專利名稱：：利用轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染牛體細胞成為誘導(dǎo)性多能干細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種利用轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染牛體細胞成為誘導(dǎo)性多能干細胞的方法。
背景技術(shù)：
：2006年，日本學(xué)者Yamanaka[1]首次報道，利用小鼠轉(zhuǎn)錄因子0ct4，Sox2，c_Myc，Klf4組合共同轉(zhuǎn)染小鼠體細胞，獲得了小鼠的誘導(dǎo)性多能干細胞(inductedpluripotentstemcells,iPSCs)。隨后，世界范圍內(nèi)掀起了誘導(dǎo)多潛能干細胞的研究熱潮。從動物品種、轉(zhuǎn)錄因子種類和數(shù)量、轉(zhuǎn)錄因子組合方式以及外源基因?qū)敕椒ǖ鹊仍S多方面都作了研究。2007年Yamanaka[2]又利用同樣的轉(zhuǎn)錄因子成功得到人類的iPSCs;同年，Yu(俞君英)與Thomson^等人利用用另外四種轉(zhuǎn)錄因子(0ct3/4，Sox2，Nanog，Lin28)亦成功得到人類iPS細胞。隨后又有恒河猴[4]、大鼠[5]、豬[6]等動物iPSCs獲得成功的報道(Lietal.，2009;Liaoetal.，2009;Liuetal.，2008)。由于iPSCs與胚胎干細胞(ESCs)具有非常相似的生物學(xué)特性，所以在現(xiàn)有的iPSCs的建立過程中都借鑒了ES細胞的培養(yǎng)條件，例如應(yīng)用ESCs的培養(yǎng)液，應(yīng)用小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)作為飼養(yǎng)層來提供多種生長因子以維持iPSCs的多能性。但是，在家畜，例如豬、牛、羊等動物還沒有公認的建系的胚胎干細胞[7]，從早期胚胎中分離這些胚胎干細胞非常困難，而且培養(yǎng)體系沒有完全確定?，F(xiàn)有的胚胎干細胞培養(yǎng)條件，都是必須采用小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)作為培養(yǎng)層，才能維持ESCs處于未分化狀態(tài)。在ESCs培養(yǎng)體系中應(yīng)用小鼠胚胎成纖維細胞，直接引入了異種動物細胞，結(jié)果直接影響了ESCs細胞的臨床應(yīng)用，也增加了培養(yǎng)過程中的工作量與難度。自從1981年小鼠胚胎干細胞[8]與1998年人類胚胎干細胞[9]建系以來，至今已經(jīng)過去了二十多年，可是家畜胚胎干細胞至今難以建系，則說明家畜要從早期胚胎材料分離獲得胚胎干細胞還存在著許多技術(shù)上與理論上的制約因素。因此，利用基因工程原理，將多能性關(guān)鍵基因?qū)塍w細胞，使其重編程為具有多能性的干細胞，既解決了技術(shù)難關(guān)，而且也豐富了細胞重編程與干細胞建系的理論。參考文獻[1]Takahashi，K.，andYamanaka，S.(2006).Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.Celll26，663-676.[2]Takahashi，K.，Tanabe，K.，0h皿ki，M.，Narita，M.，Ichisaka，T.，Tomoda，K.，andYamanaka，S.(2007).Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors.Cell131，861_872.[3]Yu，J.Y.，Vodyanik，M.A.，Smuga-0tto，K.，Antosiewicz-Bourget，J.，F(xiàn)rane，J.L，Tian，S.，Nie，J.，Jonsdottir,G.A.，Ruotti，V.，Stewart,R.，etal.(2007).Inducedpluripotentstemcelllinesderivedfromhumansomaticcells.Science318，1917-1920.4[4]Liu，H.S.，Zhu，F(xiàn).F.，Yong，J.，Zhang，P.B.，Hou，P.P.，Li，H.G.，Jiang，W.，Cai，J.，Liu，M.，Cui，K.，etal.(2008).GenerationofInducedPluripotentStemCellsfromAdultRhesusMonkeyFibroblasts.CellStemCell3，587—590.[5]Li，W.L，Wei，W.，Zhu，S.，Zhu，J.，Shi，Y.，Lin，T.，Hao，E.，Hayek，A.，Deng，H.，andDing，S.(2009).GenerationofRatandHumanInducedPluripotentStemCellsbyCombiningGeneticR印rogrammingandChemicalInhibitors(vol4，pg16,2009).CellStemCell4，370-370.[6]Esteban，M.A.，Xu，J.，Yang，J.，Peng，M.，Qin，D.，Li，W.，Jiang，Z.，Chen，J.，Deng，K.，Zhong，M.，etal.(2009).GenerationofInducedPluripotentStemCellLinesfromTibetanMiniaturePig.JournalofBiologicalChemistry284，17634-17640.[7]Keefer，C.L，Pant，D.，Blomberg，L，andTalbot，N.C.(2007).Challengesandprospectsfortheestablishmentofembryonicstemcelllinesofdomesticatedungulates.AnimalReproductionScience98,147—168.[8]Martin,G.R.(1981).Isolationofapluripotentcelllinefromearlymouseembryosculturedinmediumconditionedbytera_tocarcinomastemcells.ProcNatlAcadSciUSA78,7634-7638.[9]Thomson，J.A.，Itskovitz-Eldor，J.，Shapiro,S.S.，Waknitz，M.A.，Swiergiel，J.J.，Marshal1，V.S.，andJones，J.M.(1998).Embryonicstemcelllinesderivedfromhumanblastocysts.Science282，1145—1147.
發(fā)明內(nèi)容針對家畜干細胞建系中存在的上述現(xiàn)有技術(shù)難題與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種獲得誘導(dǎo)性多能干細胞(iPSCs)的方法，用該方法獲得細胞在細胞集落形態(tài)、生長特性、干細胞表面標(biāo)記、表達干性基因、主要干性基因啟動子序列區(qū)域甲基化模式、類胚體形成與體外分化能力、畸胎瘤形成能力，以及參與嵌合體形成等八個方面都與胚胎干細胞特性非常相似。實現(xiàn)上述發(fā)明目的技術(shù)方案是一種利用轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染牛體細胞產(chǎn)生誘導(dǎo)性多能干細胞的方法，其特征在于，包括如下步驟1)牛皮膚成纖維細胞的分離與培養(yǎng)以成年牛皮膚成纖維細胞(BDFs)和新生牛皮膚成纖維細胞(NDFs)經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)分別獲得大量的成年牛皮膚成纖維細胞和新生牛皮膚成纖維細胞；2)牛維持多能性轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及其逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建從50-60日齡牛胎兒中分離生殖嵴，提取總RNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA;以cDNA為模板，經(jīng)過PCR反應(yīng)得到牛0ct4、Sox2、c-Myc與Klf4四個基因擴增產(chǎn)物并經(jīng)測序驗證序列正確而后將目的基因插入到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCVneo中，構(gòu)建這4種基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體；3)逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝與準(zhǔn)備在應(yīng)用脂質(zhì)體包裝病毒顆粒前1小時，包裝細胞PT67的培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)液，4-8iig包含有轉(zhuǎn)錄因子基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒DNA和10-20y1脂質(zhì)體分別5加入到2份500ii1Opti-MEM-I+GlutaMAX-I優(yōu)化轉(zhuǎn)染液中，輕柔混勻，室溫孵育，然后將稀釋的質(zhì)粒DNA和脂質(zhì)體輕柔混勻，再室溫孵育，20分鐘后，將質(zhì)粒_脂質(zhì)體混合液逐滴加入PT67細胞培養(yǎng)皿中。將PT67包裝細胞按照常規(guī)方法培養(yǎng)在含有15X胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，應(yīng)用脂質(zhì)體將構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染進入包裝細胞PT67細胞；將8iig含有0ct4、Sox2、c-Myc與Klf4不同基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體質(zhì)粒與4份20yl轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體lipofectamine2000分別用兩份500iilOpti-MEM-I+GlutaMAX-I轉(zhuǎn)染優(yōu)化液進行稀釋，輕輕混勻，室溫下孵育5分鐘，然后將含有脂質(zhì)體lipofectamine2000的稀釋液緩慢滴入含有逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒的稀釋液中，輕輕混勻，室溫下再孵育20分鐘后，將上述混合液逐滴加入PT67包裝胞培養(yǎng)皿中；轉(zhuǎn)染24小時后，每24小時更換含有逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的培養(yǎng)液一次，連續(xù)3天收集病毒懸浮液，在fC條件下經(jīng)25000轉(zhuǎn)/分離心90分鐘后，10倍濃縮病毒上清液；將包含有0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4基因病毒上清液進行等量混合，并加入8yg/mlPolybrene組成特定的四因子基因組合，-S(TC保存?zhèn)溆茫?)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染牛皮膚成纖維細胞以及牛的iPS細胞的獲得將成年牛皮膚成纖維細胞BDFs和新生公牛皮膚成纖維細胞NDFs按照常規(guī)方法培養(yǎng)在60mm塑料培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)皿中細胞生長到70-80%融合時將包含0ct4、Sox2、c-Myc與Klf4基因轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液混合液混合液大約5ml，分別加入到成纖維細胞BDFs與NDFs培養(yǎng)皿中感染成纖維細胞；細胞長滿培養(yǎng)皿后按l:3常規(guī)傳代，視細胞生長情況在第6-10d將細胞以1乂105細胞/孔的密度，轉(zhuǎn)移至預(yù)先鋪有人羊膜(HAM)6孔培養(yǎng)板上，用人羊膜代替小鼠胚胎成纖維細胞作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)感染后的牛細胞，同時培養(yǎng)液更換成干細胞培養(yǎng)液；培養(yǎng)孔內(nèi)每天半量換液，連續(xù)觀察20-28d，直到有細胞集落出現(xiàn)為止，記為0代，即為牛iPSCs。所述的干細胞培養(yǎng)液的組成為每100ml溶液中含有82.69ml的knockout-DMEM、15mlFBS、lml濃度為200mM谷氨酰胺、lml濃度為10mM非必需氨基酸、200yl濃度為55mM13-巰基乙醇、10ii1濃度為400ng/mL人重組堿性成纖維生長因子(bFGF)、100yl濃度為105U/mL白血病抑制因子(LIF)。牛iPSCs傳代時，應(yīng)用0.05%trypsin+0.02%EDTA消化液消化，經(jīng)過中和、離心與重懸再傳代至新的HAM支持物上，在37-381:，5%左右C02，飽和濕度條件下擴增培養(yǎng)，得到牛iPS細胞株。牛iPSCs每隔3-5天傳代一次，目前已經(jīng)傳代120天，超過25代。液氮凍存，解凍后生長活力較好，約有80%-90%存活率。本發(fā)明還有一個目的是提供c-Myc基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pMSCV-c-Myc及在基因基因工程中的應(yīng)用。本發(fā)明還有一個目的是提供Klf4基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pMSCV-Klf4及在基因基因工程中的應(yīng)用。本發(fā)明得到誘導(dǎo)性多能干細胞和其制備方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點1、本發(fā)明中應(yīng)用自主克隆牛的4種維持干細胞多能性關(guān)鍵基因，利用多種基因組合方式，通過干細胞逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)導(dǎo)進入牛皮膚成纖維細胞，使其重編程為完全具有胚胎干細胞生物特性的誘導(dǎo)性多能性干細胞。通過該方法所建立的多株多能型干細胞在體外已經(jīng)傳代超過25代，生長特性均表現(xiàn)正常。凍存與解凍試驗表明，它們?nèi)跃哂辛己玫亩嗄苄浴?、本發(fā)明在培養(yǎng)條件中首次采用脫細胞人羊膜(HAM)作為支持物代替小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)來維持牛iPSCs體外增殖并長期保持未分化的多能性狀態(tài)，而且避免了應(yīng)用小鼠胚胎成纖維細胞作為干細胞的飼養(yǎng)層所帶來的異種動物細胞污染問題。3、本發(fā)明采用基因誘導(dǎo)產(chǎn)生多能性干細胞的方法，解決了家畜特別是牛多能性干細胞難以獲得的技術(shù)難題，為其他動物干細胞建系提供了理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。圖1成年母牛皮膚成纖維細胞(BDFs)50X顯微鏡圖。圖2新生公牛皮膚成纖維細胞(NDFs)50X顯微鏡圖。圖3PT67包裝細胞50X顯微鏡圖。圖4電鏡下逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒10萬倍電鏡圖。圖5集落堿性磷酸酶染色100X顯微鏡圖。圖6集落堿性磷酸酶染色200X顯微鏡圖。圖7SSEA-4明視野顯微鏡圖。圖8SSEA-4染色(+++)顯微鏡圖。圖9TERT明視野顯微鏡圖。圖IOTERT染色(+++)顯微鏡圖。圖11囊腔樣類胚體結(jié)構(gòu)顯微鏡圖。圖12代表外胚層細胞系的13III-Tubulin染色陽顯微鏡圖。圖13代表中胚層細胞系的a-actin染色陽性顯微鏡圖。圖14代表內(nèi)胚層細胞系的甲胎蛋白(a-fetoprotein)染色陽性顯微鏡圖。圖15腺體樣結(jié)構(gòu)(內(nèi)胚層)400X顯微鏡圖。圖16骨骼肌結(jié)構(gòu)(中胚層)400X顯微鏡圖。圖17原始神經(jīng)元結(jié)構(gòu)(外胚層)400X顯微鏡圖。圖18EB的RT-PCR檢測結(jié)果凝膠電泳圖。圖19嵌合體小鼠(雌雄各一只)各組織的PCR檢測結(jié)果凝膠電泳圖。具體實施例方式以下通過申請人給出的獲得牛iPSCs的具體方法以及經(jīng)過多種試驗證明牛iPSCs在集落形態(tài)、生長特性、干細胞表面標(biāo)志、體內(nèi)外分化能力與嵌合體形成等諸多方面都具有與胚胎干細胞相似的生物學(xué)特性。實施例1牛皮膚成纖維細胞的分離與培養(yǎng)成年牛皮膚成纖維細胞(femalebovinedermalfibroblasts,BDFs)分離自成年雌性Holstein奶牛耳緣皮膚。將組織清洗消毒后剪成細小組織塊，在常規(guī)培養(yǎng)條件下，用含15%-20%胎牛血清(FBS)(Gibco公司產(chǎn)品)的高糖DMEM(Gibco公司產(chǎn)品)中培養(yǎng)。每2-3d換養(yǎng)液1次，7-10d后就有成纖維細胞從組織塊邊緣移出，12-16d后大量成纖維細胞緊密排布于組織塊周圍。用胰蛋白酶與EDTA混合消化液液消化后傳代，即獲得大量的成年牛皮膚成纖維細胞，見圖1。新生公牛皮膚成纖維細胞(malenewbornbovinedermalfibroblasts，NDFs)來自Holstein品種新生公牛耳緣皮膚，見圖2，分離和培養(yǎng)方法與上述母牛皮膚成纖維細胞方法相同。為了保證細胞活力，本發(fā)明采用26代以內(nèi)的細胞作為誘導(dǎo)前靶細胞。實施例2牛維持多能性關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄因子的克隆及其逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建從50-60日齡荷斯坦(Holstein)品種奶牛的胎兒體內(nèi)分離生殖嵴，組織勻漿后用TRIzolLSReagent提取總RNA，經(jīng)過DNaseI(RNasefree)處理以除去基因組DNA污染。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。然后以cDNA為模板，分別經(jīng)PCR擴增0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4等4種轉(zhuǎn)錄因子基因開放性閱讀框(0RF)全序列，基因克隆所用引物序列見表l所示。表1擴增牛0ct4，Sox2，c_Myc和Klf4四個基因所用引物信息基因引物序列PCR退火溫度(。C)產(chǎn)物長度(bp)GenBank中參考基因序列號Oct4F:5'-GGAATTCATGGCGGGACACCTCG-3'R:5'-GAAGATCTTCAGTTTGCATGCATAGGGG-3'601083畫_174580Sox2F:5'-CCGGAATTCATGTACAACATGATGGAG-3'R:5'-GAAGATCTTCACATGTGCGAGAGGG-3'54963畫_001105463腿F:5'-GGAATTCATGGCTGTCAGCGACGC-3'R:5'-GGAAGATCTTTAAAAGTGCCTCTTCATGTGTAAG-3'601434畫—001105385c陽MycF:5'~GGAATTCATGCCCCTCAACGTCAG-3'R:5'-GAAGATCTTTAGGCGCAAGAGTTCCGT-3'541320雨_001046074其中0ct4基因PCR擴增時循環(huán)參數(shù)是94。C預(yù)變性5min，94。C變性45sec，60。C退火45sec，72t:延伸lmin，循環(huán)35次，72"C再延伸10min，預(yù)期PCR產(chǎn)物長度應(yīng)為1083bp。Sox2基因的循環(huán)參數(shù)是94。C預(yù)變性5min，94。C變性45sec，54。C退火30sec，72。C延伸lmin，循環(huán)35次，72t:再延伸10min，預(yù)期PCR產(chǎn)物長度應(yīng)為963bp。c-Myc基因的循環(huán)參數(shù)是94t:預(yù)變性4min，94t:變30s，54t:退火lmin，72t:延伸lmin30sec，共30個循環(huán)，72。C再延伸10min，預(yù)期PCR產(chǎn)物長度應(yīng)為1320bp。Klf4基因的循環(huán)參數(shù)是94t:預(yù)變性4min，94t:變30s，6(TC退火lmin，72t:延伸lmin30sec，共30個循環(huán)，72。C再延伸10min，預(yù)期PCR產(chǎn)物長度應(yīng)為1434bp。上述PCR產(chǎn)物各取5iil，在1%瓊脂糖凝膠電泳以鑒定其大小，剩余PCR產(chǎn)物-2(TC保存。電泳檢測結(jié)果顯示，PCR擴增產(chǎn)物長度與預(yù)期奶牛4種轉(zhuǎn)錄因子基因大小完全一致，符合試驗設(shè)計要求。然后將4種PCR產(chǎn)物剩余部分分別經(jīng)過DNA片段GelExtractionkit純化、回收；回收產(chǎn)物與克隆載體pMD18-T以solutionI混合連接，16°C連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞TGI內(nèi)進行克隆。經(jīng)含Ampicillin(80iig/ml)、X-gal與IPTG的LB平板上37。C篩選培養(yǎng)14-16小時。從4種培養(yǎng)物中分別挑取6_10個白色菌落接種含氨芐青霉素(Ampicillin)的LB培養(yǎng)液中小量搖菌，并按照質(zhì)粒抽提試劑盒說明書步驟抽提微量質(zhì)粒。包含0ct4，Sox2，c-Myc，Klf4等4種基因的質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切、單酶切和質(zhì)粒PCR鑒定。四種質(zhì)粒經(jīng)過BglII+EcoRI雙酶切和EcoRI單酶切以及質(zhì)粒PCR鑒定，以獲得pMD-18T-0ct4、pMD-18T-Sox2、pMD-18T-cMyc、pMD-18T-Klf4四種質(zhì)粒的陽性克隆。選送鑒定結(jié)果為陽性的質(zhì)粒到生物公司測序。測序結(jié)果應(yīng)用DNAstart7.10軟件與GenBank中參考序列進行同源性比較分析。分析結(jié)果表明，0ct4，Sox2，c-Myc和Klf4基因序列與參考序列同源性分別為99.4%，99.6%，99.4%和99.3%。將上述測序正確的pMD-18T-0ct4，pMD-18T-Sox2，pMD-18T-cMyc，pMD-18T-Klf4，4種質(zhì)?；厥占兓笈c逆轉(zhuǎn)錄病毒pMSCVneo載體分別經(jīng)過BglII+EcoRI雙酶切后的目的基因片段和線性化pMSCVneo載體。將線性化后反轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCVneo與回收的目的片段用DNALigationKitVersion2.0在16。C連接過夜，14-16小時后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入JM109感受態(tài)細胞，經(jīng)過氨芐青霉素(Ampicillin，50iig/mL)LB平板上篩選出逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒的陽性克隆。從4個培養(yǎng)物板中，每一種重組質(zhì)粒分別挑取6-10個菌落小量搖菌，微量方法提取重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒。經(jīng)過BglII+EcoRI(或者BglII+H即I)雙酶消化鑒定、質(zhì)粒PCR擴增鑒定及測序分析鑒定。4種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切后，都可以獲得已知大小的目的基因片段與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體片段，說明我們所構(gòu)建的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體結(jié)構(gòu)正確。通過測序檢測，所有重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒中所包含的4個目的基因的序列與PCR擴增序列完全一致，也與GenBank中參考序列完全一致，表明在本專利中所構(gòu)建得4種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒過程中目的基因沒有發(fā)生閱讀框的移碼和堿基突變等情況，說明所應(yīng)用的4種基因序列完全正確。本專利中所構(gòu)建的4種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體分別命名為pMSCV-0ct4、pMSCV-Sox2、pMSCV-cMyc和pMSCV-Klf4。實施例3逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝與準(zhǔn)備PT67包裝細胞按照常規(guī)方法培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中，待細胞達到70%_80%匯合時，應(yīng)用脂質(zhì)體將逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染進入包裝細胞PT67細胞，進行病毒包裝以獲得具有感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。轉(zhuǎn)染前1小時，DMEM培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)液，4-8iig逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒DNA和10-20ii1脂質(zhì)體分別加入到500ii1Opti-MEM-I+GlutaMAX-I(Gibco公司產(chǎn)品)優(yōu)化轉(zhuǎn)染液中，輕柔混勻，室溫孵育，然后將稀釋的質(zhì)粒DNA和脂質(zhì)體輕柔混勻，再室溫孵育20分鐘后，將混合液逐滴加入PT67細胞培養(yǎng)皿中。細胞在37°C，5%C02和飽和濕度條件下培養(yǎng)4-6h后，轉(zhuǎn)染液換成新的含15%FBS的DMEM培養(yǎng)液。經(jīng)過24小時轉(zhuǎn)染后，收集PT67細胞培養(yǎng)液上清，該上清中就包含感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。上清液經(jīng)過0.45iim孔徑的濾膜過濾。每24小時收集一次，連續(xù)收集3d。病毒懸浮液在4t:條件下，經(jīng)過25，000轉(zhuǎn)/分，離心90分鐘，10倍濃縮病毒上清液。將0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4四種基因病毒上清液進行等量混合，并添加8iig/mlpolybrene組成特定的四因子基因組合，-8(TC保存，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染牛皮膚成纖維細胞。實施例4逆轉(zhuǎn)錄病毒感染牛皮膚成纖維細胞以及牛的iPS細胞的獲得及傳代將成年牛皮膚成纖維細胞(BDFs)和新生公牛皮膚成纖維細胞(NDFs)按照常規(guī)方法培養(yǎng)在60mm塑料培養(yǎng)皿中接種2X105個細胞，待培養(yǎng)皿中細胞生長到70-80%融合時，將包含0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4基因轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液混合液分別加入到成纖維細胞BDFs與NDFs培養(yǎng)皿中感染成纖維細胞；細胞長滿培養(yǎng)皿后按1:3常規(guī)傳代，視細胞生長情況在第6-10d將細胞以1X105細胞/孔的密度，轉(zhuǎn)移至預(yù)先鋪有人羊膜6孔培養(yǎng)板上，用HAM代替MEF作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)感染后的牛細胞，同時培養(yǎng)液更換成干細胞培養(yǎng)液；培養(yǎng)孔內(nèi)每天半量換液，連續(xù)觀察20-28d，直到有ES細胞樣集落出現(xiàn)為止，記為0代，即為牛iPSCs。牛iPSCs傳代時，應(yīng)用0.05%trypsin+O.02%EDTA消化液消化，經(jīng)過中和、離心與重懸再傳代至新的HAM支持物上，在37-381:，5%左右C02，飽和濕度條件下擴增培養(yǎng)，得到牛iPS細胞株。牛iPSCs每隔3-5天傳代一次，目前已經(jīng)傳代120天，超過25代。液氮凍存，解凍后生長活力較好，大約有85%-90%存活率。干細胞培養(yǎng)液組成為每100ml溶液中含有82.69ml的knockout-DMEM、15mlFBS、lml濃度為200mM谷氨酰胺、lml濃度為10mM非必需氨基酸、200iil濃度為55mMP-巰基乙醇、10ii1濃度為400ng/mL人重組堿性成纖維生長因子(bFGF)、100y1濃度為105U/ml白血病抑制因子(LIF)。試驗例1建立的牛iPSCs系的鑒定為了鑒定本發(fā)明中所建立的牛誘導(dǎo)性多能干細胞(bovineinducedpluripotentstemcells,iPSCs)與傳統(tǒng)意義上胚胎干細胞具有非常類似的生物學(xué)特性，發(fā)明人在多個不同方面設(shè)計鑒定本發(fā)明所建立的牛的iPS細胞，1.作為靶細胞的牛皮膚成纖維細胞形態(tài)，見圖1-2。2.PT67包裝細胞與包裝后的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒形態(tài)，見圖3_4。3.iPSCs集落形態(tài)與AP染色陽性(紅色)鑒定，見圖5-6。4.iPSCs集落的免疫熒光細胞化學(xué)染色鑒定，見圖7-10。5.類胚體的形成于體外分化鑒定利用牛iPSCs體外懸浮培養(yǎng)7天后就可以形成多個球形和囊腔樣類胚體(EmbryoidBody，EB)結(jié)構(gòu)，見圖ll，其中A顯示為球形的類胚體結(jié)構(gòu)，B顯示的是囊腔樣類胚體結(jié)構(gòu)。利用牛iPSCs形成的類胚體(EB)，再經(jīng)過貼壁培養(yǎng)14-21天，并通過添加誘導(dǎo)培養(yǎng)基的方法使其定向分化，形成代表3個胚層的不同細胞形態(tài)。3個胚層代表細胞系，見圖12-14所示。6.畸胎瘤形成與三個胚層細胞的分化將牛iPSCs注射到裸鼠臀部皮下，經(jīng)過6-9周時間發(fā)育，則會在裸鼠注射部位皮下形成腫瘤，即為畸胎瘤。將畸胎瘤采集、固定后制備成組織切片，經(jīng)過化￡.染色后顯微鏡觀察，可以觀察到3個胚層細胞形態(tài)同時存在畸胎瘤中切片，說明牛iPSCs具有發(fā)育的多能性。觀察結(jié)果如下圖15-17所示(箭頭)。另外，對畸胎瘤組織提取總RNA，應(yīng)用三個胚層代表基因引物進行RT-PCR擴增檢測，結(jié)果也顯示了三個胚層細胞的存在，同樣說明所建立的牛iPSCs具有發(fā)育多能性。類胚體三個胚層代表基因的RT-PCR檢測結(jié)果見圖18，圖中泳道l:P-Actin為內(nèi)參;泳道2:Nestin，泳道3:P-tubulin(外胚層)；泳道4:GATA4，泳道5:Actinalpha2(中胚層)；泳道6:Keratin-14，泳道7:PDX-1，泳道8:AFP(內(nèi)胚層)，所用引物見表2。表2.檢測分化細胞代表基因PCR所用引物胚層基因引物序列PCR退火溫度(0C)PCR產(chǎn)物大小歸LoadingcontrolP-Actin5'~caaggacctctacgccaaca-3'5m:tcgatccaaccgactgct-3'54445Keratin-145'"CCAGTCACGGATTTTCACCTC-3'5'-AGCCGCATATCCTCCGTCCT-3'58396EndodermPDX-15'-TGAATGCCAAGGGAGAAG-3'5'^CACCATTGACTTCCACCC-3'54707AFP5'-ccttccgagccataactg-3'5'-CATCGGAGAATOGTGGAG—3'54888MesodermACTA25'"GCCCAGCCGAGAACTTTCAG-3'5'-AGCCAGGTCCAGACGCATGA-3'58597GATA45'"GGACGGGACGGGACACTAC-3'5'-AGCAGAGAGGACCGGGTGG-3'58517Ectodermpill-tubulin5'-AGGCGCTCTACGACATCTGC-3'5'"CCCTCGCCCGTGTACCAGT-3'58529Nestin5'-AGAGGAGAACGCTGAGTCATT-3'5'-TCTGTAGGCTTTAGTGGTTCTG-3'54537試驗例2利用牛iPSCs建立"牛_小鼠"嵌合體把其中一株牛iPSCs通過顯微注射的方法注射入小鼠的8-細胞胚胎或桑椹胚內(nèi)，每個胚胎注射1215個牛iPS細胞，之后移植到假孕鼠的子宮。共注射115枚胚胎，移植給5只假孕鼠，其中一只妊娠，生下6只小鼠。根據(jù)牛的線粒體DNA的D-L00P高變區(qū)序列設(shè)計引物，對其中兩只新生小鼠(雌雄各一只)進行線粒體DNA的D-L00P高變區(qū)PCR擴增檢測，嵌合有牛組織細胞的組織包括有心、肝、脾、肺、腎、血液、血管、睪丸(或卵巢)等多個組織，見圖20，證明這兩只新生小鼠不同組織器官中都嵌合有牛細胞。試驗結(jié)果揭示了我們所建立牛iPS細胞參與了牛_小鼠嵌合體的形成。當(dāng)小鼠8-cel1胚胎中注射入牛iPS細胞制作嵌合體小鼠時，共出生嵌合體小鼠6只，但是，所生6只嵌合體小鼠全身白色皮毛，未發(fā)現(xiàn)有皮毛嵌合。電泳圖19上部分1-17泳道代表嵌合雌性小鼠各組織檢測結(jié)果1心，2肝，3腦，4肺，5腎，6消化道，7肌肉，8脾，9脊髓，10卵巢，11胰，12血液，13皮膚(-)，14受體小鼠(-)，15普通小鼠(_)，16BDF細胞，17BDF-iPS0細胞。牛的線粒體DNA的D-L00P高變區(qū)PCR檢測結(jié)果凝膠電泳圖19所示圖中1_17泳道代表嵌合雄性小鼠各組織檢測結(jié)果1心，2肝，3腦，4肺，5腎，6消化道，7肌肉，8脾，9脊髓，10睪丸，11血液，12軟骨(-)，13皮月夫(-)，14BDF細胞，15BDF-iPS0細胞，16受體小鼠(-)，17普通小鼠(-)?！?10〉西北農(nóng)林科技大學(xué)〈120〉利用轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染牛體細胞成為誘導(dǎo)性多能干細胞的方法〈160>4110092]〈210>10093]〈211>1083bp0094]〈212>DNA0095]〈213>0CT40096]〈400〉10097]0098]0099]0100]0101]0102]0103]0104]0105]0106]0107]0108]0109]0110]0112]0113]0114]0115]TGA0116]〈210>20117]0118]0119]0120]0121]0122]0123]0124]0125]0126]0127]0128]0129]0130]〈211>963bp〈212>DNA〈213>Sox2〈400>2〈211>1320bp〈212>DNA〈213>CMYC〈400>3〈210>4〈211>1434bp〈212>DNA〈213>KLF4〈400>413<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>權(quán)利要求一種利用轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染牛體細胞成為誘導(dǎo)性多能干細胞的方法，包括如下步驟1)牛皮膚成纖維細胞的分離與培養(yǎng)以成年牛皮膚成纖維細胞BDF和新生牛皮膚成纖維細胞NDF，經(jīng)常規(guī)培后養(yǎng)分別獲得大量的成年牛皮膚成纖維細胞和新生牛皮膚成纖維細胞；2)牛維持多能性轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及其逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建從50-60日齡牛胎兒中分離生殖嵴，提取總RNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA；以cDNA為模板，經(jīng)過PCR反應(yīng)得到牛Oct4、Sox2、c-Myc與Klf4四個基因擴增產(chǎn)物并經(jīng)測序驗證序列正確而后將目的基因插入到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCVneo中，構(gòu)建這4種基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體；3)逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝與準(zhǔn)備將PT67包裝細胞按照常規(guī)方法培養(yǎng)在含有15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，應(yīng)用脂質(zhì)體將構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染進入包裝細胞PT67細胞；將8μg含有Oct4、Sox2、c-Myc與Klf4四個不同基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體質(zhì)粒與4份20μl轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體lipofectamine2000分別用500μlOpti-MEM-I+GlutaMAX-I轉(zhuǎn)染優(yōu)化液進行稀釋，輕輕混勻，室溫下孵育5分鐘，然后將含有脂質(zhì)體lipofectamine2000的稀釋液緩慢滴入含有逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒的稀釋液中，輕輕混勻，室溫下再孵育20分鐘后，然后將上述混合液逐滴加入PT67包裝胞培養(yǎng)皿中；轉(zhuǎn)染24小時后，每天更換含逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的培養(yǎng)液一次，連續(xù)3天，收集病毒懸浮液，在4℃條件下經(jīng)25000轉(zhuǎn)/分離心90分鐘后，10倍濃縮病毒上清液；將包含有Oct4、Sox2、c-Myc與Klf4基因病毒上清液進行等量混合，并加入8μg/mlPolybrene組成特定的四因子基因組合，-80℃保存?zhèn)溆茫?)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染牛皮膚成纖維細胞以及牛的iPS細胞的獲得將成年牛皮膚成纖維細胞BDFs和新生公牛皮膚成纖維細胞NDFs按照常規(guī)方法培養(yǎng)在60mm塑料培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)皿中細胞生長到70-80％融合時將包含Oct4、Sox2、c-Myc與Klf4基因轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液的混合液分別加入到成纖維細胞BDFs與NDFs培養(yǎng)皿中感染成纖維細胞；細胞長滿培養(yǎng)皿后按1∶3常規(guī)傳代，視細胞生長情況在第6-10d將細胞以1×105細胞/孔的密度，轉(zhuǎn)移至預(yù)先鋪有人羊膜(HAM)6孔培養(yǎng)板上，作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)感染后的牛細胞，同時培養(yǎng)液更換成干細胞培養(yǎng)液；培養(yǎng)孔內(nèi)每天半量換液，連續(xù)觀察20-28d，直到有細胞集落出現(xiàn)為止，記為0代，即為牛iPSCs。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在應(yīng)用脂質(zhì)體包裝病毒顆粒前1小時，將包裝細胞PT67的培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)液，4_8yg包含有轉(zhuǎn)錄因子基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒DNA和10-20ii1脂質(zhì)體分別加入到2份500ii1Opti-MEM-I+GlutaMAX-I優(yōu)化轉(zhuǎn)染液中，輕柔混勻，室溫孵育，然后將稀釋的質(zhì)粒DNA和脂質(zhì)體輕柔混勻，再室溫孵育20分鐘后，將質(zhì)粒_脂質(zhì)體混合液逐滴加入PT67細胞培養(yǎng)皿中。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的干細胞培養(yǎng)液的組成為每100ml溶液中含有82.69ml的knockout-DMEM、15mlFBS、lml濃度為200mM谷氨酰胺、lml濃度為10mM非必需氨基酸、200ii1濃度為55mMP-巰基乙醇UOy1濃度為400ng/ml人重組堿性成纖維生長因子、100iU濃度為105U/mL白血病抑制因子。4.權(quán)利要求1所述c-Myc基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pMSCV-c-Myc。5.權(quán)利要求4所述重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pMSCV-c-Myc在基因基因工程中的應(yīng)用。6.權(quán)利要求1所述Klf4基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pMSCV-Klf4。7.權(quán)利要求6所述重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pMSCV-Klf4在基因基因工程中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種利用轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染牛體細胞產(chǎn)生誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)的方法，具體包括下列步驟1)牛皮膚成纖維細胞的分離與培養(yǎng)；2)牛維持多能性基因轉(zhuǎn)錄因子的克隆及其逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建；3)逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝與準(zhǔn)備；4)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染牛皮膚成纖維細胞以及牛的誘導(dǎo)性多能干細胞的獲得。本發(fā)明首次采用脫細胞后人羊膜作為支持物代替小鼠胚胎成纖維細胞來維持牛iPSCs體外增殖并長期保持未分化的多能性狀態(tài)。這種采用基因誘導(dǎo)產(chǎn)生多能性干細胞的方法，不但解決了動物特別是如牛、羊、豬等家畜多能性干細胞難以獲得的技術(shù)難題，而且避免了應(yīng)用鼠胚胎成纖維細胞作為干細胞的飼養(yǎng)層所帶來的異種動物細胞污染問題。文檔編號C12N15/867GK101705248SQ20091021898公開日2010年5月12日申請日期2009年11月16日優(yōu)先權(quán)日2009年11月16日發(fā)明者呂長榮,竇忠英,辛?xí)粤?陳冬梅申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)