專利名稱：：一種多粘類芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種類芽孢桿菌，尤其涉及一種多粘類芽孢桿菌(Paenibacillusmacerans)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：作物細菌性青枯病是由茄科勞爾氏菌(Ralstoniasolanacear咖)(俗稱青枯菌)引起的一種系統(tǒng)侵染的毀滅性土傳病害，俗稱"植物瘟病"。發(fā)病作物莖葉萎蔫下垂至全株枯死，一般田塊的發(fā)病率為10%_15%，重病田的發(fā)病率高達80%_99%，導(dǎo)致作物產(chǎn)量的嚴重下降，甚至絕收。病原的寄主范圍廣泛，可侵染44個科的數(shù)百種植物，包括蕃茄、茄子、煙草、花生、馬鈴薯、香蕉等。雖然不同植物在不同環(huán)境條件下的癥狀和危害程度表現(xiàn)若干差異，但共同特點是細菌從植株根部侵入，通過增殖和一系列生化活動損壞寄主維管束輸導(dǎo)組織，導(dǎo)致植株失水枯萎，死亡。迄今為止，通過采用抗青枯的作物品種去防治青枯病的做法是很少的，因為已出現(xiàn)的品種不僅抗性低而且抗性容易喪失，其他的農(nóng)業(yè)防治手段因受地域條件的限制，也難以大面積推廣?；瘜W(xué)防治上，雖然有農(nóng)用鏈霉素、銅制劑等藥物的出現(xiàn)，但均不是針對青枯病的防治農(nóng)藥，而且防效差，不穩(wěn)定，病原菌極易產(chǎn)生抗藥性，因此市場上尚無防治植物青枯病的有效藥劑。目前世界上普遍認為生物防治是解決土傳病害最有希望的途徑之一。所以，本領(lǐng)域技術(shù)人員迫切需要能夠有效防治植物青枯病的新的微生物制劑和方法的出現(xiàn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種防治植物青枯病的多粘類芽孢桿菌，該菌株可在離體條件下對青枯菌不同生化型菌株的生長產(chǎn)生抑制作用。—種防治植物青枯病的多粘類芽孢桿菌菌株，經(jīng)鑒定命名為多粘類芽胞桿菌(Paenibacilluspolymyxa)ZJU0901，保藏于位于武漢市珞珈山武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日期為2009年7月19日，保藏號為CCTCCN0:M209157。其主要形態(tài)及生物學(xué)特征如下細胞呈桿狀，革蘭氏染色陽性，以周生鞭毛運動。在膨大胞囊內(nèi)有橢圓形芽孢，在營養(yǎng)瓊脂上無可溶性色素。兼性厭氧。在培養(yǎng)基上的菌落薄，呈星狀擴展，菌量多而粘，表面無光澤。生長物會粘連到培養(yǎng)基上。生長最適溫度28-30°C，生長溫度范圍為15-50°C。生長最適pH為7.0，生長pH范圍為5.6_8.5。本發(fā)明還提供了一種含有上述多粘類芽胞桿菌ZJU0901的菌懸液，制備該菌懸液可以選用任意細菌培養(yǎng)基，優(yōu)選采用NB培養(yǎng)基，其有效菌(多粘類芽胞桿菌ZJU0901)含量優(yōu)選為107108CFU/ml，可以直接應(yīng)用于防治植物青枯病。本發(fā)明提供了一種無菌濾液，通過如下方法制備取含多粘類芽胞桿菌ZJU0901的菌懸液，離心后取上清液，上清液經(jīng)微孔濾膜過濾即為無菌濾液。本發(fā)明提供了一種抗菌蛋白粗提液，通過如下方法制備取含多粘類芽胞桿菌ZJU0901的菌懸液，離心后取上清液，上清液經(jīng)微孔濾膜過濾得到無菌濾液，將乙醇加入無菌濾液中進行沉淀，將沉淀溶于緩沖溶液中即得抗菌蛋白粗提液。優(yōu)選地，所述無水乙醇與菌懸液體積比為i:i，具有最大的抑菌活性。優(yōu)選地，所述緩沖溶液優(yōu)選為Tris緩沖液，當(dāng)然也可以選擇其它緩沖溶液，只要不會使抗菌蛋白變性即可，pH在6.08.0之間。本發(fā)明還提供了多粘類芽胞桿菌ZJU0901在防治植物青枯病中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述的植物為蕃茄、茄子、煙草、花生、馬鈴薯或香蕉。因為這些植物的青枯病大多由茄科勞爾氏菌(Ralstoniasolanacear咖)引起的。所述的植物最好是番茄。本發(fā)明菌株可在離體條件下對青枯菌不同生化型菌株的生長產(chǎn)生抑制作用，可有效防治植物青枯病。圖1為本發(fā)明菌株不同處理下番茄青枯病的病害發(fā)生情況；圖2為本發(fā)明菌株不同處理下番茄青枯病的病情嚴重度；圖3為本發(fā)明菌株不同處理下土壤中青枯病菌含量的變化情況。具體實施例方式從浙江省杭州市一塊青枯病嚴重發(fā)生的黃瓜地里采集黃瓜根際周圍0-20cm的表層土壤，裝入無菌聚乙烯塑料袋中，封口。稱取土壤10g，加入裝有90ml無菌水的三角瓶中制得懸液，180r/min震蕩30min，然后從所得懸液中吸取5ml加入有45ml無菌水的三角瓶中，依次梯度稀釋到第5個三角瓶為止，得到10—^10—2、10—3、10—4和10—5的稀釋液。分別取100ii110—4和10—5的稀釋液涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(即NA培養(yǎng)基，含牛肉浸膏l(xiāng)g，蛋白胨5g，酵母膏5g，氯化鈉5g，蔗糖10g，瓊脂20g，水1000ml)中，每個稀釋度重復(fù)3次，置于3(TC恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，挑取培養(yǎng)特征相異的單個菌落，經(jīng)培養(yǎng)純化后作為供試菌株。將各型青枯病菌(見表1)接種到2『C營養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基(即NB培養(yǎng)基，含牛肉浸膏l(xiāng)g，蛋白胨5g，酵母膏5g，氯化鈉5g，蔗糖10g，水1000ml)中，180r/min培養(yǎng)48h，將已滅菌融化后的NA培養(yǎng)基冷卻到45t:左右倒入其中，搖勻后倒平板，4h后接入供試菌，平板在室溫下培養(yǎng)48h，觀察抑菌圈的大小。挑選抑菌圈均大于10mm的供試菌，轉(zhuǎn)接至NA培養(yǎng)基試管斜面上，連續(xù)接種，傳代5次，挑取仍對青枯病菌有較強拮抗效力的菌株進行田間小區(qū)篩選實驗。具體如下將番茄種子播種于花盆中，每盆10粒。植株出土后，用濃度為108CFU/ml的供試菌菌懸液按每株2ml淋1次，待番茄長至約15cm高時，用浸根法接種青枯菌T91(濃度為108CFU/ml)，于接種病原菌后第20d調(diào)查發(fā)病情況，選擇對青枯病防效最好的一株菌株保存于NA斜面上。表1來自不同寄主、不同生化型的的青枯菌(Ralstoniasolanacearum)菌株菌抹號寄主生化型注a表示不同于所有已知的青枯菌生物型實施例2菌株鑒定上述分離得到的菌株主要形態(tài)及生物學(xué)特征如下細胞呈桿狀，革蘭氏染色陽性，以周生鞭毛運動。在膨大胞囊內(nèi)有橢圓形芽孢，在營養(yǎng)瓊脂上無可溶性色素。兼性厭氧。在培養(yǎng)基上的菌落薄，呈星狀擴展，菌量多而粘，表面無光澤。生長物會粘連到培養(yǎng)基上。生長最適溫度28-30°C，生長溫度范圍為15-50°C。生長最適pH為7.0，生長pH范圍5.6_8.5。該菌株經(jīng)FAME脂肪酸分析鑒定為多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)，命名為多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)ZJU0901。實施例3菌株ZJU0901對青枯菌的拮抗活性本實施例仍以實施例1中8株青枯菌為指示菌株。將指示菌株的菌懸液1ml加入到15ml已滅菌融化后冷卻到45t:左右的的NA培養(yǎng)基中，搖勻后將該培養(yǎng)基倒入已滅菌的培養(yǎng)皿上。用滅過菌的牙簽挑取多粘類芽孢桿菌ZJU0901的單菌落，在帶有指示菌的培養(yǎng)基上進行點接，培養(yǎng)條件為30°C，48h，根據(jù)抑菌圈直徑大小測定其拮抗能力。拮抗結(jié)果如下(表2):表2多粘類芽孢桿菌ZJU0901對來自不同寄主的青枯菌菌株的拮抗活性青枯菌菌抹號拮抗細菌的抑菌圓直徑(mm)G7715.38±0.98P750.00±0.00T9116.93±1.52E4067.35±0.72E6915.52±1.34T訓(xùn)11.90±1.37M512.67±0.92M718.20±0.66上述結(jié)果表明多粘類芽孢桿菌ZJU0901除了對從辣椒上的分離的II型青枯菌P75沒有任何抑菌效果外，對其他不同寄主、不同生化型的指示病原菌具有明顯的拮抗活性，最大抑菌圈直徑達18.20mm(—般生防菌拮抗病原菌的抑菌圈>10mm即可稱為有較強抑菌能力)，因此該多粘類芽孢桿菌具有成為高效生防菌的巨大潛力。實施例4多粘類芽孢桿菌ZJU0901不同處理的抑菌活性測定5G77P75T91E406E69T1130M5M7InTl_1IV型IVVI^、、雜姜椒癡子子癡樹樹一生辣番"茄茄番桑桑通過牛津杯法分別測定多粘類芽孢桿菌ZJU0901的菌懸液、無菌濾液、蛋白酶K處理后的濾液以及高溫?zé)崽幚砗蟮臑V液的抑菌活性，每個處理設(shè)3個重復(fù)，各處理具體方法如下(1)菌懸液制備挑取多粘類芽孢桿菌ZJU0901的單菌落，接種于NB液體培養(yǎng)基中，30。C，170r/min振蕩培養(yǎng)24h;(2)無菌濾液制備菌懸液10000r/min離心20min，取上清液，用0.22ym微孔濾膜除菌得抑菌物質(zhì)粗提液；(3)蛋白酶K處理取lml無菌濾液，分裝在1.5ml離心管中，向管內(nèi)加入蛋白酶K使終濃度達到100iig/ml，37。C水浴lh;(4)高溫?zé)崽幚砣ml無菌濾液，分裝在l.5ml離心管中，12rC(高壓鍋內(nèi)進行)處理20min;(5)各處理準備完畢之后，按實施例1的方法準備含有指示菌株的培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基在培養(yǎng)皿里凝固之后，在每個皿上輕輕地垂直放置4個牛津杯。(6)每個牛津杯中分別加入200iil菌懸液、無菌濾液、蛋白酶K處理濾液和高溫?zé)崽幚頌V液。(7)在3(TC條件下，培養(yǎng)48h，觀察抑菌圈有無及大小。不同處理的拮抗物質(zhì)拮抗效果如下(表3):表3不同處理多粘類芽孢桿菌ZJU0901菌液對各青枯菌菌株的拮抗活性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注表中小寫表示P<0.05水平上的顯著性差異分析，數(shù)據(jù)為Mean士SE，下同。上述結(jié)果表明菌懸液和無菌濾液的抑菌效果都非常顯著，顯示多粘類芽孢桿菌ZJU0901的抑菌物質(zhì)主要是菌體的分泌物，而非菌體內(nèi)部的物質(zhì)；蛋白酶K處理后的無菌濾液對各指示菌也具有明顯的抑菌效果，這表明蛋白酶K基本上不能分解抑菌物質(zhì)，S卩非蛋白酶K所能分解的蛋白；而經(jīng)高溫?zé)崽幚碇蟮臒o菌濾液的抑菌活性明顯降低，這表明該抑菌物質(zhì)不能耐高溫，在高溫條件下易失活。實施例5多粘類芽孢桿菌ZJU0901抗菌蛋白的提取蛋白質(zhì)提取采用低溫乙醇沉淀法無水乙醇置于冰箱內(nèi)進行預(yù)冷處理。在多粘類芽孢桿菌ZJU0901無菌濾液中緩慢加入乙醇使其在溶液中的終濃度分別達到40%、50%、60%、70%、80%，此反應(yīng)在冰浴中進行。于4。C靜置過夜，10000r/min，4。C下離心20min，將沉淀溶于20mmo1/1Tris緩沖液(pH6.8)中，所得溶液即為多粘類芽孢桿菌ZJU0901蛋白粗提液。;按實施例3的方法準備含有指示菌株的培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基在培養(yǎng)皿里凝固之后，在每個皿上輕輕地垂直放置4個牛津杯。每個牛津杯中分別加入200ii1待測蛋白粗提液，48h后觀察抑菌圈有無及大小，以此測定不同濃度沉淀出來的蛋白的抑菌活性(只以T91號病原菌作為指示菌)。結(jié)果顯示，當(dāng)無菌濾液乙醇=i:1，即乙醇濃度為50%時，提取的蛋白具有最大的抑菌活性(抑菌圈大小為16.43mm)。實施例6降低番茄青枯病發(fā)生及病菌種群數(shù)量用營養(yǎng)土和沙子1:2的比例伴土，裝盆。盆子直徑為12cm，高為10cm。將已發(fā)芽的番茄種子放入盆子，每盆1粒。將菌懸液、無菌濾液、抗菌蛋白粗提液作為種子處理劑澆灌在種子表面處理1:在種子表面上澆灌l(xiāng)ml多粘類芽孢桿菌ZJU0901的菌懸液(108CFU/ml);處理2:在種子表面上澆灌l(xiāng)ml多粘類芽孢桿菌ZJU0901的無菌濾液；處理3:在種子表面上澆灌l(xiāng)ml多粘類芽孢桿菌ZJU0901的抗菌蛋白粗提液；處理4:在種子表面上澆灌l(xiāng)ml無菌水，作發(fā)病對照；處理5:在種子表面上澆灌l(xiāng)ml無菌水，作空白對照。每個處理設(shè)8個重復(fù)。定期澆水。6周以后，用108CFU/ml青枯菌T91菌懸液在處理1至處理4的番茄苗上傷根接種，各處理接種5ml，處理5用5ml無菌水傷根接種作為空白對照。番茄苗發(fā)病后統(tǒng)計番茄的病害發(fā)生率與病情嚴重度。病情嚴重度分級標準如下0級無癥狀，植株健康；1級1%_15%的葉片萎蔫；2級16%_30%的葉片萎蔫;3級31%_60%的葉片萎蔫;4級61%以上的葉片萎蔫，但植株還沒死亡或全株枯萎；5級植株萎蔫或死亡。病害平均嚴重度=(E各級的植株數(shù)X級數(shù))/總調(diào)查的植株數(shù)，同時為了更好的評估多粘類芽孢桿菌ZJU0901對土壤中青枯菌種群數(shù)量的影響，即其對番茄青枯病菌的抑制效果，對不同處理土壤中青枯病菌的含量進行了測定。方法如下從每組處理的重復(fù)中各稱取lg土壤均勻混合成8g，從中稱取lg作為樣品加入10ml蒸餾水，進行30min的搖床處理。土壤樣品懸浮液進行梯度稀釋后，取0.lml加入TZC半選擇性培養(yǎng)基(蛋白胨10.Og;水解酪蛋白1.Og;葡萄糖5.Og;TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)0.05g;水1000ml;pH7.0-7.2)上進行涂布培養(yǎng)。28°C，3d后計數(shù)。如圖1所示，經(jīng)多粘類芽孢桿菌ZJU0901菌懸液處理后的番茄植株，其病害發(fā)生率最低，而經(jīng)無菌濾液和抗菌蛋白粗提液處理后，番茄植株的病害發(fā)生率也有不同程度的降低，但與對照不顯著。由此可見，多粘類芽孢桿菌ZJU0901菌懸液處理能使番茄植株青枯病的發(fā)生率得到有效控制。如圖2所示，經(jīng)ZJU0901菌懸液處理后的青枯病病情嚴重度最低，與其它處理間存在顯著性差異，而經(jīng)無菌濾液和抗菌蛋白粗提液處理后，番茄青枯病的病情嚴重度也顯著低于發(fā)病對照，由此可以看出，多粘類芽孢桿菌ZJU0901不同處理下，番茄青枯病的病情嚴重度明顯降低。如圖3所示，經(jīng)多粘類芽孢桿菌ZJU0901菌懸液以及無菌濾液處理后，土壤中青枯菌含量明顯低于發(fā)病對照，而經(jīng)抗菌蛋白粗提液處理后，土壤中青枯菌含量沒有明顯的降低。由此可見，多粘類芽孢桿菌ZJU0901的菌懸液和無菌濾液能有效抑制土壤中青枯病菌的生長，從而印證了其能有效控制番茄青枯病的發(fā)生?？偨Y(jié)從青枯病發(fā)生的病情嚴重度、病害發(fā)生率及青枯菌在土壤中含量的變化這三方面可以看出，經(jīng)多粘類芽孢桿菌ZJU0901菌懸液、無菌濾液和抗菌蛋白粗提液處理之后，能不同程度地控制番茄青枯病的發(fā)生，尤其是ZJU0901菌懸液處理的防治效果非常明顯。實施例7多粘類芽孢桿菌ZJU0901增加感病番茄植株的生物量在實施例6的基礎(chǔ)上，待記錄完番茄苗的病害發(fā)生率與病情嚴重度后，帶根收獲番茄苗。帶回室內(nèi)將根上的土壤洗凈，吸干，分別稱其根和莖的鮮重。將同一株番茄苗的根莖裝入信封，放置于烘箱內(nèi)，6(TC烘干3d后，分別稱根莖的干重。實驗結(jié)果如下(表4):表4多粘類芽孢桿菌ZJU0901對接種青枯菌后番茄植株生物量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實驗結(jié)果顯示與發(fā)病對照相比，經(jīng)ZJU0901菌懸液處理之后，番茄植株的鮮重和干重根莖比值有明顯提高。鮮重時，發(fā)病對照的根莖比為0.11，而經(jīng)ZJU0901菌懸液處理之后的根莖比提高至O.14;干重時，發(fā)病對照的根莖比為O.09，而經(jīng)ZJU0901菌懸液處理之后的根莖比提高至O.12。由此可以看出，多粘類芽孢桿菌ZJU0901能增加感病番茄植株的生物量。實施例8多粘類芽孢桿菌ZJU0901對青枯病防效的田間小區(qū)實驗番茄種子用108CFU/ml濃度的ZJU0901菌懸液處理2小時后在溫室育苗，操作方法參考實施例6。大約l個月后，移栽番茄苗在浙江溫州青枯病高發(fā)地塊栽培，在移栽時每穴加100mlZJU0901菌懸液(107CFU/ml)，對照處理加100ml無菌水，每處理50棵番茄苗，肥水管理同正常年份，同時不使用任何化學(xué)農(nóng)藥處理。2個月后，調(diào)查并計算ZJU0901菌懸液的防效。實驗結(jié)果顯示，對照處理的青枯病病害發(fā)生率和病害嚴重度分別為76.0%和2.56級，而ZJU0901菌懸液處理的青枯病病害發(fā)生率和病害嚴重度分別為32.0%和1.04級，由此可見，ZJU0901菌懸液對番茄青枯病發(fā)生率和病害嚴重度的防治效果分別達到57.8%和59.3%以上。權(quán)利要求一種多粘類芽胞桿菌菌株，其特征在于命名為多粘類芽胞桿菌(Paenibacilluspolymyxa)ZJU0901，保藏號為CCTCCNOM209157。2.—種含有權(quán)利要求1所述的多粘類芽胞桿菌ZJU0901的菌懸液。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的菌懸液，其特征在于所述的菌懸液中多粘類芽胞桿菌ZJU0901含量為107108CFU/ml。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌懸液，其特征在于制備菌懸液所用的培養(yǎng)基為NB培養(yǎng)基。5.—種無菌濾液，其特征在于，通過如下方法制備取含多粘類芽胞桿菌ZJU0901的菌懸液，離心后取上清液，上清液經(jīng)微孔濾膜過濾即為無菌濾液。6.—種抗菌蛋白粗提液，其特征在于，通過如下方法制備取含多粘類芽胞桿菌ZJU0901的菌懸液，離心后取上清液，上清液經(jīng)微孔濾膜過濾得到無菌濾液，將無水乙醇加入無菌濾液中進行沉淀，將沉淀溶于緩沖溶液中即得抗菌蛋白粗提液。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗菌蛋白粗提液，其特征在于所述無水乙醇與菌懸液體積比為l:1。8.權(quán)利要求1所述的多粘類芽胞桿菌ZJU0901在防治植物青枯病中的應(yīng)用。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的植物為蕃茄、茄子、煙草、花生、馬鈴薯或香蕉。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的植物為番茄。全文摘要本發(fā)明公開了一種防治植物青枯病的多粘類芽孢桿菌菌株，經(jīng)鑒定命名為多粘類芽胞桿菌(Paenibacilluspolymyxa)ZJU0901，保藏于位于武漢市珞珈山武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日期為2009年7月19日，保藏號為CCTCCNOM209157。本發(fā)明菌株可在離體條件下對青枯菌不同生化型菌株的生長產(chǎn)生抑制作用，可有效防治植物青枯病。文檔編號C12N1/20GK101712941SQ20091015398公開日2010年5月26日申請日期2009年11月30日優(yōu)先權(quán)日2009年11月30日發(fā)明者余山紅,劉寶平,李斌,蘇婷,謝關(guān)林申請人:浙江大學(xué)