專利名稱：奶山羊scd基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及以奶山羊的功能基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP) 作為分子遺傳標(biāo)記，特別涉及一種奶山羊SCD基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測方法。
背景技術(shù)：
奶山羊是我國的主要的畜牧之一，但是現(xiàn)在面臨著優(yōu)秀奶山羊品種種源不足和種 群遺傳品質(zhì)較差的壓力。傳統(tǒng)的育種方法應(yīng)用測試動物的表現(xiàn)型和其親代、祖代及其它親 屬在小的動物模型中的遺傳信息，設(shè)想性狀受到許多基因遺傳差異的影響，每個基因?qū)π?狀有相對較小的貢獻(xiàn)，因此對性狀的估計不可避免有些偏差。分子遺傳標(biāo)記是近年來現(xiàn)代 遺傳學(xué)發(fā)展最快的領(lǐng)域之一，新的方法正在不斷涌現(xiàn)，已定位的標(biāo)記基因數(shù)目與日倶增。這 將為數(shù)量遺傳學(xué)提供分子水平信息，家畜育種也將跨入分子育種階段。應(yīng)用分子遺傳標(biāo)記 的現(xiàn)代育種技術(shù)是加快良種選育和提高種群遺傳品質(zhì)，從而增加奶山羊的產(chǎn)奶量和改善乳 品質(zhì)的先進(jìn)的有效的方法。 分子遺傳標(biāo)記輔助選擇就是將現(xiàn)代生物技術(shù)與常規(guī)選擇方法相結(jié)合，通過對遺傳 標(biāo)記的選擇來間接選擇控制某性狀的數(shù)量性狀位點(QTL)，使之能夠同時利用標(biāo)記位點信 息和數(shù)量性狀的表型信息，更準(zhǔn)確估計動物個體的育種值，提高選擇效率，加快育種進(jìn)展。 標(biāo)記輔助選擇主要經(jīng)歷了三個階段第一階段是家畜各性狀間的遺傳分析；第二階段是蛋 白質(zhì)(酶)標(biāo)記對數(shù)量性狀的標(biāo)記階段；第三個階段是分子遺傳標(biāo)記階段。隨著分子標(biāo)記 技術(shù)日漸成熟與豐富，使覆蓋整個基因組的標(biāo)記成為可能，通過與QTL間的連鎖分析，實現(xiàn) 分子標(biāo)記輔助選擇的目標(biāo)。 單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)作為新的遺傳標(biāo)記已 廣泛應(yīng)用于基因定位、克隆、遺傳育種及多樣性的研究。SNP是基因組中存在的一種數(shù)量非 常豐富的變異形式，占人類基因組中遺傳多態(tài)性的90%以上。SNP與罕見的變異不同，通常 在種群中頻率等于或小于1%的此種變異被稱為突變，而只有頻率大于1%時才被稱為單 核苷酸多態(tài)性。 目前，主要采用幾種不同的方法來發(fā)現(xiàn)SNPs :DNA序列測定方法、PCR-SSCP與DNA 測序結(jié)合法、AS-PCR方法、PCR-RFLP法、TaqMam技術(shù)與分子信標(biāo)(Molecular Beacons)等。 在這些SNP檢測技術(shù)中，(l)DNA序列測定法是最為準(zhǔn)確的SNP檢測方法，但是，其檢測費用 極其昂貴，且需要有DNA測序儀等大型儀器，同時，在測序過程中需要非常熟練的技術(shù)人員 和經(jīng)驗，所以，DNA序列測定法不是一種應(yīng)用于生產(chǎn)實際的理想SNP檢測方法；(2)PCR-SSCP 與DNA測序結(jié)合法檢測SNP可以適當(dāng)降低檢測費用，但是，PCR-SSCP的實驗過程比較長，操 作比較繁瑣，且實驗過程中存在假陽性問題，所以，也并非理想的SNP檢測手段；(3)AS-PCR 方法作為一種新型的SNP檢測方法，在未來的應(yīng)用領(lǐng)域中具有非常廣闊的前景，但是，該 方法需要設(shè)計特別的引物，且只能針對特定的基因位點，同時，檢測過程中還存在誤檢的概 率，因此，目前不具有普遍應(yīng)用的特點；(4)TaqMam技術(shù)與分子信標(biāo)(Molecular Beacons) 都是在熒光能量轉(zhuǎn)移(FluorescenceResornance Energ Transfer, FRET)基礎(chǔ)上建立起來
3的，利用熒光標(biāo)記及儀器達(dá)到檢測目的。焦磷酸測序(Pyrosequencing)則是利用測序過程 中可釋放的焦磷酸和酶類產(chǎn)生熒光，是不依賴平板膠或毛細(xì)管電泳、不依賴DNA的熒光標(biāo) 記技術(shù)，很可能成為未來的主流技術(shù)。(5) RFLP-PCR方法是一種檢測SNP的有效技術(shù)，在發(fā) 現(xiàn)SNP位點后引入限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割，然后進(jìn)行瓊脂糖、聚丙烯凝膠電泳分析，就能準(zhǔn) 確地鑒別SNP位點。RFLP-PCR方法不僅具有DNA測序法的準(zhǔn)確性，又克服了費用昂貴、繁瑣 操作、假陽性的缺點，而且所檢測的序列位點無特殊性要求。 硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)是酯酰去飽和酶超家族的成員，控制飽和脂肪酸向 不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶的含鐵關(guān)鍵酶。它存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，可在與輔酶A相結(jié)合的飽 和脂肪酸烴鏈(棕櫚酰和硬脂酰)的A9位引入雙鍵形成單不飽和脂肪酸(棕櫚油酰和硬 脂油酰)。哺乳動物的硬脂酰輔酶A去飽和酶主要存在于乳腺和肝臟中。通過硬脂酰輔酶 A去飽和酶催化形成的單不飽和脂肪酸可以轉(zhuǎn)換為生物膜上的磷脂、甘油三酯和膽固醇。
不飽和脂肪酸不僅是細(xì)胞膜組成的關(guān)鍵成分，也參與能量代謝，細(xì)胞生長和分化， 細(xì)胞凋亡，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程，因此硬脂酰輔酶A去飽和酶的作用至關(guān)重要。研究表明，生物 膜上飽和與不飽和脂肪酸的比例直接影響細(xì)胞膜的流動性，并且硬脂酸向油酸轉(zhuǎn)化速率的 變化與很多疾病的發(fā)生相關(guān)，如癌癥，神經(jīng)性疾病，糖尿病，肥胖，免疫混亂，心血管病等。
在反芻動物中，油酸是脂肪組織和乳中主要的不飽和脂肪酸，有研究表明奶牛乳 中78X的共軛亞油酸是有硬脂酰輔酶A去飽和酶的催化形成的。為此，SCD基因遺傳變異 或SNP位點在動物生產(chǎn)實踐中對泌乳性狀、生長發(fā)育性狀具有重要的作用。
關(guān)于動物SCD基因遺傳變異的研究國內(nèi)外多見于鼠、牛等動物，而少見奶山羊SCD 基因遺傳變異或SNP研究的報道。由于目前中國奶山羊SCD基因遺傳變異領(lǐng)域的研究匱乏， 使該基因位點的功能研究及該基因遺傳變異與經(jīng)濟(jì)性狀(如泌乳、生長發(fā)育等性狀)關(guān)聯(lián) 的研究成為空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于一種奶山羊SCD基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測方法，尋 找與奶山羊經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的SNP作為分子標(biāo)記，加快奶山羊良種繁育速度。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn) —種奶山羊SCD基因的單核苷酸多態(tài)性，其基因單核苷酸多態(tài)性包括
奶山羊SCD基因第5001位為G或A的單核苷酸多態(tài)性。
上述奶山羊SCD基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法為 以包含SCD基因的待測奶山羊全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增 奶山羊SCD基因；用限制性內(nèi)切酶NdeI消化PCR擴增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴增片段進(jìn) 行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)電泳結(jié)果鑒定奶山羊SCD基因第5001位的單核苷酸多態(tài)性；
所述的引物對P為 上游弓l物Pl :cctggcagtg ttattctacc at 22bp ;
下游弓l物P2 :ctcctacttg cctctgc 17bp。
所述的PCR擴增反應(yīng)程序為 94。C預(yù)變性5min ;94。C變性30s，58。C退火30s，72。C延伸30s，35個循環(huán)；72。C延 伸10min。
4
所述的瓊脂糖凝膠電泳為質(zhì)量濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳。 所述的根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)SCD基因第5001位的堿基多態(tài)性為GG型表現(xiàn)
345bp ;GA型表現(xiàn)345bp， 321bp， 24bp ;AA型表現(xiàn):321bp和24bp。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果 本發(fā)明公開了與奶山羊泌乳性相關(guān)的功能基因SCD的核苷酸多態(tài)性，該核苷酸多 態(tài)性能夠作為一個分子遺傳標(biāo)記，利用標(biāo)記位點信息和數(shù)量性狀的表型信息，更準(zhǔn)確估計 動物個體的育種值，提高選擇效率，加快育種進(jìn)展。 針對上述SCD基因的SNP多態(tài)性，本發(fā)明還公開了其檢測方法，通過設(shè)計特定的 PCR引物擴增片段，能夠用ACRS方法(擴增引入限制性酶切位點)簡單、快速、成本低、精確 的檢測其單核苷酸的多態(tài)性。 本發(fā)明對SCD基因的SNP進(jìn)行了基因分型和基因頻率分析，以及與薩能奶山羊體 尺性狀之間進(jìn)行了性狀關(guān)聯(lián)分析；結(jié)果顯示SCD基因的核苷酸多態(tài)位點能夠成為分子遺傳 輔助育種的標(biāo)記。 由于SCD基因功能主要涉及不同泌乳期產(chǎn)奶量這個經(jīng)濟(jì)性狀，本發(fā)明提供的檢測 方法為SCD基因的SNP與體尺性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國奶山羊乳用經(jīng)濟(jì) 性狀的標(biāo)記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的奶山羊種群。


圖1為奶山羊血樣基因組DNA電泳檢測圖； 圖2為奶山羊SCD基因第5外顯子及側(cè)翼區(qū)362bp克隆測序PCR產(chǎn)物電泳圖；
圖3為引入酶切位點的設(shè)計與基因克隆PCR引物的對比圖；
圖4為奶山羊SCD基因ACRS-PCR擴增的345bp片段的電泳圖；
圖5為奶山羊SCD基因第5外顯子及側(cè)翼區(qū)345bp PCR產(chǎn)物的Ndel酶切電泳檢 測SCD基因多態(tài)性的電泳結(jié)果圖；泳道1，3 :GG基因型個體(345bp);泳道2、5 :GA基因型個 體(345bp，321bp，24bp);泳道4 :AA基因型個體(321bp，24bp) ;M :Marker (2000bp， 1000bp， 750bp，500bp，200bp)另外，由于24bp較小，故在瓊脂糖電泳分析中不可見，但345bp和 321bp片段能鑒別GA型和AA型； 圖6為奶山羊SCD基因SNP的不同基因型測序峰圖。
具體實施例方式
本發(fā)明以SCD基因保守序列設(shè)計引物擴增SCD基因第5外顯子及側(cè)翼區(qū)362bp片
段，分別以2種奶山羊品種的基因組為模板，進(jìn)行PCR擴增，并對PCR產(chǎn)物純化，經(jīng)測序后尋
找該擴增片段的單核苷酸多態(tài)；針對發(fā)現(xiàn)的單核苷酸多態(tài)進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)性分析，并提供其
檢測方法，使得SCD基因的核苷酸多態(tài)性成為一種能夠快速、方便檢測的分子遺傳標(biāo)記，為
加快建立具有優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)性狀的奶山羊種群提供依據(jù)。 a、奶山羊SCD基因部分DNA序列的克隆及其多態(tài)性的檢測 1、奶山羊血樣的采集及處理 取奶山羊血樣10mL，加入0. 5mol/L的EDTA 500 y L抗凝，緩慢顛倒3次后放入冰 盒，-8(TC保存?zhèn)溆谩?br> 5
本發(fā)明采用了 2個奶山羊品種，具體如表1所示。 表l奶山羊樣品來源表
品種樣品樣品名稱樣品來源采樣方式采樣時間
西農(nóng)薩能奶山羊(SN)268血樣陜西千陽西農(nóng)薩能奶 山羊種羊場核心群隨機采樣2008.7-9月
關(guān)中奶山羊(GZ)440血樣陜西三原縣良種奶山 羊繁育中心隨機采樣2008. 7-9月 2、血樣基因組DNA的提取、純化 (1)將冷凍血樣室溫解凍，轉(zhuǎn)移500 ii L至1. 5mL E卯endorf管，加入等體積PBS緩 沖液，充分混勻，12000r/min離心10min(4°C )，棄去上清液，重復(fù)上述步驟至上清液透明、 沉淀呈淡黃色。 (2)在離心管中加入DNA抽提緩沖液500 y L，搖動，使血細(xì)胞沉淀脫離離心管管 壁，37。C水浴lh。 DNA抽提緩沖液的配制0. 6057g的Tris、18. 612g的EDTA和2. 5g的SDS 加超純水500mL，滅菌、調(diào)pH至8. 0， 4"保存?zhèn)溆谩?(3)加蛋白酶K 3iiL(20mg/mL)并混勻，55°C過夜至澄清，尚未澄清者，可補加 1 P L蛋白酶K混勻繼續(xù)消化至澄清。 (4)將反應(yīng)液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500ii L，溫和搖動離心管20min，使其充 分混勻；4°C， 12000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一 1. 5mL離心管中，重復(fù)一次。 [OO46] (5)加氯仿500 ii L，充分混勻20min， 4°C ， 12000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另 一 1. 5mL離心管中。 (6)加0. 1倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無水乙醇，混合轉(zhuǎn)動離心管 直至白色的絮狀沉淀析出，-2(TC保存30 60min。 (7)4。C，12000r/min離心10min，棄去上清液，用70 %的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2 次。 (8) 4°C ， 12000r/min離心10min，棄去上清液，室溫下使乙醇揮發(fā)干凈。 (9)干燥后的DNA溶于80 100 y L的TE_緩沖液或超純水，4。C保存直至DNA完
全溶解，O. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，-S(TC保存。 (10)500iiL的DNA溶液中加入10% SDS使其終濃度為0. 1X，加入蛋白酶K至終
濃度達(dá)到50 ii g/mL ; (11)5。C保溫10h左右； (12)等體積苯酚、氯仿、異戊醇(25 : 24 : 1)和氯仿分別抽提一次； (13) 12000r/min離心5min分相，吸取上層水相至另一離心管中； (14)加入1/10體積3mol/L醋酸鈉和2倍體積冰冷無水乙醇沉淀DNA ; (15)倒掉液體，70%乙醇洗滌后晾干，加入60 ii L滅菌超純水溶解，4。C待檢測。 3、DNA池的構(gòu)建 (1)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測
選部分DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇DNA樣品條帶均一、無拖尾、無降 解的樣品進(jìn)行DNA池的構(gòu)建。 [OOSO] (2)0D值測定用紫外光光度計測定DNA樣品在260nm、280nm處的0D值。計算DNA含量和0D26。/ 0D28。的比值。如0D26。/0D28。比值小于1. 6，說明樣品中含有較多的蛋白質(zhì)或酚，則應(yīng)進(jìn)行純 化；若比值大于1.8，則應(yīng)該考慮去除RNA純化。
DNA質(zhì)量(ng) = 50X0D26。值X稀釋倍數(shù)
(3)品種DNA池的構(gòu)建 DNA檢測完畢后，取出一定的量稀釋至50ng/iiL，然后從關(guān)中奶山羊品種50個濃 度為50ng/ ii L DNA樣品中取10 ii L混合構(gòu)建成品種DNA池；
按照同樣的方法也構(gòu)建薩能奶山羊品種DNA池。 奶山羊血樣基因組DNA、組織樣基因組DNA的檢測結(jié)果見圖l，從圖中可以看出奶
山羊基因組DNA的質(zhì)量非常高。 4、克隆測序PCR擴增引物設(shè)計 由于山羊SCD基因的序列至今未知，故從NCBI數(shù)據(jù)庫中(htto:〃www. ncbi. nlm.
nih. gov/)獲得同源動物牛的GenBank登錄號為NC_007327的SCD基因DNA序列，以該基
因序列保守區(qū)序列為參考利用Primer 5. 0設(shè)計山羊SCD基因第5外顯子及側(cè)翼區(qū)362bp
片段的PCR引物對，其引物對序列如下 上游弓l物gcctgccctg tcttatc 17; 下游弓l物ctcctacttg cctctgc 17。 5、PCR克隆奶山羊SCD基因 分別以2個奶山羊品種的DNA池為模版，用設(shè)計的克隆測序引物進(jìn)行PCR擴增， PCR總反應(yīng)體系為25 ii L，見表2 ;PCR總反應(yīng)程序，見表3。
表2PCR反應(yīng)體系
體系成分體積(u L)
IOXPCR緩沖液(MBI)2. 5
MgCl2 (25mmol/L)1. 5
dNTPs (2. 5mmol/L)2. 5
上游引物(lOpmol/L)0. 25
下游引物(lOpmol/L)0. 25
T叫DNA聚合酶(0. 5U/ u L)2. 0
DNA模板(50ng/ u L)1. 0
7體系成分體積(u L)
滅菌超純水(H20)15. 0
總體積25. 0 表3PCR反應(yīng)程序
克隆測序PCR程序ACRS-PCR程序循環(huán)次數(shù)
95 'C預(yù)變性5 min95 'C預(yù)變性5 min
94 。C變性30 s94 "C變性30 s、 一30-35個循環(huán)
57 'C退火30 s58 "C退火30 s72 'C延伸30 s72 "C延伸30 s72 'C延伸10 min72 。C延伸10 min 6、PCR產(chǎn)物純化和測序 PCR擴增完成之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖2所示，可以清楚看到 362bp的條帶，說明目的基因克隆成功；然后進(jìn)行PCR產(chǎn)物的切膠回收及純化在紫外燈下 從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1. 5mL離心管中，然后用PCR產(chǎn)物回收純化試 劑盒(北京天根生物公司)純化PCR產(chǎn)物，按照試劑盒說明書操作，具體步驟如下
(1)首先向吸附柱中加入500iiL平衡液BL，12000rpm離心l分鐘，倒掉收集管中 的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 (2)將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入干凈的離心管中，稱取重量。
(3)向膠塊中加入等體積溶液PC，6(TC水浴放置10分鐘左右，其間不斷溫和地上 下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。 (4)將上一步所得溶液加入一個吸附柱中，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的 廢液，將吸附柱重新放入收集管中。 (5)向吸附柱中加入700 ii L漂洗液，12000rpm離心1分鐘，倒掉廢液，將吸附柱重 新放入收集管中。 (6)向吸附柱中加入500 ii L漂洗液，12000rpm離心1分鐘，倒掉廢液，將離心吸附 柱放入收集管中，12000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫或5(TC溫箱 數(shù)分鐘，徹底晾干。 (7)將吸附柱放到一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量的洗脫 緩沖液，室溫放置2分鐘。12000rpm離心1分鐘收集DNA溶液。 (8)為了提高DNA的回收量，可將離心得到的溶液重新加回離心吸附柱中，重復(fù)步 驟7。 把以上兩個品種DNA池為模板的PCR純化產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進(jìn)行雙向
測序。奶山羊SCD基因目的片段362bp的測序結(jié)果如SEQ IDNO. 1所示。 對測序峰圖進(jìn)行分析，其中在同一位點有兩個不同峰的是發(fā)生了單核苷酸突變；
8位于奶山羊SCD基因的第5001位(SEQ ID NO. 1第40位)出現(xiàn)了 G、A兩種檢測結(jié)果，即為 篩查到的奶山羊SCD基因的SNP多態(tài)性，該位點是為G或A的堿基多態(tài)性。
b、奶山羊SCD基因G〉A(chǔ)突變多態(tài)性的ACRS-PCR檢測 由于篩查到的堿基多態(tài)性不能被常用的內(nèi)切酶進(jìn)行PCR-RFLP來鑒定，所以需要 利用經(jīng)過重新設(shè)計的ACRS引物(引入酶切位點的引物)來擴增SCD基因。當(dāng)奶山羊的SCD 基因第5001位發(fā)生G > A突變時，即G突變?yōu)锳，利用ACRS引物擴增的SCD基因序列catgtg 也相應(yīng)地變成catatg，從而成為Ndel的限制性內(nèi)切酶識別位點；可直接通過Ndel對目的 片段的酶切進(jìn)行基因分型。 [OO91 ] 1 、 ACRS-PCR引物設(shè)計 針對SEQ ID NO. 1包含的第40位的G > A突變，利用引入酶切位點在線設(shè)計軟件 (htto:〃helix. wustl. edu/dcaDs/dcaos. html)進(jìn)行設(shè)計引物，引入酶切位點的設(shè)計與基 因克隆PCR引物的對比如圖3所示，下游引物保持不變，以包含突變位點的區(qū)段作為引入酶 切位點引物的上游，具體引物引物設(shè)計為
cctggcagtg ttattctacc at 22 ; C為引入錯配的堿基，它與突變型"A"形成NdeI內(nèi)切酶識別序列； 上述引物能夠擴增奶山羊SCD基因外顯子3及側(cè)翼區(qū)的345bp片段，由于上游引
物設(shè)計使得該片段比克隆測序片段少了 17bp。 2 、 ACRS-PCR反應(yīng)條件 PCR產(chǎn)物擴增體系和反應(yīng)條件分別如同表2和表3所述，PCR擴增產(chǎn)物的1. 0%瓊 脂糖凝膠電泳圖譜如圖4所示，可以看到設(shè)計的引物對P能夠擴增345bp的片段。
3、 PCR擴增產(chǎn)物的Ndel酶切 (1) 20 ii L Ndel酶切反應(yīng)體系10 ii L PCR產(chǎn)物，10 X緩沖液(含BSA) 2. 5 3. 0 ii L， Ndel (10U/ ii L)為1. 0 ii L， 8. 0 ii L滅菌純水(H20);
(2)酶切消化條件37t:恒溫培養(yǎng)箱中消化5 10h。
(3)Ndel消化PCR產(chǎn)物后瓊脂糖凝膠電泳分析 用2. 0%的瓊脂糖凝膠，120V電壓電泳1小時，EB染色檢測酶切結(jié)果，用Kodak DC 120凝膠成像分析系統(tǒng)照相分析，并判型、記錄其基因型； 由于ACRS-PCR擴增的345bp片段中不包含其它的Ndel酶切識別位點，當(dāng)SCD基 因第5001位發(fā)生G > A突變時，PCR擴增的SCD基因產(chǎn)物被限制性內(nèi)切酶Ndel識別后，在 ca/tatg對擴增片段酶切，將擴增片段切為2段；而當(dāng)SCD基因第5001位沒有發(fā)生突變，不 能形成新的限制性內(nèi)切酶NdeI酶切識別位點，擴增片段不能被酶切； 由于奶山羊為2倍體動物，所以當(dāng)發(fā)生G〉A(chǔ)的突變時，可形成3種不同的基因型， 分別為GG、 AG、 AA，其ACRS-PCR檢測的凝膠結(jié)果圖如圖5所示 其中，GG基因型為野生型，它的兩條DNA鏈的SNP位點均不能被Ndel酶切，表現(xiàn) 為345bp條帶；發(fā)生突變后的野生型AA的兩條鏈的SNP位點均能被酶切，表現(xiàn)為321bp和 24bp條帶；雜合子GA的兩條鏈中的一條的SNP位點能夠被識別而另一條不能被識別，表現(xiàn) 為345bp，321bp和24bp條帶；由于24bp較小，故在瓊脂糖電泳分析中不可見，但345bp和 321bp片段能鑒別GA型和AA型，根據(jù)條帶的個數(shù)和條帶的大小，如5所示的凝膠電泳檢測 結(jié)果能夠很清楚的判定是否發(fā)生了點突變，將三種基因型區(qū)分開，從而檢測其SNP多態(tài)性。
(4)不同基因型個體PCR產(chǎn)物的測序驗證 利用ABI 377和ABI 3730測序儀對不同基因型個體PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行正反雙向 測序；同時，進(jìn)行SNP位置分析，結(jié)果表明包含345bp、321bp和24bp條帶的雜合子GA基因 型個體其第5001位的測序圖的確表示為G或A，如圖6b所示，自左向右第5個峰為兩個峰； 而CC基因型、GG基因型分別為C、 G，分別如圖6a，圖6c所示。 c、奶山羊的SCD基因第5001位的SNP作為分子標(biāo)記在不同奶山羊群體多態(tài)性中 的應(yīng)用 1、群體多態(tài)性中的診斷 利用上述的SNP多態(tài)性檢測方法對薩能奶山羊268份DNA樣品、關(guān)中奶山羊440 份DNA樣品，分別進(jìn)行SNP多態(tài)性的鑒定；統(tǒng)計其SNP位點的頻率以及與性狀的關(guān)聯(lián)情況。
2、 SNP位點的頻率統(tǒng)計分析 基因型頻率是指一個群體中某一性狀的某種基因型個體數(shù)占總個體數(shù)的比率。PM =NAA/N，其中PAA代表某一位點的AA基因型頻率；NM表示群體中具有AA基因型的個體數(shù)； N為檢測群體的總數(shù)量。 基因頻率是指一個群體中某一基因數(shù)對其等位基因總數(shù)的相對比率。計算的公式
可以寫成:PA = (2NM+NAal+NAa2+......+NAan)/2N。式中，PA表示等位基因A頻率，NM表示群
體中具有AA基因型的個體數(shù)量，N^表示群體中具有Aai基因型個體數(shù)量，al-an為等位基
因A的n個不同的復(fù)等位基因；統(tǒng)計結(jié)果見表4。 表4奶山羊SCD基因第5001位SNP基因頻率分布表
基因型頻率/%總計等位基因頻率/%
奶山羊品種GGGAAAG A
708薩能奶山羊0.9590.04102680.98 0.02
關(guān)中奶山羊0.7820.2160.0024400.89 0.11 從表4可以看出薩能奶山羊和關(guān)中奶山羊的G等位基因頻率遠(yuǎn)高于A等位基因， 這表明等位基因可能G與泌乳性狀相關(guān)。
3、基因效應(yīng)的關(guān)聯(lián)分析 基因型數(shù)據(jù)NdeI識別的基因型(GG、 GA和AA) [O119] 生產(chǎn)數(shù)據(jù)體尺數(shù)據(jù)(體長、體高、胸圍)
關(guān)聯(lián)分析模型 利用SPSS(16. 0)軟件分析基因位點、公畜、場別效應(yīng)、年齡和品種效應(yīng)與生長性 狀的相關(guān)性。先對數(shù)據(jù)進(jìn)行描述分析，確定是否存在離群值，再利用最小二乘分析對數(shù)據(jù)校 正；根據(jù)數(shù)據(jù)特征，利用多元線性模型分析基因型效應(yīng)。模型如下
yijklmn= y+Gen0typei+Sj+Bk+F1+Agem+Xn+eijklnm 其中yijklm為個體表型記錄場別效應(yīng)；Sj為種公畜效應(yīng)；Bk :品種效應(yīng)；Agem為
年齡效應(yīng)；Xn為各種二級和二級以上互作效應(yīng)，如Age X Genotype，SjX Genotype等；eijklmn 為隨機誤差；運用SPSS(16.0)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并用最小二乘法擬合線性模型，對各基因型間體尺指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性檢驗。 結(jié)果表明(見表5):對于Ndel可識別的第5001位的SNP位點，GG基因型為優(yōu)勢
基因型；對于體高，體長和胸圍，GG基因型個體的數(shù)值均顯著高于GA基因型個體，研究表明
體尺性狀與產(chǎn)奶性狀呈正相關(guān)，這說明GG基因型可以成為一個提高奶山羊泌乳性狀育種
速度的分子遺傳標(biāo)記。AA基因型個體由于只有1個所以沒有進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。 表5Ndel多態(tài)位點與薩能奶山羊體尺之間的方差分析
體尺(cm) GG(Mean±S.E.)GA(Mean士S.E.) AA(Mean士S.E.)
0127] 注字母不同表示差異顯著(P < 0.05)。
0128] 核苷酸序列表
0129] 〈110〉西北農(nóng)林科技大學(xué)
0130] 〈120〉 一種奶山羊SCD基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測方法
0131] 〈210>1
0132] 〈211>362
0133] 〈212>DNA
0134] 〈213〉奶山羊(Capra hircus)
0135] 〈220〉
0136] 〈221r
0137] 〈222〉 (40)
0138] 〈400>1
0139] gcctgccccc ttcttatcct ggcagtgtta
0140] acagcagggg tccatcgcct gtggagtcac
0141] gtcttcctga tcatcgccaa caccatggcg
0142] ctttttctcc tcactcttte tcgatgagcc
0143] agagggacag cacctggate gccacttcac
0144] tcagtcccaa agtccateaa acateaggat
0145] ag
ttctectetrtgatgagtgccctgggcatc60
cgaacctecaaagctcggctgcccctgcgg120
ttccaggtgag皿gccagctgtgctcagct180
ggtggtgg皿tgg郷tgatcggtgcctgg240
tttcctctctccttgtggtt皿gttcaggt300
acttctgagtg3CtggC3g3gg腿gtegg360
79.83±4.95a 77.02±5.40D 74.00
70.70±4.75a 68.28±4.28b 68.00
91.04±5.30a 89.07±5.87b 92.00
長古冋圍
體體胸
別點
識位
1權(quán)利要求
一種奶山羊SCD基因的單核苷酸多態(tài)性，其特征在于，其基因單核苷酸多態(tài)性包括奶山羊SCD基因第5001位為G或A的單核苷酸多態(tài)性。
2. —種奶山羊SCD基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 以包含SCD基因的待測奶山羊全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增奶山羊SCD基因；用限制性內(nèi)切酶NdeI消化PCR擴增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴增片段進(jìn)行瓊 脂糖凝膠電泳；根據(jù)電泳結(jié)果鑒定奶山羊SCD基因第5001位的單核苷酸多態(tài)性； 所述的引物對P為上坊,弓I物P1 :cctggcagtg ttattctacc at 22 ; 下游弓l物P2 :ctcctacttg cctctgc 17。
3. 如權(quán)利要求2所述的奶山羊SCD基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所 述的PCR擴增反應(yīng)程序為94。C預(yù)變性5min ;94°C變性30s， 58°C退火30s， 72°C延伸30s，35個循環(huán);72。C延伸 lOmin。
4. 如權(quán)利要求2所述的奶山羊SCD基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所 述的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為2%。
5. 如權(quán)利要求2所述的奶山羊SCD基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于， 所述的根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)SCD基因第5001位為GG型表現(xiàn)345bp ;GA型表現(xiàn)345bp、 321bp和24bp ;AA型表現(xiàn):321bp和24bp。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種奶山羊SCD基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測方法，其基因單核苷酸多態(tài)性包括以包含SCD基因的待測奶山羊全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增奶山羊SCD基因；用限制性內(nèi)切酶NdeI消化PCR擴增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)電泳結(jié)果鑒定奶山羊SCD基因第5001bp的堿基多態(tài)性。該方法是一種在DNA水平上篩查和檢測與奶山羊泌乳性狀密切相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記，以用于奶山羊的輔助選擇和分子育種，加快奶山羊良種繁育速度。
文檔編號C12Q1/68GK101705290SQ20091021900
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月17日
發(fā)明者劉艷麗, 屈玉嬌, 李轉(zhuǎn)見, 藍(lán)賢勇, 陳宏 , 陳忠琦, 雷初朝 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)