專利名稱：奶山羊mfg-e8基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及以奶山羊的功能基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)作為分子遺傳標記，特別涉及一種奶山羊MFG-E8基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測方法。
背景技術(shù)：
羊奶具有很高的營養(yǎng)價值，不含過敏原，營養(yǎng)成分均衡，易消化吸收，與人乳蛋白質(zhì)組成相似；羊奶的脂肪顆粒體積為牛奶的三分之一，羊奶中的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)，尤其是鈣、磷、維生素及微量元素的含量比牛奶略高，且更利于人體吸收，在國際營養(yǎng)界被譽為"奶中之王"。羊奶由于有膻與味喝牛奶相比，羊奶的人較少。隨著高科技應(yīng)用于生物制藥、食品加工，脫膻技術(shù)的應(yīng)用給羊奶界蓬勃發(fā)展帶來可能。雖然奶山羊是我國主要的奶畜之一，但是我國羊奶的生產(chǎn)同發(fā)達國家相比差距巨大，主要是因為我國優(yōu)秀奶山羊品種種源不足和種群遺傳品質(zhì)較差。 傳統(tǒng)的育種方法應(yīng)用測試動物的表現(xiàn)型和其親代、祖代及其它親屬在小的動物模型中的遺傳信息，設(shè)想性狀受到許多基因遺傳差異的影響，每個基因?qū)π誀钣邢鄬^小的貢獻，因此對性狀的估計不可避免有些偏差。分子遺傳標記是近年來現(xiàn)代遺傳學(xué)發(fā)展最快的領(lǐng)域之一，新的方法正在不斷涌現(xiàn)，已定位的標記基因數(shù)目與日倶增。這將為數(shù)量遺傳學(xué)提供分子水平信息，家畜育種也將跨入分子育種階段。應(yīng)用分子遺傳標記的現(xiàn)代育種技術(shù)是加快良種選育和提高種群遺傳品質(zhì)，從而增加奶山羊的產(chǎn)奶量和改善乳品質(zhì)的先進的有效的方法。 分子遺傳標記輔助選擇就是將現(xiàn)代生物技術(shù)與常規(guī)選擇方法相結(jié)合，通過對遺傳標記的選擇來間接選擇控制某性狀的數(shù)量性狀位點(QTL)，使之能夠同時利用標記位點信息和數(shù)量性狀的表型信息，更準確估計動物個體的育種值，提高選擇效率，加快育種進展。標記輔助選擇主要經(jīng)歷了三個階段第一階段是家畜各性狀間的遺傳分析；第二階段是蛋白質(zhì)(酶)標記對數(shù)量性狀的標記階段；第三個階段是分子遺傳標記階段。隨著分子標記技術(shù)日漸成熟與豐富，使覆蓋整個基因組的標記成為可能，通過與QTL間的連鎖分析，實現(xiàn)分子標記輔助選擇的目標。 單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)作為新的遺傳標記已廣泛應(yīng)用于基因定位、克隆、遺傳育種及多樣性的研究。SNP是基因組中存在的一種數(shù)量非常豐富的變異形式，占人類基因組中遺傳多態(tài)性的90%以上。SNP與罕見的變異不同，通常在種群中頻率等于或小于1%的此種變異被稱為突變，而只有頻率大于1%時才被稱為單核苷酸多態(tài)性。 目前，主要采用幾種不同的方法來發(fā)現(xiàn)SNPs :DNA序列測定方法、PCR-SSCP與DNA測序結(jié)合法、AS-PCR方法、PCR-RFLP法、TaqMam技術(shù)與分子信標(Molecular Beacons)等。在這些SNP檢測技術(shù)中，(l)DNA序列測定法是最為準確的SNP檢測方法，但是，其檢測費用極其昂貴，且需要有DNA測序儀等大型儀器，同時，在測序過程中需要非常熟練的技術(shù)人員和經(jīng)驗，所以，DNA序列測定法不是一種應(yīng)用于生產(chǎn)實際的理想SNP檢測方法；(2)PCR-SSCP與DNA測序結(jié)合法檢測SNP可以適當降低檢測費用，但是，PCR-SSCP的實驗過程比較長，操作比較繁瑣，且實驗過程中存在假陽性問題，所以，也并非理想的SNP檢測手段；(3)AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測方法，在未來的應(yīng)用領(lǐng)域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設(shè)計特別的引物，且只能針對特定的基因位點，同時，檢測過程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應(yīng)用的特點；(4)TaqMam技術(shù)與分子信標(Molecular Beacons)都是在熒光能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence ResornanceEnerg Transfer, FRET)基礎(chǔ)上建立起來的，利用熒光標記及儀器達到檢測目的。焦磷酸測序(Pyrosequencing)則是利用測序過程中可釋放的焦磷酸和酶類產(chǎn)生熒光，是不依賴平板膠或毛細管電泳、不依賴DNA的熒光標記技術(shù)，很可能成為未來的主流技術(shù)。(5) RFLP-PCR方法是一種檢測SNP的有效技術(shù)，在發(fā)現(xiàn)SNP位點后引入限制性內(nèi)切酶進行切割，然后進行瓊脂糖、聚丙烯凝膠電泳分析，就能準確地鑒別SNP位點。RFLP-PCR方法不僅具有DNA測序法的準確性，又克服了費用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點，而且所檢測的序列位點無特殊性要求。 MFG-E8作為一種糖蛋白是在乳中和哺乳動物上皮細胞中首次被發(fā)現(xiàn)，是乳脂肪球膜的另一種主要蛋白成分。MFG-E8糖蛋白是凋亡細胞和活性吞噬細胞之間的聯(lián)系分子，在乳腺衰退過程中，MFG-E8在識別凋亡細胞，激活吞噬細胞吞噬凋亡的上皮細胞方面起著重要作用。MFG-E8的缺失將會延遲凋亡的乳腺上皮細胞及乳脂肪球的清除，損害乳腺的發(fā)育和分化，同時導(dǎo)致衰退受阻和乳腺炎癥的發(fā)生。在受精過程中該蛋白促使精卵的相互作用。此外，MFG-E8在豬乳凝集素的成熟中和精子獲能中發(fā)揮作用研究發(fā)現(xiàn)。MFG-E8也是一種可以阻止腸道病原入侵和感染的重要的乳成分。 目前，對于MFG-E8基因的研究多集中在小鼠與人類的免疫方面。關(guān)于動物MFG-E8基因遺傳變異的研究國內(nèi)外也多見于小鼠與人類，未見奶山羊MFG-E8基因遺傳變異或SNP研究的報道。目前中國奶山羊MFG-E8基因遺傳變異領(lǐng)域的研究匱乏，該基因位點的功能研究及其遺傳變異與經(jīng)濟性狀(如體高、體長、產(chǎn)奶量、奶成分等性狀)關(guān)聯(lián)的研究仍是空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種奶山羊MFG-E8基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測
方法，利用RFLP-PCR方法針對其基因位點上的同義密碼子突變可能導(dǎo)致編碼蛋白表達水
平發(fā)生變化的單核苷酸多態(tài)性進行檢測，提前淘汰掉汰掉攜帶不良基因的個體，加快具有
優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟性狀奶山羊種群的建立。 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn) 奶山羊MFG-E8基因單核苷酸多態(tài)性的快速檢測方法及其應(yīng)用，其基因單核苷酸多態(tài)性包括 在奶山羊MFG-E8基因第12892bp為C或T的堿基多態(tài)性。
上述奶山羊MFG-E8基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法為 以包含MFG-E8基因的待測奶山羊全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增奶山羊MFG-E8基因；用限制性內(nèi)切酶EcoRV消化PCR擴增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴增片段進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定奶山羊MFG-E8基因第12892bp的單核苷酸多態(tài)性；
所述的引物對P為 上坊,弓l物cctactacgc acgactggat at 22 ;
下坊,弓l物acaaggctca aagaaactcc 20。
所述的PCR擴增反應(yīng)程序為 94。C預(yù)變性4min， ；94。C變性30s，56。C退火30s，72。C延伸20s，30 35個循環(huán);72。C延伸10min。 所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳為質(zhì)量濃度為10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳。
所述根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定奶山羊MFG-E8基因第12892位的單核苷酸多態(tài)性為TT基因型表現(xiàn)為195bp條帶；TC基因型表現(xiàn)為195bp、 175bp和20bp條帶；CC基因型表現(xiàn)為175bp和20bp條帶；其中，單核苷酸多態(tài)性CC基因型為同義密碼子突變。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果 本發(fā)明公開了與奶山羊泌乳性相關(guān)的功能基因MFG-E8的核苷酸多態(tài)性，該核苷酸多態(tài)性能夠作為一個分子遺傳標記；該多態(tài)性中包含的同義密碼子突變可能導(dǎo)致編碼蛋白表達水平發(fā)生變化，提前淘汰掉攜帶不良基因的個體，能夠加快具有優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟性狀奶山羊種群的建立。 本發(fā)明利用RFLP-PCR方法對奶山羊MFG-E8基因第12892bp上的同義密碼子突變可能產(chǎn)生編碼蛋白表達水平發(fā)生變化的單核苷酸多態(tài)性進行檢測，當?shù)?2892bp由T突變?yōu)镃時，原有的編碼Asp的密碼子AAT發(fā)生突變?yōu)锳AC，導(dǎo)致在轉(zhuǎn)錄的mRNA在翻譯過程由于攜帶該氨基酸的tRNA豐度不同而影響翻譯的效率，從而影響該蛋白的表達量。
本發(fā)明提供的奶山羊MFG-E8基因單核苷酸多態(tài)性檢測方法，針對第12892bp由T突變?yōu)镃的轉(zhuǎn)換突變，通過引物設(shè)計人為的在下游引物的3'端引入堿基錯配，當由T變?yōu)镃時，PCR擴增MFG-E8基因后在錯配位置形成限制性內(nèi)切酶EcoRV識別位點，而突變沒有發(fā)生時，PCR擴增MFG-E8基因后不能形成EcoRV識別位點；通過電泳檢測分型可以準確、快速、方便的檢測MFG-E8基因單核苷酸多態(tài)性不包含195bp條帶為CC基因型個體；不包含175bp條帶為TT基因型個體；同時包含195bp和175bp條帶為TC基因型個體；進而對種群的MFG-E8基因SNP的等位基因頻率變化監(jiān)控。 本發(fā)明對MFG-E8基因的EcoRV位點進行了基因分型和基因頻率分析，以及與莎能奶山羊各胎年泌乳量之間進行了性狀關(guān)聯(lián)分析；結(jié)果表明EcoRV位點對三個體尺性狀(體高、體長和胸圍)及四個胎次的產(chǎn)奶量(第一胎、第二胎、第三胎和第四胎)影響差異不顯著，但對西農(nóng)薩能奶山羊的乳脂率和總固形物有顯著影響；乳成分MFG-E8基因的核苷酸多態(tài)位點能夠成為分子遺傳輔助育種的標記。


圖1為奶山羊MFG-E8基因PCR擴增后產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測結(jié)果圖； 圖2為奶山羊MFG-E8基因包含突變位點的195bp PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRV酶切后電泳
結(jié)果； 圖3為奶山羊MFG-E8基因SNP的不同基因型測序圖。
具體實施例方式本發(fā)明利用RFLP-PCR方法對奶山羊MFG-E8基因第12892bp同義密碼子突變可能
產(chǎn)生編碼蛋白表達水平發(fā)生變化的單核苷酸多態(tài)性進行檢測，下面結(jié)合對本發(fā)明做進一步
的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。 a、奶山羊MFG-E8基因含第七外顯子區(qū)域PCR引物的設(shè)計 本發(fā)明根據(jù)與奶山羊的同源動物牛的序列為參考，具體以NCBI所公布的安格斯
牛(NC_007319)的序列為參考；利用Primer 5. 0設(shè)計能夠擴增包含奶山羊MFG-E8基因第
七外顯子的PCR引物，其引物序列如下 上游弓l物tcttttccct tcactgcctc 20; 下坊,弓l物acaaggctca aagaaactcc 20 ; 以上述引物對奶山羊基因組擴增，能夠擴增包含奶山羊MFG-E8基因第七外顯子 12671bp 13063bp的397bp的基因片段，擴增后片段的電泳檢測如圖1所示，其中，泳道 1 6為檢測片段，泳道M為Marker (100bp， 200bp， 300bp， 400bp， 500bp， 600bp);測序結(jié)果 如SEQ ID NO. l所示，對擴增的片段進行測序鑒定后，發(fā)現(xiàn)當?shù)?2892bp(即MFG-E8基因 CDS區(qū)第930位，位于序列表的第225位)的T突變?yōu)镃時，導(dǎo)致編碼第310bp的氨基酸密 碼子由AAT突變?yōu)锳AC，從而形成同義突變； 由于在12892bp處(SNP位點)無自然酶切位點，不能通過直接酶切檢驗，而如果 在12891bp處人工設(shè)計PCR引物錯配，由A錯配為T ;當12892bp由T突變?yōu)镃時，設(shè)計的引 物擴增MFG-E8基因產(chǎn)物的第18bp 23bp序列為GATATC，形成了限制性內(nèi)切酶EcoRV的酶 切位點，當在12892bp沒有突變時，設(shè)計的引物擴增MFG-E8基因產(chǎn)物的第18bp 23bp序 列為GATATT，限制性內(nèi)切酶EcoRV不能識別；這樣就可以對該位點SNP多態(tài)性進行檢測；因 此設(shè)計PCR擴增引物P為 上坊,弓l物cctactacgc acgactggat at 22 ;
下坊,弓l物acaaggctca aagaaactcc20 ; 其中，引入的錯配堿基為下游引物第22bp的T ;引物P對應(yīng)擴增的基因片段是 MFG-E8基因的12869bp 13063bp的195bp的片段，當用限制性內(nèi)切酶EcoRV對引物P對 應(yīng)擴增的基因片段酶切消化時，不能被切開或可以被切成2段。
b、以引物P進行PCR擴增待測奶山羊的MFG-E8基因片段
1、奶山羊樣本采集及基因組DNA提取
1)奶山羊樣本的采集 本發(fā)明具體以2個中國地方奶山羊品種的種群的688頭母羊作為檢測對象，具體 采集樣本見表l :西農(nóng)薩能奶山羊(244)，關(guān)中奶山羊(424);
表l奶山羊樣本的采集
品種 樣品數(shù)樣品名稱 樣品來源 采樣方式
西農(nóng)薩能奶山 244 羊(XS goat)血樣陜西省寶雞市千陽縣薩能奶山羊 繁育中心靜脈采血
關(guān)中奶山羊 424 (GZ goat)血樣陜西省西安市三原塔南保種場靜脈采血 2)血樣基因組DNA的分離、提取、純化 1)冷凍血樣(主要為血細胞)室溫解凍，轉(zhuǎn)移1. 0mL至2. 0mL E卯endorf離心管， 加入等體積PBS液，充分混勻，12000r/min離心lOmin (4°C )，棄去上清液，重復(fù)上述步驟至 上清液透明、沉淀呈淡黃色； 2)在離心管中加入DNA抽提緩沖液500ii L，搖動，使血細胞沉淀脫離離心管管壁， 37。C水浴lh ; 3)加蛋白酶K至3uL(20mg,/mL)并混勻，55°C過夜至澄清，尚未澄清者，可補加 1 p L蛋白酶K混勻繼續(xù)消化直至澄清；4)將反應(yīng)液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500 y L，溫和搖動離心管20min，使其充 分混勻；4°C， 12000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一 1. 5mL離心管中，重復(fù)一次；
5)加氯仿500 u L，充分混勻20min，4。C， 12000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另 一 1. 5mL離心管中； 6)加氯仿、異戊醇混合液(24 : 1) 500 u L，充分混勻20min， 4°C ， 12000r/min離心 10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一 1.5mL離心管中; 7)加0. 1倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無水乙醇，混合轉(zhuǎn)動離心管， 直至白色的絮狀沉淀析出，-2(TC保存30 60min ;8) 4°C ， 12000r/min離心10min，棄去上清液，用70%冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；
9) 4°C ， 12000r/min離心10min，棄去上清液，室溫下使乙醇揮發(fā)干凈；
10)干燥后的DNA溶于80 100 u L的TE液，4。C保存直至DNA完全溶解，0. 8%瓊 脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，-S(TC保存。 11)500p L的DNA溶液中加入10% SDS使其終濃度為0. 1X，加入蛋白酶K至終濃
度達到50 ii g/mL ; 12)5。C保溫10h左右； 13)等體積苯酚、氯仿、異戊醇(25 : 24 : 1)和氯仿分別抽提一次；
14) 12000r/min離心5min分相，吸取上層水相至另一離心管中；
15)加入1/10體積3mol/L醋酸鈉和2倍體積冰冷無水乙醇沉淀DNA ;
16)倒掉液體，70%乙醇洗滌后晾干，加入60ii L滅菌超純水溶解，4"C待檢測。
3) PCR擴增 PCR反應(yīng)體系采用混合加樣法，即根據(jù)每一個反應(yīng)體系所需的各種組分的數(shù)量和 1次反應(yīng)所需的PCR反應(yīng)的個數(shù)，算出各種反應(yīng)組分的總量，加入到1個1. 5mL離心管中，充 分混勻后瞬時離心，再分裝到每個O. 2mLE卯endorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬時離 心后進行PCR擴增；
7

PCR反應(yīng)體系見表2 :
表2PCR反應(yīng)體系
滅菌超純水(H20)10.8
2xbuffer (內(nèi)含Mg2+、 dNTPs等)2.5 (iL
引物P上游引物(10pmol/L)0. 5
引物P下游引物(lOpmol/L)0. 5 jxL
TaqDNA聚合酶(2.5U4iL)0.25
DNA模板(50ng4iL)0.45
總體積15

PCR反應(yīng)程序 94。C預(yù)變性4min ;
體的
94'C變性30 s，
65.5。C退火30 s，卜30-35個循環(huán)； 72°C延伸20 s， _^ 72。C延伸10min; 對2個奶山羊品種的688個樣本的基因組DNA進行PCR擴增，獲得688 奶山羊MFG-E8基因中包含該SNP位點的195bp的DNA片段。
c、 EcoRV酶切消化PCR擴增的MFG-E8基因片段 1、EcoRV酶切反應(yīng)消化體系(25 30iiL) :10 15yL PCR產(chǎn)物，10X緩沖液(含 BSA)2. 5 3. Oii L， EcoRV(10U/ii L)為1. 0 1. 5 ii L， 11. 5 16. 5 ii L滅菌純水(H20);
2、酶切消化條件37t:恒溫培養(yǎng)箱中消化5 10h ;
d、 EcoRV消化PCR產(chǎn)物后聚丙烯酰胺凝膠電泳分析 1)制作10 %的聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)，上樣后200V電壓電泳45min，0. 01 % AgN03，2% NaOH顯色。 2)待分子量不同的DNA片段分離清晰時，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng) 成像； 3)根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果分析SNP多態(tài)性 用BIO-RAD Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)照相分析，判斷SNP的多態(tài)性MFG-E8基因的第12892bp由T突變?yōu)镃時，由于引入了堿基錯配，PCR擴增的
MFG-E8基因產(chǎn)物的第18bp 23bp序列為GATATC，限制性內(nèi)切酶EcoRV識別后在GAT'ATC
對擴增片段酶切，切取20bp的上游引物片段，將擴增片段切為2段；而MFG-E8基因的第
12892bp沒有發(fā)生突變，限制性內(nèi)切酶EcoRV不能識別堿基錯配引入的酶切位點，擴增片段
8不被切開； 由于奶山羊為2倍體，所以奶山羊基因組的MFG-E8基因的第12892bp的SNP的多 態(tài)性的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果為 TT基因型表現(xiàn)為195bp—條帶；TC基因型表現(xiàn)為195bp、 170bp和20bp三條帶；CC 基因型表現(xiàn)為175bp和20bp兩條帶；由于20bp較小，故在聚丙烯酰胺電泳分析泳動位置超 出成像視野，但通過195bp和175bp條帶還是能夠準確的鑒別TT基因型、TC基因型和CC基 因型不包含195bp條帶為CC基因型個體；不包含175bp條帶為TT基因型個體；同時包含 195bp和170bp條帶為TC基因型個體; 如圖2所示，其中，泳道1不包含175bp條帶，其為TT基因型個體，泳道2不包 含195bp條帶，為CC基因型個體，包含209bp和70bp條帶，泳道3，泳道4同時包含195bp 和175bp條帶，為雜合子TC基因型個體，泳道M為Marker I (600bp， 500bp， 400bp， 300bp， 200bp，100bp)。 4)不同基因型個體PCR產(chǎn)物的測序驗證 利用ABI 377和ABI 3730測序儀對不同基因型個體PCR產(chǎn)物分別進行正反雙向
測序；同時，進行SNP位置分析，結(jié)果表明包含175bp和195bp條帶的雜合子TC基因型個體
其12892bp的測序圖的確表示為T或C，如圖3a所示，自左向右第4個峰為兩個峰，而CC基
因型、TT基因型分別為C、 T，如圖3b、 c所示。 e、奶山羊MFG-E8基因SNP位點的頻率統(tǒng)計分析 1)基因和基因型頻率 基因型頻率是指一個群體中某一性狀的某種基因型個體數(shù)占總個體數(shù)的比率。paa 二 NAA/N，其中PAA代表某一位點的AA基因型頻率；NM表示群體中具有AA基因型的個體數(shù)； N為檢測群體的總數(shù)量。 基因頻率是指一個群體中某一基因數(shù)對其等位基因總數(shù)的相對比率。計算的公式 可以寫成PA = (2NM+NAal+NAa2+NAa3+NAa4+......+NAan)/2N 式中，Pa表示等位基因A頻率，Nm表示群體中具有AA基因型的個體數(shù)量，NAai表 示群體中具有Aai基因型個體數(shù)量，al-an為等位基因A的n個互不相同的復(fù)等位基因。
在不同奶山羊品種MFG-E8基因SNP中的T等位基因頻率變化幅度在54. 1 % 57.0%，(:等位基因頻率變化幅度在43.0% 45.9%之間，如表3所示。該SNP位點的等 位基因頻率大于1.0%，符合動物育種中分子標記大于5.0% 10%的要求，具備群體遺傳 多樣性特征。 表3奶山羊MFG-E8基因第12892位SNP基因頻率分布表
基因型的觀測數(shù)目總計 等位基因頻率 奶山羊品種 -
TTTCCC688TC
西農(nóng)薩能奶山羊62140422440.5410.459
關(guān)中奶山羊118247594240.5700.430
9
f、基因效應(yīng)與性狀的關(guān)聯(lián)分析
基因型數(shù)據(jù)EcoRV (TT、 TC和CC) 生產(chǎn)數(shù)據(jù)三個體尺數(shù)據(jù)(體高、體長和胸圍)，四個胎次的產(chǎn)奶數(shù)據(jù)(第一胎、第 二胎、第三胎和第四胎)和乳成分數(shù)據(jù)。 關(guān)聯(lián)分析樣本有體尺記錄的西農(nóng)和薩能奶山羊共668只，有第一胎到第四胎泌 乳記錄的薩能奶山羊170只，有乳成分記錄的薩能奶山羊74只，所有奶山羊均為母羊。
關(guān)聯(lián)分析模型 利用SPSS(13. 0)軟件分析基因位點、公畜、產(chǎn)羔季節(jié)、年齡和胎次因素與泌乳性 狀的相關(guān)性。先對數(shù)據(jù)進行描述分析，確定是否存在離群值，再利用最小二乘法分析對數(shù)據(jù) 校正；根據(jù)數(shù)據(jù)特征，利用多元線性模型分析基因型對性狀的效應(yīng)。
基因型對體尺性狀的效應(yīng)模型為
Yi j = u+Ai+Gj+ei j 其中yij為個體表型記錄；P為總體均值；Ai為年齡的固定效應(yīng)；Gj為基因型的
固定效應(yīng)；eij為隨機誤差。
基因型對泌乳性狀的效應(yīng)模型為
Yij = ii+YSi+Gj+(GYS)ij+eij
其中Yi j為個體表型記錄；P為總體均值；Ysi為產(chǎn)羔的季節(jié)效應(yīng)；(GYS) i j為各 種主效應(yīng)二級和二級以上互作效應(yīng)；eij為隨機誤差。 運用SPSS(16.0)軟件對數(shù)據(jù)進行分析，并用最小二乘法擬合線性模型，對各基因 型間與產(chǎn)奶量指標進行差異顯著性檢驗。 結(jié)果表明在EcoRV可識別的SNP位點，三種基因型對體尺及第一胎到第四胎的泌 乳量影響均不顯著(P > 0. 05)，具體如表4所示；三種基因型對乳脂率和總固形物的影響 差異顯著(P < 0. 05)，具體如表5所示CC型優(yōu)于CT型，CT型優(yōu)于TT型。說明EcoRV位 點可以成為一個提高奶山羊產(chǎn)奶量的分子遺傳標記。 表4. EcoRV識別的SNP位點和體尺及第一胎到第四胎的關(guān)聯(lián)分析.
性狀EcoRV位點的基因型戶值
CC(Mean士SD)CT(Mean士SD)TT(Mean士SD)
體高(cm)70.35±5.1170.39±4.6769.93±4.750.541
體長Ccm)79.07±5.4679.53±5.2279.17±5.000.612
胸圍(cm)90.94±5.7090.70±5.4490.73±5.450.928
第一胎產(chǎn)奶量(kg)612.21±79.32620.92±75.32617.74±64.250.866
第二胎產(chǎn)奶量(kg)889.22±60.52902.86±71.25893.30±69.700.581
第三胎產(chǎn)奶量(kg)950.03±93.88956.80±114.17942.53±107.010.770
第四胎產(chǎn)奶量(kg)866.58±89.22890.34±1U.11873息105.410.495 表5. EcoRV識別的SNP位點與乳成分的關(guān)聯(lián)分析.
乳成分EcoRV位點的基因型尸值
CC(Mean士SD)CT(Mean士SD)TT(Mean土SD)
乳脂率(％)3.97±0.90 a3.86士1.20a3.36±0.83 b0.033
乳蛋白率(％)2.99±0.212.89±0.272.94±0.240.376
總固形物(°/(012.43土1.02a12.43士l,22b11.75士0.85b0.015
非脂固形物(％)8.51±0.398.33±0.348.39±0.360.292
乳糖率(％)4.41±0.204.35±0.214.35±0.130.579
密度(kg/m3)1029.43±2.441029.47±1.卯1029.32±1.690.643 注具有相同字母表示差異不顯著(P > 0.05)，字母不同表示差異顯著(P < 0. 05)。 核苷酸序列表 〈110〉西北農(nóng)林科技大學(xué) 〈120〉奶山羊MFG-E8基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測方法
〈210>1
<211>397
〈212>DNA 〈213〉奶山羊(Capra hircus)
〈220〉
〈221>y
〈222〉 (225)〈400〉1tcttttcccttcactgcctcgctctcacgcgggtg織gcCCCCC3CCCCcacctccttg皿ggateateccatcccc皿c^gcagatcctgagtgcctttegctggtttccctectecgcctggaccgCCC3g3CC皿cagtgcctctgggatgc郷gttggggttgggtggggctgcctctgcttgCC皿g3ggg3gtttctttga
ccccacgcgt郷ctgtggatcccagatct60
gcactgaaccccteggcctg120
acagcctccagctectecaa皿cctggggc180
gcacgactggat呵tggggcaagttcaac240
gagtggctgcggctcctctg300
tggg皿tctetgaccctggcccaaccctgg360
gccttgt39權(quán)利要求
一種奶山羊MFG-E8基因的單核苷酸多態(tài)性，其特征在于，其基因單核苷酸多態(tài)性包括在奶山羊MFG-E8基因第12892bp為C或T的堿基多態(tài)性。
2. 權(quán)利要求1所述的奶山羊MFG-E8基因單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，以 包含MFG-E8基因的待測奶山羊全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增奶山羊 MFG-E8基因；用限制性內(nèi)切酶EcoRV消化PCR擴增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴增片段進行 聚丙烯酰胺凝膠電泳；根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定奶山羊MFG-E8基因第12892nt的 單核苷酸多態(tài)性；所述的引物對P為上游弓l物cctactacgc acgactggat at 22 ; 下游弓l物acaaggctca aagaaactcc 20。
3. 如權(quán)利要求2所述的奶山羊MFG-E8基因單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于， 所述的PCR擴增反應(yīng)程序為94。C預(yù)變性4min ;94。C變性30s， 。C 56。C退火30s， 72。C延伸20s， 30 35個循環(huán)；72。C 延伸10min。
4. 如權(quán)利要求2所述的奶山羊MFG-E8基因單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于， 所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳為10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。
5. 如權(quán)利要求2所述的奶山羊MFG-E8基因單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于， 根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定奶山羊MFG-E8基因第12892nt的單核苷酸多態(tài)性為TT 基因型表現(xiàn)為195bp—條帶；TC基因型表現(xiàn)為195bp、175bp和20bp三條帶；CC基因型表現(xiàn) 為175bp和20bp兩條帶；其中，單核苷酸多態(tài)性CC基因型為同義密碼子突變。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種奶山羊MFG-E8基因單核苷酸的多態(tài)性及其檢測方法，以包含MFG-E8基因的待測奶山羊全基因組DNA為模板，以引物對P(包括P1，R1，newP)為引物，PCR擴增奶山羊MFG-E8基因；用限制性內(nèi)切酶EcoRV消化PCR擴增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴增片段進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定奶山羊MFG-E8基因第12892nt的單核苷酸多態(tài)性；由于MFG-E8基因功能涉及乳腺發(fā)育，乳脂和總固形物等奶成分，本發(fā)明提供的檢測方法為MFG-E8基因的SNP與奶成分關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國奶山羊奶用性狀的標記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的奶山羊種群。
文檔編號C12Q1/68GK101705288SQ20091021900
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月17日
發(fā)明者劉艷麗, 屈玉嬌, 李轉(zhuǎn)見, 淮永濤, 胡沈榮, 藍賢勇, 陳宏 , 陳忠琦, 雷初朝 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)