專利名稱：：對轉基因成分進行檢測的聚合酶鏈式反應芯片法的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及水稻、玉米、大豆、油菜籽、馬鈴薯、番茄、西葫盧、甜瓜及其加工產(chǎn)品中以及植物性詞料中轉基因成分進行檢測的聚合酶鏈式反應芯片法。
背景技術：
：由于對轉基因食品安全性的不確定性，使得各國對轉基因產(chǎn)品的管理從未放松過，而且越來越嚴格和規(guī)范。但隨著越來越多轉基因動植物的誕生，轉基因產(chǎn)品的復雜性對管理部門的檢測技術提出了挑戰(zhàn)。目前對轉基因產(chǎn)品的檢測多采用PCR法，該方法有較高的靈敏度和準確性，但面對越來越多需要檢測的外源基因，該方法的效率已成為瓶頸。而以高通量著稱的基因芯片(genechip)法，能滿足同時檢測大量基因的需要，但將該方法應用到轉基因檢測時，由于植物產(chǎn)品含有較多的次生代謝物質，所提取的DNA不能直接用于芯片檢測，而要先經(jīng)過PCR擴增，擴增產(chǎn)物才能用于芯片檢測。因此普通基因芯片法并不能解決檢測效率低的問題。
發(fā)明內容本發(fā)明所要解決的技術問題是克服上述現(xiàn)有技術存在的缺陷，提供一種結合PCR技術和芯片技術形成的聚合酶鏈式反應芯片法(簡稱PCR-chip法)，使PCR擴增和芯片檢測同步化，提高檢測效率，且能同步完成水稻、玉米、大豆、油菜籽、馬鈴薯、番茄、西葫蘆、甜瓜及其加工產(chǎn)品中以及植物性飼料中物種成分鑒定，外源基因鑒定，及轉基因植物品系鑒定。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明釆用以下技術方案1、芯片引物的設計及芯片制作選用四類引物(見表l):第一類為植物通用內源基因，用于鑒定從植物源產(chǎn)品中抽提獲得的DNA的質量是否符合實驗要求；第二類為物種鑒定基因，用于成分鑒定，包括對水稻、玉米、大豆、油菜籽、馬鈴薯等的鑒定，也可用于鑒定DNA的質量是否符合實驗要求；第三類為外源基團，用于外源基因鑒定，包括一系列啟動子、終止子、各種3目的基因等；第四類為轉基因植物品系鑒定基因，用于轉基因植物的品系鑒定，包括中國允許進口和不允許進口的上述植物的各種轉基因品系。將上述四類引物中的下游引物的5'修飾10個連續(xù)的(GA)序列(5'-(GA)ur引物序列-3，)，并將此端固定在芯片上，點樣量設定為50pmol/點，每個引物在芯片上重復3次，完成芯片的制作。在設計芯片時，對引物的篩選考慮了對DNA質量的判斷，即通過植物通用的內源基因，判斷用于實驗的DNA的質量是否可靠，以防由于DNA的質量而導致的假陰性;同時對一些已知其物種特異性基因的植物，包括水稻、玉米、大豆、油菜籽、馬鈴薯，設計相應引物，進行物種(成分)的鑒定；并針對一系列啟動子、終止子、抗除草劑基因、抗蟲基因、抗病毒基因和品質改良基因等外源基因設計引物，鑒定是否為轉基因產(chǎn)品和轉入的是什么外源基因等；最后通過在外源基因和植物內源基因組之間的邊界序列，或兩個特異性外源基因之間的搭界序列設計引物，對該轉基因產(chǎn)品品系進行鑒定。因此該芯片，不但能鑒定是否為轉基因產(chǎn)品，同時能對物種(成分)和品系進行鑒定。表1引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、芯片上的PCR反應1)芯片預處理。將制備好的芯片浸泡在小牛血清(BSA，10mg/ml)中，室溫，0.5-1小時；磷酸緩沖液(PBS，pH=7.4)沖洗數(shù)變；滅菌水沖洗數(shù)變；干燥；在芯片引物陣列外圍粘上原位框(25ul)，形成PCR加樣區(qū)，備用。2)PCR加樣和PCR程序在芯片的25yl體系中，加入PCR緩沖液，MgCl"dNTP，taq酶，及需要檢測基因的上游引物(該引物的5'端用Cy5染料標記，引物的量控制在50pmol左右)，需檢測樣品的高質量的DNA，加水補足25ul。加樣完畢后，加蓋密封PCR反應區(qū)。PCR反應程序為:95°C，lmin;40個循環(huán)(95°C,30S;55-60°C,150S;72。C，60S);72°C，10min。3、芯片檢測PCR程序完成后，用含O.P/。吐溫20的5XSSC緩沖液清洗芯片數(shù)次，在芯片掃描儀上檢測Cy5熒光強度，讀取和分析數(shù)據(jù)。上述步驟l所提及的芯片引物的設計及芯片制作，一旦引物設計完成，芯片可以批量生產(chǎn)，保證在一段時間內使用量，并不需要每次都重新制作芯片。在有新的轉基因產(chǎn)品問世后，可以對芯片的引物進行相應的添加優(yōu)化。本發(fā)明把需檢測目的基因的下游引物通過生物素?；蛄姿峄潭ㄔ诳瞻仔酒?，而另一端自由的上游引物用Cy5染料標記，通過芯片上的PCR擴增反應，最后經(jīng)芯片掃描儀檢測熒光強度判斷是否為轉基因產(chǎn)品。本發(fā)明使PCR擴增和芯片檢測同步化，具有以下有益效果l)保留了PCR方法的高靈敏度，高準確度的優(yōu)點，同時又繼承了芯片檢測方法高通量的優(yōu)點，提高了檢測效率，降低了檢測成本；2)優(yōu)化各檢測基因的引物，使不同的引物有相同或相近的退火溫度，同時通過半固定引物的方法減少了各引物間的相互干擾，保證了檢測的高準確度；3)通過一次PCR程序，可以同時檢測十幾個甚至幾十個基因，大大提高了檢測的效率(理論上可以同時檢測芯片上所含引物的所有基因，為減少引物間的干擾，建議一次檢測將引物控制在50個以內，可以保證PCR擴增的準確性)，同時，每個基因都有3個重復點，保證了檢測了重復性；4)PCR程序結束后，通過對熒光強度的掃描，可以判斷檢測樣品是否含有水稻、玉米、大豆、油菜籽、馬鈴薯等成分，同時可以判斷樣品中是否含有外源啟動子、終止子、和各種功能性外源基因，最后還可以通過邊界序列上的引物，判斷該轉基因植物的品系；5)可以檢測到低至1%甚至0.1%的目的基因，完全可以滿足一般國際上要求的5%左右的檢測低限。下面結合具體實施方式對本發(fā)明作進一步說明。具體實施例方式實施例1PCR-chip靈敏度驗證如表1，設計、合成所有的引物，待用。將用作芯片的玻片用5N的NaOH浸泡活化2小時；ddH20沖洗30秒；在含有10%的3-氨丙基-三乙氧硅烷(3-aminopropyl-triethoxysilane)水溶液中，80。C下，浸泡2小時；ddH20沖洗30秒；12(TC下，烘干1小時；將100y1濃度為0.2mg/ml的中性親和素(neutravidin)滴加在玻片上，在潮濕的腔體內，室溫放置2小時；ddH2O沖洗30秒；離心甩干，干燥放置備用。將適合濃度的下游引物通過點樣儀，按要求點樣在玻片上，即為所需芯片。取準備好的樣品1，2，3(表2)進行PCR-chip反應。根據(jù)表3配制PCR反應體系，在3個PCR反應體系中分別加入樣品1，2，3各lwl，在3塊預處理后的芯片中分別進行PCR反應，反應程序為95°C，lmin;40個循環(huán)(95。C，30S;55。C,150S;72。C，60S);72'C，10min。PCR反應結束后，對芯片進行沖洗，甩干后進行掃描檢測。掃描結果顯示，樣品1和2都檢測到了大豆內源基因Lectin,啟動子CaMV35s，終止子N0S，抗除草劑8基因EPSPS和轉基因大豆品系GTS40-3-2特有的DNA序列35s/cp4;而樣品3只檢測到了大豆內源基因Lectin。結果說明了該方法有較高的靈敏度，可以檢測到1%含量的轉基因產(chǎn)品。表2實施例1的DNA樣品<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*由紫外分光光度計檢測得到；**由DNA總濃度和轉基因成分百分含量換算得到。表3PCR-Chip反應體系成分體積10XPCRbuff2.5uldNTP(2,5mmol/L)2.0ulMgCl2(25腿ol/L)2.0ul標記Cy5的上游引物X各0.5ul(20pmol/ul)*Tag(5u/y1)0.2ulDNA模板1.0ulddH20使反應體系至25lU*已知樣品是大豆的情況下，我們只加入和轉基因大豆檢測有關的上游引物，包括Lectin,CaMV35s，F(xiàn)MV35s，NOS，EPSPS，PAT，35s/cp4等。實施例2PCR-Chip準確度和高通量驗證芯片及引物的制備如實施例1。樣品是為以玉米為原材料的飼料。取100mg詞料，提取高質量DNA(DNA濃度78.28ng/u1，0D26。/0D28。=1.68)。根據(jù)表3配制PCR反應體系，由于已知樣品為玉米，上游引物的選擇和實施例l有所不同，選擇玉米內源基因的引物ZEIN，同時為了驗證是否含有其他原材料又選擇了大豆、油菜籽、馬鈴薯和大米的內源引物，Lectin,PE3-PEPase,PATA和G0S9;外源基因CaMV35s，Actinl，F(xiàn)MV35s，N0S，PAT，Bar,G0X，Cry細，Cry9c，EPSPS的引物;以及和轉基因玉米品系鑒定有關的引物M0N810，BT176，BTll，GA21，T25,TC1507，M0N863，NK603,C朋351。加樣完畢后，進行PCR反應，反應程序為95°C，lmin;40個循環(huán)(95。C，30S;56。C，150S;72'C，60S);72'C，10min。PCR反應結束后，對芯片進行沖洗，甩干后進行掃描檢測。掃描結果顯示，樣品檢測到了玉米內源基因ZINE，啟動子CaMV35s和Actinl，終止子NOS，9抗除草劑基因EPSPS，PAT,Bar,抗蟲基因CryIA(b)和Cry9c，同時顯示品系鑒定的有關基因位點GA21，CBH351，BT11也顯示陽性。說明這批飼料含有轉基因玉米成分，不含大豆、油菜籽、馬鈴薯和大米成分，且轉基因玉米的品系包括GA21，C朋351和BTll。核對相關的轉基因玉米品系資料發(fā)現(xiàn)，品系GA21含有的外源基因包括Actinl，N0S，EPSPS;品系CBH351含有外源基因CaMV35s，N0S，Bar，Cyr9c;品系BT11含有外源基因CaMV35s，N0S，PAT，CryIA(b)，皆和本檢測的結果符合。實施例3PCR-chip高通量驗證芯片及引物的制備如實施例1。樣品為含有大米、油菜籽、馬鈴薯的混合物。取100mg樣品，抽提DNA(DNA濃度58.04ng/iil，OD260/OD280=2.07)。根據(jù)表3配制PCR反應體系，選擇物種鑒定基因引物Lectin、ZEIN、G0S9、PE3-PEPcase、PATA;外源基因CaMV35s，ActinI,FMV35s，N0S，PAT，Barnase，Barstar，Bar，NPTII,G0X,EPSPS，CrylAb/c，Cry3A，PVY-cp，PLRVr印的引物；以及和相關轉基因植物品系鑒定有關的引物Bt63,Topasl9/2，RF3，OXY235，Ms8，NewLeafAtlantic,NewLeafYRussetBurbank，NewLeafYSh印ody，NewLeafPlusRussetBurbank,EH92-527。加樣完畢后，進行PCR反應，反應程序為95°C，lmin;40個循環(huán)(95°C，30S;56°C，150S;72°C，60S);72°C，lOmin。PCR反應結束后，對芯片進行沖洗，甩干后進行掃描檢測。掃描結果顯示，樣品檢測到了大米、油菜籽、馬鈴薯內源基因G0S9、PE3-PEPcase、PATA，啟動子CaMV35s，F(xiàn)MV35s和ActinI，終止子N0S，標記基因NPTII，抗除草劑基因PAT，抗蟲基因Cry3A，CrylAb/c，抗病毒基因PVY-cp同時顯示品系鑒定的有關基因位點Bt63，Topasl9/2，NewLeafYRussetBurbank也顯示陽性。說明這批樣品中含有轉基因大米、油菜籽、馬鈴薯的成分，不含大豆和玉米成分，且轉基因大米的品系為Bt63，轉基因油菜籽的品系為T叩asl9/2，轉基因馬鈴薯的品系為NewLeafYRussetBurbank。核對相關的轉基因大米、油菜籽、馬鈴薯品系資料發(fā)現(xiàn)轉基因大米Bt63含有的外源基因包括Actinl、N0S、CrylAb/c;轉基因油菜籽T叩asl9/2含有的外源基因包括CaMV35s、NPTII、PAT;轉基因馬鈴薯NewLeafYRussetBurbank含有的外源基因包括FMV35s、N0S、NPTII、Cry3A、PVY-cp,皆和本檢測的結果符合。實施例4PCR-chip驗證芯片及引物的制備如實施例1。樣品為番茄醬。取500mg樣品，抽提DNA(DNA濃度97.11ng/u1，OD260/OD280=1.67)。根據(jù)表3配制PCR反應體系。選擇物種鑒定基因引物Lectin、ZEIN、G0S9、PE3-PEPcase、PATA;由于番茄的物種特異性引物未知，因此有必要選擇一個植物通用引物(18SrDNA)以驗證提取DNA的質量；外源基因選擇CaMV35s，Actinl，F(xiàn)MV35s，N0S，PAT，NPTII，ACC，Sam-k的引物；以及和相關轉基因植物品系鑒定有關的引物，包括以下品系"華番一號"，Zeneca。加樣完畢后，進行PCR反應，反應程序為95。C，lmin;40個循環(huán)(95。C,30S;56。C，150S;72。C，60S);72。C，10min。PCR反應結束后，對芯片進行沖洗，甩干后進行掃描檢測。掃描結果顯示，樣品檢測到了植物通用內源基因18SrDNA，啟動子CaMV35s，終止子NOS，標記基因NPTII，同時顯示品系鑒定的有關基因位點Zeneca。說明該樣品含有品系為Zeneca的轉基因番茄成分，但不含大豆、油菜籽、大米、馬鈴薯和玉米成分。核對相關的轉基因番茄品系資料發(fā)現(xiàn)轉基因番茄Zeneca含有的外源基因包括CaMV35s、NOS、NPTII;且含有內源基因PG被反義后和NOS連接插入的片段(PG/NOS)，和本實驗的結果皆符合。權利要求1、對轉基因成分進行檢測的聚合酶鏈式反應芯片法，其方法如下把需檢測目的基因的下游引物通過生物素?；蛄姿峄潭ㄔ诳瞻仔酒希硪欢俗杂傻纳嫌我镉肅y5染料標記，通過芯片上的PCR擴增反應，最后經(jīng)芯片掃描儀檢測熒光強度判斷是否為轉基因產(chǎn)品。2、根據(jù)權利要求1所述的聚合酶鏈式反應芯片法，其特征在于具體步驟如下a、芯片引物的設計及芯片制作選用四類引物，第一類為植物通用內源基因，第二類為物種鑒定基因，第三類為外源啟動子、終止子或目的基因，第四類為轉基因植物品系鑒定基因，將上述各類引物中的下游引物的5'修飾10個連續(xù)的GA序列，并將此端固定在空白芯片上，完成芯片的制作；b、芯片上的PCR反應1)芯片預處理將制備好的芯片浸泡在小牛血清中，室溫放置0.5-1小時，接著用磷酸緩沖液沖洗數(shù)遍，滅菌水沖洗數(shù)遍，干燥，然后在芯片引物陣列外圍粘上原位框，形成PCR加樣區(qū)，備用；2)PCR加樣和PCR程序在芯片的PCR加樣區(qū)中，加入PCR緩沖液、MgCl2、dNTP、和taq酶，及需要檢測基因的上游引物，需檢測樣品高質量的DNA，需要檢測基因的上游引物的5'端用Cy5染料標記，加樣完畢后，加蓋密封PCR反應區(qū)，進行PCR反應；c、芯片檢測PCR反應完成后，用吐溫20的5XSSC緩沖液清洗芯片數(shù)次，然后在芯片掃描儀上檢測Cy5熒光強度，讀取和分析數(shù)據(jù)。3、根據(jù)權利要求2所述的聚合酶鏈式反應芯片法，其特征在于PCR反應程序依次為95°C，lmin;40個循環(huán):95。C,30S;55。C，150S;72。C，60S;72°C，10min。全文摘要本發(fā)明公開了一種對轉基因成分進行檢測的聚合酶鏈式反應芯片法。目前對轉基因產(chǎn)品的檢測多采用PCR法，該方法有較高的靈敏度和準確性，但面對越來越多需要檢測的外源基因，該方法的效率已成為瓶頸。本發(fā)明的技術方案為對轉基因成分進行檢測的聚合酶鏈式反應芯片法，其方法如下把需檢測目的基因的下游引物通過生物素?；蛄姿峄潭ㄔ诳瞻仔酒希硪欢俗杂傻纳嫌我镉肅y5染料標記，通過芯片上的PCR擴增反應，最后經(jīng)芯片掃描儀檢測熒光強度判斷是否為轉基因產(chǎn)品。本發(fā)明保留了PCR方法的高靈敏度，高準確度的優(yōu)點，同時又繼承了芯片檢測方法高通量的優(yōu)點，提高了檢測效率，降低了檢測成本。文檔編號C12Q1/68GK101638690SQ20091010209公開日2010年2月3日申請日期2009年8月31日優(yōu)先權日2009年8月31日發(fā)明者姍吳,張明哲,張曉峰,王華雄,陳笑梅申請人:浙江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心