專利名稱：一種細(xì)胞長期培養(yǎng)保存三維系統(tǒng)及相關(guān)的細(xì)胞長期培養(yǎng)保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及細(xì)胞培養(yǎng)保存方法技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種細(xì)胞 長期培養(yǎng)保存三維系統(tǒng)及相關(guān)的細(xì)胞長期培養(yǎng)保存方法。
背景技術(shù)：
目前主要用液氮長期保存細(xì)胞，其操作過程主要是常規(guī)消化收集細(xì)胞后，用凍存液懸浮 細(xì)胞后密封，在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞信息，之后進(jìn)入程序性降溫過程，即細(xì)胞先后經(jīng)歷4°C、 -20°C、 -80°C、液氮。降溫過程操作繁瑣，耗時(shí)較長，且降溫過程中細(xì)胞的損傷較大，易造 成細(xì)胞破裂死亡。細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)時(shí)，先后經(jīng)歷37。C水浴融解，之后離心或直接接種于培養(yǎng)皿 培養(yǎng)。
常規(guī)的細(xì)胞保種方法要經(jīng)歷繁瑣的細(xì)胞凍存及復(fù)蘇培養(yǎng)，整個(gè)過程操作繁瑣，歷時(shí)較長， 人力及物力成本高，用此種方法得到的細(xì)胞經(jīng)常出現(xiàn)細(xì)胞密度小，細(xì)胞活力低，要經(jīng)過2-3 天的適應(yīng)性培養(yǎng)才能用于實(shí)驗(yàn)研究。
由于常規(guī)細(xì)胞保存方法存在上述缺陷，因此，需要一種新的細(xì)胞保存方法，其細(xì)胞保存 操作簡^_、成本低、細(xì)^>活力高、可立即使用，^v而可以大大加快試-瞼研究或工業(yè)化生產(chǎn)的 進(jìn)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服了上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供一種細(xì)胞長期培養(yǎng)保存三維系統(tǒng)及 相關(guān)的細(xì)胞長期培養(yǎng)保存方法，該細(xì)胞長期培養(yǎng)保存三維系統(tǒng)設(shè)計(jì)巧妙、結(jié)構(gòu)簡單，相關(guān)的 細(xì)胞長期培養(yǎng)保存方法操作簡便、成本低、細(xì)胞活力高、可立即使用，從而可以大大加快試 驗(yàn)研究或工業(yè)化生產(chǎn)的進(jìn)展，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種細(xì)胞長期培養(yǎng)保存三維系統(tǒng)，其 特點(diǎn)是，包括三維支架和液體培養(yǎng)基或維持培養(yǎng)液，所述三維支架浸泡在所述液體培養(yǎng)基或 所述維持培養(yǎng)液中，所述三維支架為生物相容性材料制成，其上分布有許多孔洞，所述孔洞 大于所要培養(yǎng)的細(xì)胞。
本發(fā)明具體使用的三維支架為圓柱形，當(dāng)然也可以為其它形狀，有多種規(guī)格可以放置在%孔及12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。本發(fā)明具體使用的三維支架是由細(xì)小的纖維、間隙和孔洞組成， 氧氣、激素和營養(yǎng)成分得以通過，而廢物可以從里面過濾出來。本發(fā)明具體使用的三維支架 生物相容性好，并且徹底解決了孔聯(lián)通性不好、孔不均一等技術(shù)難題，能很好地支持細(xì)胞的增殖。
較佳地，所迷三維支架為可降解支架或不可降解支架。 較佳地，所述孔洞的孔徑為200pm-500pm。
現(xiàn)成的三維支架材料是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域組織工程中所指的生物材料，它是種子細(xì)胞形成組 織之前賴以生存和依附的三維支架，它能將細(xì)胞固定于一定的位置，為其生長，繁殖，新陳 代謝及細(xì)胞外基質(zhì)分泌等生理活動(dòng)提供場所，三維支架各孔間的連通性可以保證培養(yǎng)液與細(xì) 胞的充分接觸，有利于細(xì)胞與培養(yǎng)液的物質(zhì)交換，并引導(dǎo)再生組織形成基本形狀，因此具有 良好的生物相容性。本發(fā)明中使用的三維支架可以為細(xì)胞生長提供空間，它包括可降解和非 可降解三維支架。利用三維支架培養(yǎng)原代細(xì)胞或干細(xì)胞用于組織工程，可以選擇可降解三維 支架。利用三維支架培養(yǎng)癌細(xì)胞或工程細(xì)胞用于普通實(shí)驗(yàn)研究或工業(yè)化生產(chǎn)可以選擇非可降 解三維支架。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種細(xì)胞長期培養(yǎng)保存方法，其特點(diǎn)是，采用上述的細(xì)胞 長期培養(yǎng)保存三維系統(tǒng)，用所述三維支架將所述細(xì)胞在所述液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)并傳代； 或，用所述三維支架將所述細(xì)胞在所述維持培養(yǎng)液中進(jìn)行維持培養(yǎng)。
較佳地，所述細(xì)胞是人肝癌細(xì)胞HepG2、中國倉鼠卯巢細(xì)胞CHO、原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì) 胞HUVEC或人羊水間充干細(xì)胞；相應(yīng)的，所述液體培養(yǎng)基是高糖DMEM培養(yǎng)基、無血清培 養(yǎng)基；ECM培養(yǎng)基或MEM-a培養(yǎng)基；所述維持培養(yǎng)基是低血清濃度的高糖DMEM培養(yǎng)基， 低營養(yǎng)添加劑的無血清培養(yǎng)基，低血清濃度的ECM培養(yǎng)基或MEM-a培養(yǎng)基。
較佳地，所述培養(yǎng)是將所述三維支架在所述液體培養(yǎng)基中進(jìn)行浸泡，然后將所述細(xì)胞接 種于所述三維支架，接著37。C恒溫振蕩，然后再放入C02培養(yǎng)箱37。C常規(guī)培養(yǎng)。
更佳地，所述浸泡在37。C的C02培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行2小時(shí)；所述細(xì)胞接種的密度為 2xl05cells/ml;所述恒溫振蕩采用的轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，使用的時(shí)間為4小時(shí)。
較佳地，所述傳代是將所述液體培養(yǎng)基吸出，用磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞后，用胰蛋白酶 部分消化所述三維支架上粘附的所述細(xì)胞，消化完畢，所述三維支架用新的磷酸鹽緩沖液沖 洗后放入新的培養(yǎng)皿內(nèi)，添加新鮮液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
更佳地，所述胰蛋白酶為0.05%的含EDTA的胰蛋白酶。
更佳地，在所述傳代步驟的最后，用所述維持培養(yǎng)液代替所述新鮮液體培養(yǎng)基從而維持
4培養(yǎng)所述三維支架上粘附的所述細(xì)胞。
本發(fā)明的細(xì)胞長期培養(yǎng)保存三維系統(tǒng)可以用于人肝癌細(xì)胞，中國倉鼠卵巢細(xì)胞，人臍靜 脈內(nèi)皮細(xì)胞及羊水間充干細(xì)胞的培養(yǎng)和保存，也可以用于組織工程，還可以用于實(shí)驗(yàn)研究及 制備生物制劑。利用本發(fā)明按上述方法可以培養(yǎng)出大量形態(tài)典型，活力高的人肝癌細(xì)胞用于 實(shí)驗(yàn)研究。按照上述方法培養(yǎng)干細(xì)胞可以誘導(dǎo)出多種人造組織，為組織工程提供原材料。同 樣按照上述方法培養(yǎng)CHO等工程細(xì)胞，可以提取更多的細(xì)胞產(chǎn)物。
本發(fā)明的有益效果具體如下
1. 本發(fā)明釆用細(xì)胞長期培養(yǎng)保存三維系統(tǒng)長期培養(yǎng)保存細(xì)胞，設(shè)計(jì)巧妙，操作筒便、 成本低、細(xì)胞活力高、可立即使用，從而可以大大加快試驗(yàn)研究或工業(yè)化生產(chǎn)的進(jìn) 展，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用；
2. 本發(fā)明的細(xì)胞長期培養(yǎng)保存三維系統(tǒng)采用的三維支架可以在相對(duì)固定的空間內(nèi)給細(xì) 胞提供更廣闊的生長空間，且為細(xì)胞提供三維支持作用，細(xì)胞能夠在支架材料上呈 三維立體生長，細(xì)胞不僅形態(tài)典型，密度大，且生物活性或蛋白表達(dá)量強(qiáng)；
3. 本發(fā)明的細(xì)胞長期培養(yǎng)保存三維系統(tǒng)采用的三維支架的各孔的連通性保證了培養(yǎng)液 可以均勻地為細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，提高營養(yǎng)物與氧氣之間的供應(yīng)距離，使細(xì) 胞得到的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣更加豐富；
4. 本發(fā)明利用細(xì)胞長期培養(yǎng)保存三維系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞，可以降低培養(yǎng)成本。與平面培養(yǎng) 相比，在同規(guī)格培養(yǎng)容器內(nèi)，使用同樣的培養(yǎng)液可以收獲更多量的細(xì)胞；
5. 本發(fā)明利用細(xì)胞長期培養(yǎng)保存三維系統(tǒng)培養(yǎng)原代細(xì)胞及干細(xì)胞，可以更好地保持細(xì) 胞的原始狀態(tài)，不分化；
6. 本發(fā)明使用細(xì)胞長期培養(yǎng)保存三維系統(tǒng)長期保存細(xì)胞，可以減少常規(guī)細(xì)胞凍存復(fù)蘇 的繁瑣程序，避免細(xì)胞反復(fù)凍存復(fù)蘇給細(xì)胞造成的傷害，同時(shí)縮短細(xì)胞準(zhǔn)備周期， 為實(shí)驗(yàn)研究尤其是大規(guī)模生產(chǎn)節(jié)約寶貴的時(shí)間。從三維支架上消化下來的細(xì)胞可以 直接用于實(shí)驗(yàn)研究或大規(guī)模生產(chǎn)，不需要經(jīng)過常規(guī)凍存復(fù)蘇程序中細(xì)胞適應(yīng)性培養(yǎng)；
7. 本發(fā)明利用細(xì)胞長期培養(yǎng)保存三維系統(tǒng)長期培養(yǎng)并保存細(xì)胞，短期內(nèi)不使用細(xì)胞時(shí) 可以用維持培養(yǎng)液長期維持細(xì)胞存活狀態(tài)。


圖1是本發(fā)明的細(xì)胞長期培養(yǎng)保存三維系統(tǒng)的一具體實(shí)施例的三維支架的局部示意圖； 圖2是采用圖1所示的三維支架接種人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞的局部示意5圖3是采用圖1所示的三維支架培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞的局部示意圖； 圖4是平面培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞H印G2細(xì)胞的局部示意圖。
具體實(shí)施例方式
為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實(shí)施例詳細(xì)說明。
實(shí)施例1長期培養(yǎng)保存人肝癌細(xì)胞H印G2
1. 將三維支架(3D Biotek公司的PCL多孔支架，孔徑200inm-50(Vm )浸入高糖DMEM 液體培養(yǎng)基后，置于37°C 5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置2小時(shí)；
2. 將常規(guī)細(xì)胞消化收集的人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2xl05cells/ml接 種于浸泡好的三維支架中(請(qǐng)參見圖2所示)；
3. 將接種有細(xì)胞的三維支架系統(tǒng)置于恒溫?fù)u床內(nèi)，設(shè)置參數(shù)為37°C 200轉(zhuǎn)/分鐘，恒 溫振蕩4小時(shí)后，放入37°C 5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；
4. 待細(xì)胞長至對(duì)數(shù)增長期(請(qǐng)參見圖3所示)時(shí)，0.05%胰酶(含EDTA )消化細(xì)胞。 具體步驟為
(1 )吸棄舊的培養(yǎng)液，用PBS小心沖洗粘附有細(xì)胞的三維支架；
(2)沖洗后的三維支架置入新的同規(guī)格的培養(yǎng)容器內(nèi)加入適量胰酶，37。C消化 10min后輕輕振蕩培養(yǎng)皿；
(3 )加入培養(yǎng)液終止消化，將消化下來的細(xì)胞收集于離心管中，200g離心5min;
(4) 棄掉離心上清，用新鮮的培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度后接種于合適的 培養(yǎng)容器內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)或直接用于實(shí)驗(yàn)研究；
(5) 原有的三維支架上仍有許多細(xì)胞未被消化下來(完全消化三維支架上的細(xì)胞 要胰酶消化4-5次，10min/次)，將殘存有細(xì)胞的三維支架用PBS小心沖洗后置入新的 同規(guī)格的培養(yǎng)容器內(nèi)，加入新鮮高糖DMEM培養(yǎng)液，37°C 5。/。C02的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 如短期內(nèi)不使用該細(xì)胞，則換成低血清高糖DMEM維持培養(yǎng)液維持培養(yǎng)細(xì)胞。
實(shí)施例2直接接種三維支架后加維持培養(yǎng)液維持培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞H印G2
1 、將三維支架(3D Biotek公司的PCL多孔支架，孔徑200nm-500nm)浸入低血清高 糖DMEM液體培養(yǎng)基后，置于37。C 5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置2小時(shí)；2、 將常規(guī)細(xì)胞消化收集的人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2xl05cells/ml接
種于浸泡好的三維支架中；
3、 將接種有細(xì)胞的三維支架系統(tǒng)置于恒溫?fù)u床內(nèi)，設(shè)置參數(shù)為37°C 200轉(zhuǎn)/分鐘，恒
溫振蕩4小時(shí)后，放入37。C 5。/。C02的培養(yǎng)箱內(nèi)維持培養(yǎng)。
實(shí)施例3長期培養(yǎng)保存中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO
1. 將三維支架(BD公司的3D磷酸鈣多孔支架，孔徑200i^m-500(im)浸入含有營養(yǎng) 添加劑的無血清液體培養(yǎng)基后，置于37°C 5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置2小時(shí)；
2. 將常規(guī)細(xì)胞消化收集的中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2xl05cells/ml 接種于浸泡好的三維支架中；
3. 將接種有細(xì)胞的三維支架系統(tǒng)置于恒溫?fù)u床內(nèi)，設(shè)置參數(shù)為37°C 200轉(zhuǎn)/分鐘，恒
溫振蕩4小時(shí)后，放入37。C 5%(302的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；
4. 待細(xì)胞長至對(duì)數(shù)增長期時(shí)，0.05%胰酶(含EDTA)消化細(xì)胞。具體步驟為
(1) 吸棄舊的培養(yǎng)液，200g離心5min后收集細(xì)胞；
(2) 同時(shí)用PBS小心沖洗粘附有細(xì)胞的三維支架，沖洗后的三維支架置入新的同 規(guī)格的培養(yǎng)容器內(nèi)加入適量胰酶，37°C消化lOmin后輕輕振蕩培養(yǎng)皿；
(3 )加入培養(yǎng)液終止消化，將消化下來的細(xì)胞收集于離心管中，200g離心5min;
(4)棄掉離心上清，用新鮮的無血清培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，并將此次收集的細(xì)胞與步 驟(1 )收集的細(xì)胞合并后調(diào)整細(xì)胞密度接種于合適的培養(yǎng)容器內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)或直接用于 實(shí)驗(yàn)研究。
實(shí)施例4直接接種三維支架后加維持培養(yǎng)液維持培養(yǎng)中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO
1. 將三維支架(BD公司的3D磷酸鈣多孔支架，孔徑200pm-50(Vm)浸入低營養(yǎng)添 加劑的無血清液體培養(yǎng)基后，置于37°C 5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置2小時(shí)；
2. 將常規(guī)細(xì)胞消化收集的中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2xl05cells/ml
接種于浸泡好的三維支架中；
3. 將接種有細(xì)胞的三維支架系統(tǒng)置于恒溫?fù)u床內(nèi)，設(shè)置參數(shù)為37°C 200轉(zhuǎn)/分鐘，恒溫振蕩4小時(shí)后，放入37°C 5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)維持培養(yǎng)。
實(shí)施例5長期培養(yǎng)保存人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC
1. 將三維支架(InVitrogen公司的AlgiMatrix三維支架，孔徑200lam-500pm )(浸入 ECM液體培養(yǎng)基后，置于37°C 5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置2小時(shí)；
2. 將常規(guī)細(xì)胞消化收集的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC，調(diào)整細(xì)胞密度為2xl05cells/ml 接種于浸泡好的三維支架中；
3. 將接種有細(xì)胞的三維支架系統(tǒng)置于恒溫?fù)u床內(nèi)，設(shè)置參數(shù)為37°C 200轉(zhuǎn)/分鐘，恒
溫振蕩4小時(shí)后，放入37。C 5。/。C02的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；
4. 待細(xì)胞長至對(duì)^:增長期時(shí)，0.05%胰酶(含EDTA)消4匕細(xì)胞。具體步驟為
(1 )吸棄舊的培養(yǎng)液，用PBS小心沖洗粘附有細(xì)胞的三維支架；
(2)沖洗后的三維支架置入新的同規(guī)格的培養(yǎng)容器內(nèi)加入適量胰酶，37。C消化 10min后輕輕振蕩培養(yǎng)m;
(3 )加入培養(yǎng)液終止消化，將消化下來的細(xì)胞收集于離心管中，200g離心5min;
(4)棄掉離心上清，用新鮮的培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度后接種于合適的 培養(yǎng)容器內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)或直接用于實(shí)驗(yàn)研究；
(5 )原有的三維支架上仍有許多細(xì)胞未被消化下來(完全消化三維支架上的細(xì)胞 要胰酶消化4-5次，10min/次)，將殘存有細(xì)胞的三維支架用PBS小心沖洗后置入新的 同規(guī)格的培養(yǎng)容器內(nèi)，加入新鮮ECM培養(yǎng)液，37°C 5。/。C02的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。如短期 內(nèi)不使用該細(xì)胞，則換成低血清ECM維持培養(yǎng)液維持培養(yǎng)細(xì)胞。
實(shí)施例6直接接種三維支架后加維持培養(yǎng)液維持培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC
1. 將三維支架(InVitrogen公司的AlgiMatrix三維支架，孔徑200(im-500(am )浸入低
血清的ECM液體培養(yǎng)基后，置于37°C 5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置2小時(shí)；
2. 將常規(guī)細(xì)胞消化收集的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC，調(diào)整細(xì)胞密度為2xl05cells/ml
接種于浸泡好的三維支架中；
3. 將接種有細(xì)胞的三維支架系統(tǒng)置于恒溫?fù)u床內(nèi)，設(shè)置參數(shù)為37°C 200轉(zhuǎn)/分鐘，恒
溫振蕩4小時(shí)后，放入37°C 5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)維持培養(yǎng)。
8實(shí)施例7長期培養(yǎng)保存人羊水間充干細(xì)胞
1 、將三維支架(BioHermes的三維支架，孔徑200nm-500nm)浸入MEM-a液體培養(yǎng) 基后，置于37。C 5%<:02的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置2小時(shí)；
2、 將常規(guī)細(xì)胞消化收集的人羊水間充干細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2xl()Scells/ml接種于浸 泡好的三維支架中；
3、 將接種有細(xì)胞的三維支架系統(tǒng)置于恒溫?fù)u床內(nèi)，設(shè)置參數(shù)為37°C 200轉(zhuǎn)/分鐘，恒 溫振蕩4小時(shí)后，放入37。C 5。/。C02的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；
4、 待細(xì)胞長至對(duì)數(shù)增長期時(shí)，0.05%胰酶(含EDTA)消化細(xì)胞。具體步驟為
(1 )吸棄舊的培養(yǎng)液，用PBS小心沖洗粘附有細(xì)胞的三維支架；
(2)沖洗后的三維支架置入新的同規(guī)格的培養(yǎng)容器內(nèi)加入適量胰酶，37。C消化 10min后輕輕振蕩培養(yǎng)皿；
(3 )加入培養(yǎng)液終止消化，將消化下來的細(xì)胞收集于離心管中，200g離心5min;
(4) 棄掉離心上清，用新鮮的培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度后接種于合適的 培養(yǎng)容器內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)或直接用于實(shí)驗(yàn)研究；
(5) 原有的三維支架上仍有許多細(xì)胞未被消化下來(完全消化三維支架上的細(xì)胞 要胰酶消化4-5次，10min/次)，將殘存有細(xì)胞的三維支架用PBS小心沖洗后置入新的 同規(guī)格的培養(yǎng)容器內(nèi)，加入新鮮MEM-a培養(yǎng)液，37°C 5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。如短 期內(nèi)不使用該細(xì)胞，則換成低血清MEM-a維持培養(yǎng)液維持培養(yǎng)細(xì)胞。
實(shí)施例8直接接種三維支架后加維持培養(yǎng)液維持培養(yǎng)人羊水間充干細(xì)胞
1、 將三維支架(BioHermes的三維支架，孔徑200|imi-500nm )浸入低血清的MEM-a 液體培養(yǎng)基后，置于37。C 5。/。C02的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置2小時(shí)；
2、 將常規(guī)細(xì)胞消化收集的人羊水間充干細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2xlC)Scells/ml接種于浸 泡好的三維支架中；
3、 將接種有細(xì)胞的三維支架系統(tǒng)置于恒溫?fù)u床內(nèi)，設(shè)置參數(shù)為37°C 200轉(zhuǎn)/分鐘，恒 溫振蕩4小時(shí)后，放入37'C 5%0)2的培養(yǎng)箱內(nèi)維持培養(yǎng)。
9在上述實(shí)施例中，本發(fā)明根據(jù)細(xì)胞長期培養(yǎng)保存三維系統(tǒng)，采用不同細(xì)胞使用不同的培 養(yǎng)基共同驗(yàn)證同一目的即三維立體式長期培養(yǎng)細(xì)胞，替代常規(guī)細(xì)胞凍存復(fù)蘇保種方法，并體 現(xiàn)新型細(xì)胞保種方法的優(yōu)越性。
由于三維支架系統(tǒng)可以更好地模擬體內(nèi)細(xì)胞生長的微環(huán)境，有利于保持細(xì)胞的原始狀態(tài) 并且能維持細(xì)胞高增殖、低死亡和增加細(xì)胞產(chǎn)物的分泌等特性，促進(jìn)細(xì)胞的分裂增殖及細(xì)胞 間的信號(hào)傳遞。因此細(xì)胞在該系統(tǒng)中生長，不僅增值速度快，形態(tài)典型且能保持很高的細(xì)胞 活性，同時(shí)避免了常規(guī)細(xì)胞凍存復(fù)蘇操作給細(xì)胞帶來的復(fù)蘇后細(xì)胞密度小，活性低，形態(tài)改 變等損傷。請(qǐng)參見圖3所示，采用本發(fā)明的方法長期培養(yǎng)保存的人肝癌細(xì)胞HepG2，增值速 度快，形態(tài)典型且能保持4艮高的細(xì)胞活性，細(xì)胞消化后臺(tái)盼藍(lán)染色證明細(xì)胞活力達(dá)95%以上， 不需適應(yīng)性培養(yǎng)即可立即用于實(shí)-瞼研究或工業(yè)化生產(chǎn)，具有平面培養(yǎng)無可比擬的優(yōu)勢。
綜上，本發(fā)明的細(xì)胞長期培養(yǎng)保存三維系統(tǒng)設(shè)計(jì)巧妙、結(jié)構(gòu)簡單，相關(guān)的細(xì)胞長期培養(yǎng) 保存方法操作簡便、成本低、細(xì)胞活力高、可立即使用，從而可以大大加快試驗(yàn)研究或工業(yè) 化生產(chǎn)的進(jìn)展，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
在此說明書中，本發(fā)明已參照其特定的實(shí)施例作了描述。但是，很顯然仍可以作出各種 修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說明書和附圖應(yīng)被認(rèn)為是說明性的而非限 制性的。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞長期培養(yǎng)保存三維系統(tǒng)，其特征在于，包括三維支架和液體培養(yǎng)基或維持培養(yǎng)液，所述三維支架浸泡在所述液體培養(yǎng)基或所述維持培養(yǎng)液中，所述三維支架為生物相容性材料制成，其上分布有許多孔洞，所述孔洞大于所要培養(yǎng)的細(xì)胞。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的細(xì)胞長期培養(yǎng)保存三維系統(tǒng)，其特征在于，所述三維支架為可降解 支架或不可降解支架。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的細(xì)胞長期培養(yǎng)保存三維系統(tǒng)，其特征在于，所述孔洞的孔徑為 200,-500拜。
4. 一種細(xì)胞長期培養(yǎng)保存方法，其特征在于，采用根據(jù)權(quán)利要求l所迷的細(xì)胞長期培養(yǎng)保存 三維系統(tǒng)，用所述三維支架將所述細(xì)胞在所述液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)并傳代；或，用所述 三維支架將所述細(xì)胞在所述維持培養(yǎng)液中進(jìn)行維持培養(yǎng)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞長期培養(yǎng)保存方法，其特征在于，所述細(xì)胞是人肝癌細(xì)胞 HepG2、中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO、原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC或人羊水間充干細(xì)胞； 相應(yīng)的，所述液體培養(yǎng)基是高糖DMEM培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基；ECM培養(yǎng)基或MEM-a培 養(yǎng)基；所述維持培養(yǎng)液是低血清濃度的高糖DMEM培養(yǎng)基，低營養(yǎng)添加劑的無血清培養(yǎng)基， 低血清濃度的ECM培養(yǎng)基或MEM-a培養(yǎng)基。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞長期培養(yǎng)保存方法，其特征在于，所述培養(yǎng)是將所述三維支架 在所述液體培養(yǎng)基中進(jìn)行浸泡，然后將所迷細(xì)胞接種于所述三維支架，接著37。C恒溫振蕩， 然后再放入C02培養(yǎng)箱37。C常規(guī)培養(yǎng)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞長期培養(yǎng)保存方法，其特征在于，所述浸泡在37'C的C02培養(yǎng) 箱內(nèi)進(jìn)行2小時(shí)；所述細(xì)胞接種的密度為2xl()Scells/ml;所述恒溫振蕩采用的轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/ 分鐘，使用的時(shí)間為4小時(shí)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞長期培養(yǎng)保存方法，其特征在于，所述傳代是將所述液體培養(yǎng) 基吸出，用磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞后，用胰蛋白酶部分消化所述三維支架上粘附的所述細(xì) 胞，消化完畢，所述三維支架用新的磷酸鹽緩沖液沖洗后放入新的培養(yǎng)皿內(nèi)，添加新鮮液 體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞長期培養(yǎng)保存方法，其特征在于，所述胰蛋白酶為0.05%的含 EDTA的胰蛋白酶。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞長期培養(yǎng)保存方法，其特征在于，在所述傳代步驟的最后，用 所述維持培養(yǎng)液代替所述新鮮液體培養(yǎng)基從而維持培養(yǎng)所述三維支架上粘附的所述細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞長期培養(yǎng)保存三維系統(tǒng)，包括三維支架和液體培養(yǎng)基或維持培養(yǎng)液，三維支架浸泡在液體培養(yǎng)基或維持培養(yǎng)液中，所述三維支架為生物相容性材料制成，其上分布有許多孔洞，所述孔洞大于所要培養(yǎng)的細(xì)胞，較佳地，三維支架為可降解支架或不可降解支架，孔洞的孔徑為200μm-500μm，設(shè)計(jì)巧妙、結(jié)構(gòu)簡單，還提供了采用上述細(xì)胞長期培養(yǎng)保存三維系統(tǒng)長期培養(yǎng)保存細(xì)胞的方法，用三維支架將細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)并傳代；或，用三維支架將細(xì)胞在維持培養(yǎng)液中進(jìn)行維持培養(yǎng)，該細(xì)胞長期培養(yǎng)保存方法操作簡便、成本低、細(xì)胞活力高、可立即使用，從而可以大大加快試驗(yàn)研究或工業(yè)化生產(chǎn)的進(jìn)展，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12M3/00GK101643703SQ200910194729
公開日2010年2月10日 申請(qǐng)日期2009年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月28日
發(fā)明者劉東旭, 震 雷 申請(qǐng)人:雷 震;劉東旭