步設(shè)計(jì)的備選序列； (3)按照權(quán)利要求1中所述的步驟(4)，進(jìn)行后續(xù)的探針設(shè)計(jì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物芯片的探針設(shè)計(jì)方法，尤其是設(shè)計(jì)出用于對(duì)以脊椎動(dòng)物為宿主的病毒、細(xì)菌、真菌等病原體進(jìn)行高通量檢測(cè)的探針。本發(fā)明提供的方法，包括1)針對(duì)檢測(cè)對(duì)象為細(xì)菌、真菌以及原生動(dòng)物三類病原體的，以rRNA為模板的探針設(shè)計(jì)方法；2)針對(duì)檢測(cè)對(duì)象為病毒，以結(jié)構(gòu)蛋白編碼序列為模板的探針設(shè)計(jì)方法。
文檔編號(hào)G06F19/20GK103093120SQ20111034875
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2011年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月8日
發(fā)明者張?chǎng)卫? 蔣小云, 肖琛 申請(qǐng)人:北京健數(shù)通生物計(jì)算技術(shù)有限公司