一種基于多探針富集56基因靶區(qū)域的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于多探針富集56基因靶區(qū)域的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在過去的數(shù)年里，對NSCLC(非小細(xì)胞肺癌）的生物學(xué)認(rèn)知取得進(jìn)步促使可以識別 出對于惡性腫瘤轉(zhuǎn)化和癌細(xì)胞生存至關(guān)重要的一些分子事件并形成了潛在治療靶點(diǎn)。近年 來，關(guān)于針對非小細(xì)胞肺癌的靶向治療藥物進(jìn)展迅速，已獲FDA批準(zhǔn)的有EGFR小分子抑制 劑吉非替尼，厄洛替尼，ALK小分子抑制劑克唑替尼，色瑞替尼等。值得注意的是，這些靶向 治療藥物都只針對攜帶某些特定基因變異的人群有效。如攜帶EGFRL858R或19號外顯子 缺失性突變的非小細(xì)胞肺癌患者對第一代EGFR小分子抑制劑敏感。而攜帶ALK融合的非 小細(xì)胞肺癌患者則對ALK小分子抑制劑敏感。因此，隨著祀向治療藥物的推廣，與之配合的 伴隨分子診斷變得必不可少。2015年美國癌癥聯(lián)盟（NCCN)指南中建議對非小細(xì)胞肺癌患 者檢測七項(xiàng)與靶向藥物相關(guān)的基因變異：EGFR突變，ALK融合，MET擴(kuò)增，ERBB2突變，BRAF 突變，ROS1突變，以及RET突變。
[0003] 早期分子診斷采用多種技術(shù)平臺，如定量PCR，F(xiàn)ISH，免疫組化等，一次檢測一種 或幾種基因變異，對同一患者采用順位檢測的方法。傳統(tǒng)方法的局限性在于，由于每次檢 測僅限于一種基因，所需的活檢組織量隨檢測基因數(shù)的增長而增加。在可預(yù)見的未來，將 難以滿足檢測所有靶標(biāo)基因的需求。與此同時，近期有研宄表明，肺癌中的重要靶點(diǎn)基因 變異并非完全互斥，而是在一小部分患者中并存。Wuetal.的研宄顯示，中國非小細(xì)胞 肺癌患者中有1. 3 %同時攜帶EGFR突變與ALK融合（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/24443562)。對于這些患者，對于分子靶點(diǎn)基因變異順序檢測的方法會引起某些基 因變異事件的漏檢，從而使醫(yī)生對該患者最適宜的靶向治療方法產(chǎn)生可能的誤判。而基于 目標(biāo)區(qū)域捕獲的DNA二代測序法可以一次性平行檢測幾十，乃至上百種基因中包括點(diǎn)突 變，插入缺失，DNA拷貝數(shù)改變，融合重排等多種變異形式，從而一次性檢出所有與靶向治療 相關(guān)的靶點(diǎn)基因變異，并對于同時并存的基因變異的突變豐度進(jìn)行估算與排序。因此為突 破傳統(tǒng)分子診斷方法的局限提供了新的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明旨在提供一種多探針富集56基因靶區(qū)域的方法，通 過設(shè)計(jì)專用的捕獲探針庫，采用探針捕獲技術(shù)一次性富集多個基因多靶點(diǎn)序列，從而實(shí)現(xiàn) 多基因多靶點(diǎn)并行深度高通量測序。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 一種基于多探針富集56基因靶區(qū)域的方法，包括如下步驟：
[0007] SIgDNA片段化和加接頭adaptor
[0008] 1. 1)準(zhǔn)備所需試劑如下：
[0009]SureSelectQXT終止反應(yīng)液、SureSelectQXT緩沖液、SureSelectQXT轉(zhuǎn)座酶溶 液、二甲基亞砜（DMSO)、AMPureXP磁珠、乙醇；
[0010] 1. 2)定量待建庫樣本，調(diào)整濃度至25ng/yL，體積2yL;
[0011] 1. 3)PCR儀設(shè)置DNA片段化程序，設(shè)好程序后，點(diǎn)擊開啟，再立即點(diǎn)擊暫停；
[0012] 1. 4)SureSelectQXT緩沖液和SureSelectQXT轉(zhuǎn)座酶溶液分別高速渦旋混勻備 用；
[0013] 1. 5)將SureSelectQXT緩沖液、樣本和SureSelectQXT轉(zhuǎn)座酶溶液依次添加到 PCR管中，于冰上操作配制片段化反應(yīng)體系，每種試劑單獨(dú)添加；配制完成后，短暫離心，再 高速渦旋充分混勻20s，并再次短暫離心，完成后立即將PCR管放置于步驟1. 3)中暫停的 PCR儀上，重新啟動反應(yīng)程序；
[0014] 1.6)?〇?完成后，立即將其轉(zhuǎn)移至冰上；然后往其中加32 1^1乂511代5616(^0乂1'終 止反應(yīng)液，高速渦旋5s，短暫離心，室溫孵育lmin;
[0015] S2AMPureXP磁珠純化
[0016] 2. 1)將AMPureXP磁珠在使用前充分混勻并平衡至室溫；
[0017] 2. 2)將步驟S1中得到的已片段化和加接頭adaptor的樣本轉(zhuǎn)移至新的1. 5mLEP 管中；
[0018] 2. 3)加入52yL充分混勻的AMPureXP磁珠，渦旋5s，短暫離心，保證磁珠沒有沉 底；
[0019] 2. 4)置于混勻儀上室溫孵育5min ;
[0020] 2. 5)孵育好的樣本短暫離心，放磁力架上吸附磁珠，時間為3-5min，棄上清；
[0021] 2. 6)加300yL現(xiàn)配的70%乙醇，計(jì)時lmin，期間沿水平方向緩慢旋轉(zhuǎn)EP管一圈， 令干擾的磁珠下沉，棄上清；
[0022] 2. 7)重復(fù)步驟 2. 6) -次；
[0023] 2.8)短暫離心，將EP管重新放回磁力架靜置30s，使用P10移液器除凈殘留乙醇；
[0024] 2. 9) 37°C烘干磁珠，時間為l_3min，或置于通風(fēng)廚l-3min使磁珠干燥；干燥完成 后，加36yL不含核酸酶的水，渦旋混勻，短暫離心；
[0025] 2. 10)室溫孵育2min，放置磁力架上，取一定量上清至新的PCR管中，即得到純化 樣本并放置冰上；
[0026] S3 捕獲前PCR
[0027] 3. 1)所需試劑如下：
[0028] HerculaseIIFusionDNA聚合酶、5XHerculaseII反應(yīng)緩沖液、每個三磷酸脫 氧核糖核苷（dNTP)25mM的lOOmMdNTP混合液、SureSelectQXT引物混合物、DMSO、AMPure XP磁珠和乙醇；
[0029] 3. 2)在冰上操作，將5XHerculaseII反應(yīng)緩沖液、每個dNTP25mM的lOOmMdNTP 混合液、DMSO、SureSelectQXT引物混合物、HerculaseIIFusionDNA聚合酶配制捕獲 前PCR反應(yīng)混合液，一次反應(yīng)中各試劑的劑量依次為10yL、0. 5yL、2. 5yL、1yL、1yL和 15yL；
[0030] 3. 3)將步驟3. 2)中制得的捕獲前PCR反應(yīng)混合液加入35yL步驟S2中得到的純 化樣本中，渦旋5s混勻；然后放置于PCR儀上，設(shè)置PCR反應(yīng)程序并啟動；反應(yīng)完畢后得到 捕獲前PCR樣本并放置冰上；
[0031] S4AMPureXP磁珠純化
[0032] 4. 1)將XP磁珠在使用前充分混勻并平衡至室溫；
[0033] 4. 2)將步驟S3得到捕獲前PCR樣本轉(zhuǎn)移至新的1. 5mLEP管中；
[0034] 4. 3)按照步驟2. 3)-2. 10)進(jìn)行操作；完成后即得到預(yù)文庫；
[0035] S5將步驟S4得到預(yù)文庫進(jìn)行質(zhì)量檢測和濃度檢測，包括預(yù)文庫DNA的片段大小是 否主要分布在245-325bp、以及DNA濃度是否滿足彡500ng;
[0036] S6預(yù)文庫DNA的準(zhǔn)備
[0037] 6. 1)取一定量的通過步驟S5檢測的預(yù)文庫至新PCR管中；
[0038] 6. 2)將步驟6. 1)中的樣本PCR管放入濃縮儀中進(jìn)行濃縮蒸干；
[0039] 6. 3)加入12yL不含核酸酶的水進(jìn)行溶解，得到12yL預(yù)文庫DNA;
[0040] S7 雜交
[0041] 7. 1)準(zhǔn)備所需試劑如下：
[0042] SureSelectQXT快速雜交緩沖液、SureSelectQXT快速封閉液、SureSelect RNase封閉劑、捕獲探針庫；
[0043] 需要說明的是，所述捕獲探針庫中的探針主要根據(jù)NCCN(美國國立綜合癌癥網(wǎng) 絡(luò)）關(guān)于非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)、乳腺癌（breastcancer)、直腸癌（coloncancer)、甲狀 腺癌（thyroidcancer)、腎細(xì)胞癌（renalcellcarcinoma)、胃癌（gastriccancer)and 原始神經(jīng)外胚層腫瘤（PNET)的指導(dǎo)、現(xiàn)已公開的癌癥基因（包括PMID:24071851、PMID: 23945592、PMID:24657537、PMID:24132290、PMID:25656898)、TGGA數(shù)據(jù)庫所公開的內(nèi) 容（包括乳頭狀甲狀腺癌：PMID:25417114、腎細(xì)胞癌：PMID:25155756,PMID:23792563、 胃癌：PMID:25079317、肺腺癌：PMID:25079552、乳腺癌：PMID:23000897、肺鱗狀細(xì)胞癌： PMID:22960745和結(jié)腸癌：PMID:22810696)進(jìn)行選取設(shè)計(jì)的。
[0044] 7. 2)分兩管配制混合液，記為A管和B管，A管中，用12yL步驟S6得到的預(yù)文庫 DNA和5yL的SureSelectQXT快速封閉液配制混合液，用移液器上下吹打8-10次，渦旋 5s混勻，短暫離心；B管中配制捕獲庫雜交混合液，渦旋5s混勻，放置室溫備用；
[0045] 7. 3)PCR儀上設(shè)置反應(yīng)程序，體積設(shè)置為30yL;
[0046] 7.4)將A管轉(zhuǎn)移至PCR儀上，啟動運(yùn)行，在運(yùn)行一段時間暫停運(yùn)行；
[0047] 7. 5)在PCR儀上，將B管中的捕獲庫雜交混合液轉(zhuǎn)移至A管中，用移液器上下吹打 8-10次，然后密封好，渦旋5s，快速離心后放回PCR儀上繼續(xù)雜交反應(yīng)程序，反應(yīng)完畢后得 到雜交樣本；
[0048] S8T1磁珠捕獲
[0049] 8. 1)準(zhǔn)備所需試劑如下：
[0050] SureSelect結(jié)合緩沖液、SureSelect洗液 2、SureSelect洗液l、DynabeadsMyOne 鏈霉素T1磁珠；
[0051] 8. 2)將DynabeadsMyOne鏈霉素T1磁珠渦旋混勻后，取50yL至新的1. 5mLEP 管中，置于磁力架上靜置幾分鐘，待澄清后棄上清；
[0052] 8. 3)向步驟8. 2)已加入T1磁珠的EP管中加入200yLSureSelect結(jié)合緩沖液， 移液器上下吹打10次，放置于磁力架上靜置，待澄清后棄上清；
[0053] 8. 4)重復(fù)步驟8. 3)兩次；