專利名稱：一種實時熒光rt-pcr檢測豬流感病毒的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種實時熒光RT-PCR檢測豬流感病毒的試劑盒，特別是涉及以一步 法實時熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術(shù)早期、快速診斷豬流感病毒感染的試劑 盒。本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，通過本發(fā)明的試劑盒實現(xiàn)對呼吸道樣本、血清、 肺組織等樣品中的豬流感病毒進行早期快速診斷。
背景技術(shù)：
豬流感(Si)是一種因豬流感病毒引起的豬呼吸系統(tǒng)疾病，此病在世界各地都有 發(fā)生，危害嚴重，經(jīng)濟損失巨大，并對人類的健康構(gòu)成威脅。豬流感病毒(SIV)屬于正粘病 毒科(Orthomyxoviridae)，甲型流感病毒屬(Influenza virus Α)。典型病毒顆粒呈球狀， 直徑為SOnm 120nm，有囊膜。囊膜上有許多放射狀排列的突起糖蛋白，分別是血凝素HA、 神經(jīng)氨酸酶NA和M2蛋白。病毒顆粒內(nèi)為核衣殼，呈螺旋狀對稱，直徑為lOnm，它含核蛋白 (neucleoprotein,NP), 3禾中多聚酶蛋白(polymerase protein Ι,ΡΒΙ ；polymerase protein 2，PB2 ；polymerase protein A)和病毒單鏈RNA。豬流感病毒為單股負鏈RNA病毒，基因組 約為13. 6kb，由大小不等的8個獨立片段組成。豬流感病毒能夠在多種動物的細胞和雞胚 增殖。病毒具有血凝活性，但不同毒株的抗原性無明顯的區(qū)分 。由于病毒受到抗體的壓力 很大，因此病毒的變異頻繁。盡管不同亞型之間可以組成很多種流感病毒血清型，但從豬身 上分離到四種主要的亞型Hmi、HlN2、H3N2和H3W，其中有三種亞型造成人感染，分別為 HlNU H1N2 和 H3N2。豬流感病毒在豬群中全年可以傳播，但多數(shù)暴發(fā)于秋季末期和冬季，具有高發(fā)病 率(幾乎100% )和低病死率(病死率< )的特點。豬流感病毒感染可使患病豬生產(chǎn)性 能下降，推遲上市；還可引起呼吸道細菌和病毒繼發(fā)或混合感染，使疫情更為嚴重，造成豬 只死亡。豬是人源、禽源和豬源流感病毒的惟一共同易感宿主，因此豬在禽-豬-人的流感 種間傳播過程中，起著中間宿主及多重宿主的作用，它能將豬流感病毒傳播給人或鳥類。美 國曾于1976年在新澤西州迪克斯堡的士兵中出現(xiàn)豬流感爆發(fā)，引起200多例病例，其中至 少4名士兵進展成肺炎，1人死亡，該病毒與當時從豬體內(nèi)分離的病毒相同，首次證實了在 自然條件下，豬流感病毒可從豬傳播給人。1988年，美國出現(xiàn)了豬流感人際間傳播的跡象， 接觸過一例豬流感病例的醫(yī)護人員中出現(xiàn)了輕微的流感樣疾病，并在血清中檢測出豬流感 抗體。2005年12月至2009年2月期間，美國共報道了 12例人感染豬流感病例，但均未出 現(xiàn)死亡。1999年10月，香港1名10月齡女嬰感染了豬流感病毒H3N2，現(xiàn)已完全康復。這 些年來，世界各地都有人感染豬流感病毒不同病毒株的報道，但并沒有大規(guī)模流行。2009年 3月，墨西哥及美國等部分地區(qū)暴發(fā)了人感染豬流感疫情，即甲型Hmi流感病毒感染，可以 人傳染人，可能出現(xiàn)全球性爆發(fā)流行的潛在危險。人感染豬流感的潛伏期尚不明確，參照流感的潛伏期一般為1-3天。臨床癥狀與 流感相似，包括發(fā)熱、咳嗽、咽痛、軀體疼痛、頭痛、畏寒和疲勞等。有些人還會出現(xiàn)腹瀉和嘔 吐，甚至引起嚴重疾病(肺炎和呼吸衰竭)和死亡。人感染豬流感病毒后，現(xiàn)有資料表明，傳染期為發(fā)病前1天至發(fā)病后7天。若病例發(fā)病7天后仍有發(fā)熱癥狀，表示仍具有傳染性。 兒童，尤其是幼兒，傳染期可能長于7天。豬作為流感病毒的“混合器”，在流感病毒跨種屬障礙而感染新宿主的過程中起著 重要的作用。由于豬上皮細胞具有唾液酸2，6-半乳糖苷和唾液酸2，3-半乳糖苷，人流感 病毒可與前者結(jié)合，而禽流感病毒與后者結(jié)合，因此，豬上皮細胞就能夠被人流感病毒和禽 流感病毒感染，而成為毒株間基因重組的活載體。1998年從美國北卡羅來納州分離到一株 H3N2亞型SIV，其HA，NA和PBl基因為人型流感病毒基因，M，NP和NS基因為豬型流感病毒 基因，PB2、PA基因為禽型流感病毒基因。1978年，日本暴發(fā)的H1N2SIV是由Hmi和H3N2 基因重組而產(chǎn)生的新亞型。國內(nèi)從山東豬分離出H9N2流感病毒，分析可能是由雞和鴨流感 病毒重組的結(jié)果。繼H9N2亞型流感病毒1998年首次從豬群中分離到，研究表明，通過進行 部分序列分析發(fā)現(xiàn)，豬源H9N2亞型與國內(nèi)分離的禽流感病毒高度同源。SI和人流感之間也 可以發(fā)生交叉感染和傳播。1978年，從臺灣的一個豬群中分離到了 H3N2亞型SIV，通過測 序發(fā)現(xiàn)，此病毒發(fā)生了人流感病毒和SI病毒基因片段的重組。2009年墨西哥和美國出現(xiàn)的 甲型Hmi流感病毒，被認為該毒株包含有豬流感、禽流感和人流感三種流感病毒的基因片 斷。通過監(jiān)測SIV的動態(tài)變化可以預測人流感的發(fā)展趨勢。因此，研究SIV具有更加 深遠的公共衛(wèi)生學意義。由于本病的流行和危害日益嚴重，因此對SIV的研究已成為國內(nèi) 外獸醫(yī)界、醫(yī)學界和微生物學界的熱點之一。目前常用的豬流感病毒實驗室檢查方法包括1)血清學診斷包括間接ELISA、抗原捕捉ELISA、熒光免疫法等；2)病毒分離從呼吸道標本中或肺組織分離豬流感病毒。常用的方法有雞胚接種 法和細胞培養(yǎng)法。現(xiàn)有的診斷方法中，病毒分離法是較敏感的，但需要2-3周時間，無法實 現(xiàn)早期快速診斷。3)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)由于PCR技術(shù)具有簡便、快速、靈敏、特異 性強等特點，已用于豬流感病毒基因的檢測和分子流行病學調(diào)查等，是豬流感病毒早期診 斷的推薦方法。實時熒光(Real-time)RT-PCR技術(shù)是在RT-PCR技術(shù)上發(fā)展起來的。實時熒光 PCR技術(shù)是近年來發(fā)展迅速的一種核酸檢測技術(shù)，使用一種帶有核電偶聯(lián)裝置(CCD)的PCR 擴增儀，通過檢測熒光信號的動態(tài)變化實時反映PCR的每個循環(huán)的擴增水平。CCD能夠按 照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長的激發(fā)光，收集檢測熒光信號，并通過軟件分析匯總 到工作站得到擴增曲線。一步法實時熒光RT-PCR技術(shù)是實時熒光PCR的一種(Martell， Μ.，J. Gomez, J. Esteban，S. Sauleda，J. Quer, B. Cabot, R. Esteban，and J. Guardia. 1999. High-throughput real-time reverse transcription-PCR quantitation of hepatitis Cvirus RNA.J.Clin. Microbiol. 37 327-332 ；Lee CW, Suarez DL 2004. Application of real-time RT-PCR for the quantitation and competitive replication study of H5 and H7 subtype avian influenza virus. J Virol Methods. 119 (2) :151_8。)，它是一禾中 直接快速檢測RNA的方法，與檢測DNA的實時熒光PCR相比，不同之處在于前者在反應體系 中增加了逆轉(zhuǎn)錄酶，同時多了一個逆轉(zhuǎn)錄反應步驟；相同之處在于兩者在反應體系中均有 一條兩端分別標記熒光報告基團和淬滅基團的探針，探針結(jié)構(gòu)完整時，熒光報告基團發(fā)出熒光的能量轉(zhuǎn)移給淬滅基團，呈現(xiàn)淬滅效應。如果擴增過程中有靶序列的存在，擴增的過程 中探針分子逐漸被水解切斷，熒光報告基團與淬滅基團相互解離，阻斷了二者間熒光共振 能量轉(zhuǎn)移效應，熒光報告基團發(fā)出熒光信號。隨著擴增的進行，熒光信號隨著目的片段的擴 增而呈現(xiàn)線性增強。傳統(tǒng)的RT-PCR由兩個單獨的反應程序或步驟完成，第一步是通過逆轉(zhuǎn)錄酶作用， 將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ；第二步是在Taq酶作用下，以第一步中形成的cDNA為模板進行PCR 擴增。與傳統(tǒng)的RT-PCR相比較，一步法實時熒光RT-PCR技術(shù)具有如下優(yōu)點1、將逆轉(zhuǎn)錄和 PCR擴增兩個在不同反應管中分開進行的二個反應程序合并成一個反應程序，在一個PCR 反應管中完全閉管完成檢測過程，大大節(jié)省了反應時間；2、通過對擴增曲線以及對數(shù)增長 期的循環(huán)閾值(Ct)的分析，摒棄普通PCR方法受多種因素干擾的終點分析方法，能夠?qū)z 測樣品進行準確定量分析，從而有效監(jiān)測藥物治療的效果；3、將RNA逆轉(zhuǎn)錄、DNA擴增與檢 測三過程融合為一體，可以實時、動態(tài)監(jiān)測RNA擴增的全過程，省掉了 PCR產(chǎn)物后處理過程， 大大縮短了結(jié)果分析時間，使得該方法更加快捷、方便；4、由于采取一種封閉的檢測模式， 從而減少了氣溶膠污染和由此造成的假陽性；5、由于在普通RT-PCR基礎(chǔ)上增加了一條可 與模板互補配對的熒光探針，進一步提高了檢測靶多核苷酸的特異性。因此，該技術(shù)在RNA 樣品的檢測和分析中，已逐漸取代傳統(tǒng)的RT-PCR方法，得到十分廣泛的應用。我國食品與藥品管理局(SFDA)已經(jīng)批準了諸如HIV-1、HCV等病原體的一步法實 時熒光RT-PCR檢測試劑盒的生產(chǎn)與臨床應用。因此，通過一步法實時熒光RT-PCR方法開 發(fā)一種檢測豬流感病毒的試劑盒在技術(shù)上是可行的，再加之其方法學上具有簡便快速、靈 敏度和特異性高的特點，可以實現(xiàn)早期快速診斷。但目前國內(nèi)外均尚未開發(fā)出檢測豬流感 病毒實時熒光RT-PCR試劑盒，因此開發(fā)該試劑盒成為當務(wù)之急，它的應用將極大滿足豬流 感病毒快速檢測與監(jiān)測工作的需要。眾所周知，在使用已知的一步法實時熒光RT-PCR技術(shù)檢測和定量分析樣品中某 特定靶核酸的實踐中，為了減少和避免檢測結(jié)果的假陰性或假陽性，提高定量分析的準確 性，個關(guān)鍵性的基本技術(shù)環(huán)節(jié)是如何基于已知的靶多核苷酸序列設(shè)計、篩選及制備適當?shù)?引物和寡核苷酸探針。本發(fā)明人在此基礎(chǔ)上利用一步法實時熒光RT-PCR技術(shù)發(fā)明了一種 檢測豬流感病毒的試劑盒，應用于豬流感病毒的檢測和分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種實時熒光RT-PCR檢測豬流感病毒的試劑盒，特別是涉及以一步 法實時熒光RT-PCR反應技術(shù)早期、快速診斷豬流感病毒感染的試劑盒。本試劑盒可以檢測 呼吸道樣本、血清、肺組織等樣品中的豬流感病毒。本發(fā)明的目的是提供一種使用一步法實時熒光RT-PCR技術(shù)檢測樣品中豬流感病 毒的試劑盒，特別是涉及豬流感病毒的早期感染在實驗室診斷中的應用。其基本原理是利 用一對寡核苷酸的特異性引物和一條寡聚核苷酸的特異性探針，在逆轉(zhuǎn)錄酶(RT酶)、熱 啟動Taq酶、RNA酶抑制劑(RNasin)、高質(zhì)量的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及Mg2+等 RT-PCR反應緩沖液中，通過DA7600、ABI7500等市售的熒光PCR擴增儀實現(xiàn)靶多核苷酸的 循環(huán)擴增，從而達到快速、實時、定量檢測靶多核苷酸的目的。為了實現(xiàn)本發(fā)明，我們采用了以下技術(shù)方案
1)使用適當?shù)暮怂岱治鲕浖謩e對已知的豬流感病毒NP基因的核苷酸序列進 行同源性比較，在找出同源區(qū)段的基礎(chǔ)上，進一步使用適當?shù)囊镌O(shè)計軟件(例如Primer Express 2)選擇并設(shè)計寡核苷酸引物和探針。由于所設(shè)計的引物和探針均具有互補于豬流 感病毒的序列，而且與其他病原體的核苷酸序列沒有同源性，也不包括任何常見的核酸內(nèi) 切酶的酶切位點，所以避免了豬流感病毒檢測的假陰性和假陽性，提高了檢測的可靠性和 準確度。2)使用DNA合成裝置合成所需的寡核苷酸引物，用分子篩和快速蛋白質(zhì)液相層析 法(FPLC)純化后進行氨解處理。同樣合成所需的探針序列，氨解處理后分別在其5’端標記 作為熒光發(fā)生基團(報告基團)&6-FAM amidite，并在其3’端標記借助活性連接臂偶聯(lián) 上作為熒光淬滅或抑制基團的TAMRA。以FPLC層析法純化熒光標記的探針。然后，使用變 性條件下的聚丙烯酰胺凝膠(20% )電泳法和分光光度法物理鑒定所合成的引物和探針。3)適宜于一步法實時熒光RT-PCR擴增的反應體系。反應體系包括逆轉(zhuǎn)錄酶、熱啟 動Taq酶、2’ _脫氧核苷三磷酸、能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第一條鏈結(jié)合的正向引物、能 夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物、能夠與靶多聚核苷酸結(jié)合并且兩術(shù)端 分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團和熒光淬滅基團的寡核苷酸探針、含有鎂離子的緩沖液。4)從待測樣本中提取RNA，分別加入前述的反應體系中，直接經(jīng)一步法RT-PCR擴 增，從熒光擴增曲線判斷是否存在豬流感病毒。本發(fā)明所提供的檢測樣品中豬流感病毒的試劑盒包括(1)分別裝有RNA提取液 (即TRIZOL核酸抽提試劑)、反應體系、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品并加蓋密封的多個試劑瓶 或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中反應體系包括引物探針混合液、RT-PCR 反應液、RT-PCR酶系。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中引物探針混合液由(a)與雙鏈靶多核苷 酸的第一條鏈結(jié)合的正向引物，(b)能夠與雙鏈靶多核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物， (c)和能夠與靶多核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合有熒光報告基團和熒光淬滅基團的寡核 苷酸探針組成，以上引物探針濃度均為5 15pmol/反應，優(yōu)選引物濃度為5pmol/反應、探 針濃度為5pmol/反應。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中引物探針混合液中正向引物 的序列為5’ -CCGTTATTGGGCGATTCG-3’ (SEQ ID NO=I),反向引物的序列為 5，-CATCACGGTCGCACGTTCA-3，(SEQ ID NO :2)，正、反向引物可向 5，和 3，端方向各延伸 10
個堿基。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中Hl亞型引物探針混合液中Hl亞型寡核 苷酸探針的序列為5，-CGGCAACACCAACCAGCAGAAAGC-3，(SEQ ID NO :3)。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，RT-PCR反應液包括一步法RT-PCR反應緩沖 液和 DEPC 水，其中一步法 RT-PCR 反應緩沖液包含 10mmol/L Tris-HCl (pH8. 0)、150mmol/L KC1、2. 0mmol/LMgCl2O根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，RT-PCR酶系由逆轉(zhuǎn)錄酶(RT酶)、熱啟動Taq 酶、RNasin, dNTPs、酶系稀釋液組成，其中RT酶用量為1. 5 3. 5U/反應、熱啟動Taq酶用 量為3 7U/反應、RNasin用量為15 25U/反應、dNTPs濃度為0. 20mmol/L,酶系稀釋液為一般市售的酶系稀釋液。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中陰性質(zhì)控品為去離子水，陽性質(zhì)控品為含 有豬流感病毒NP基因序列的重組質(zhì)粒，質(zhì)粒由上下游引物擴增的PCR產(chǎn)物通過市售的載體 克隆構(gòu)建而成，所使用的上下游引物序列SEQ ID N0:1和SEQ ID NO :2，陽性質(zhì)控品濃度均 為IX IO6拷貝/ml。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中用于PCR擴增的最佳反應溫度和時間 為50°C逆轉(zhuǎn)錄 15min，1 個循環(huán)；94°C 15min, 1 個循環(huán)；最后 95°C 15s，55 60°C 45s，45 個 循環(huán)(收集熒光信號)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中試劑盒的待檢樣品是呼吸道樣本、血清、肺 組織等樣品。本發(fā)明提供的一步法實時熒光RT-PCR試劑盒可以檢測出豬流感病毒的最低濃度 為1.0X102COpieS/ml，說明本試劑盒具有非常好的靈敏度。本發(fā)明針對豬流感病毒NP基因設(shè)計特異性引物和探針，可檢測出豬流感病毒， 但不能檢測出禽流感病毒H5/H7/H9各亞型、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、高致病 性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株、豬細小病毒、豬鏈球菌、偽狂犬病毒等其他豬易感病原 體，說明本試劑盒具有很好的特異性。本發(fā)明提供的一步法實時熒光RT-PCR檢測試劑盒可以檢測呼吸道樣本、血清、肺 組織等樣品中的豬流感病毒；可為靈敏、快速早期診斷豬流感病毒感染提供可靠的實驗證 據(jù)。


圖1顯示陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品的檢測結(jié)果。陽性質(zhì)控品擴增曲線有明顯指數(shù) 增長期，成S型，可明確判定為陽性。陰性質(zhì)控品擴增曲線平直或斜向下且與基線無交叉， 沒有Ct值，可明確判定為陰性。圖2顯示特異性參考品的檢測結(jié)果。9份特異性參考品的擴增曲線平直或斜向下 且與基線無交叉，沒有Ct值，可明確判定為陰性。9份特異性參考品分別為禽禽流感病毒 H5/H7/H9各亞型、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒 變異株、豬細小病毒、豬鏈球菌、偽狂犬病毒等其他豬易感病原體。圖3顯示H3N2型豬流感病毒、Hmi型豬流感病毒、H1N2型豬流感病毒樣本的檢測 結(jié)果。3份樣本擴增曲線有明顯指數(shù)增長期，成S型，可明確判定為陽性。圖4顯示靈敏度參考品的檢測結(jié)果。6份靈敏度參考品中除了濃度為 1. 0 X lO^opies/ml的樣本擴增曲線平直或斜向下且與基線無交叉，沒有Ct值，可明確判定 為陰性。其余樣本均可明確判定為陽性。
具體實施例方式下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。實施例1 豬流感病毒檢測試劑的研制1、引物和探針的設(shè)計通過對已報導豬流感病毒的核酸序列進行序列比對分析， 分別以豬流感病毒HP基因為擴增靶位點，選擇無二級結(jié)構(gòu)且高度保守的區(qū)段，根據(jù)引物探針設(shè)計的基本原則，利用軟件和人工設(shè)計多對引物和探針。2、臨床樣本的選擇根據(jù)國內(nèi)外相關(guān)文獻報道表明，可以呼吸道樣本、血清、肺組 織等樣品。3、反應體系的建立與優(yōu)化樣品的準備以構(gòu)建的含有目的擴增區(qū)域的質(zhì)粒作為豬流感病毒檢測的陽性質(zhì)控 品；以禽流感病毒H5/H7/H9各亞型、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、高致病性豬繁殖 與呼吸綜合征病毒變異株、豬細小病毒、豬鏈球菌、偽狂犬病毒作為特異性參考品；以去離 子水作為陰性質(zhì)控品，分別用TRIZOL提取上述陽性質(zhì)控品與特異性參考品的RNA，陰性質(zhì) 控品待用。引物探針的篩選以上述1中設(shè)計的多組引物探針分別檢測上述的陽性質(zhì)控品與 陰性參考品的RNA，經(jīng)反復試驗，篩選出特異性、靈敏度和重復性好的最佳引物探針組合。 (如序列表中 SEQ ID NO :1 SEQ ID NO 3)。引物探針濃度的優(yōu)化在反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從2pmol/ 反應至15pmol/反應梯度的引物和從2pmol/反應至15pmol/反應濃度梯度的探針進行PCR 反應，經(jīng)多次重復試驗發(fā)現(xiàn)引物和探針濃度在5 15pmol/反應之間均可，其中最佳的引物 濃度為5pmol/反應、探針濃度為5pmol/反應。鎂離子濃度的優(yōu)化在反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從lmmol/L 至2. 5mmol/L濃度梯度的鎂離子進行PCR反應，經(jīng)多次重復試驗，最終確定最佳的鎂離子濃 度為 2. Ommol/Lο熱啟動Taq酶用量的優(yōu)化在25 μ L反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用 從IU (酶單位)至8U濃度梯度的酶用量/反應進行PCR反應，經(jīng)多次重復試驗，最終確定 最佳的熱啟動Taq酶用量為3 7U/反應。RT酶用量的優(yōu)化在25μ L反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從 IU (酶單位)至8U濃度梯度的酶用量/反應進行PCR反應，經(jīng)多次重復試驗，最終確定最佳 的RT酶用量為1. 5 3. 5U/反應。RNasin用量的優(yōu)化在25 μ L反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從 5U(酶單位)至40U濃度梯度的酶用量/反應進行PCR反應，經(jīng)多次重復試驗，最終確定最 佳的RNasin用量為15 25U/反應。dNTPs濃度的優(yōu)化在反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從0. lmmol/L 至0. 25mmol/L濃度梯度的dNTPs進行PCR反應，經(jīng)多次重復試驗，最終確定最佳的dNTPs 濃度為 0. 20mmol/Lo反應溫度的優(yōu)化根據(jù)酶的活性和靶多核苷酸的長度，主要對退火溫度和延伸時 間進行了優(yōu)化，經(jīng)多次重復試驗，最終確定最佳的反應溫度和時間為50°C逆轉(zhuǎn)錄15min，l 個循環(huán)；94°C 15min, 1個循環(huán)；最后95°C 15s, 55 60°C 45s, 45個循環(huán)(收集熒光信號)。實施例2 豬流感病毒檢測試劑盒及其使用1、制備包括下列組成成分的試劑盒RNA提取液(50ml/管)1管、引物探針混合液 (50 μ 1/管)1管、RT-PCR反應液(360 μ 1/管)1管、RT-PCR酶系(75 μ 1/管)1管，陰性質(zhì) 控品(200 μ 1/管)1管、陽性質(zhì)控品(ΙΟΟμΙ/管)1管。2、標本采集、運送和保存
根據(jù)實際情況進行標本采集，可檢測的標本包括呼吸道樣本、血清、肺組織等樣 品。采集方法如下①呼吸道樣本拭子擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，將拭子浸入4-5ml采 樣液中，密封送檢；②血清無菌采集靜脈血約1ml，分別于室溫和4°C靜置2小時和1小時 后，離心(8，000rpm，5分鐘)分離并收集血清標本；③肺組織利用支氣管鏡對肺部可疑病 灶進行活組織取樣，并用組織勻漿器對組織樣本進行勻漿待用。標本可立即用于測試，也可以保存于-70°C待測，保存期為6個月。標本運送采用 0°C冰壺3、檢測步驟(l)RNA 提取取上述類型的樣本各100 ill (樣品不足100 U 1時請補加適量生理鹽水重懸)，放 置于1. 5ml滅菌離心管，加入200 u 1 Trizol試劑及100 u 1氯仿，用振蕩器強力振蕩20秒
后靜置3分鐘；2 8°C下12，OOOrpm離心lOmin，吸取上清至另一干凈的1. 5ml離心管；加入0. 2ml氯仿，蓋緊蓋子，手動用力顛倒搖動15s (不可用振蕩器)，室溫孵育 2 3min ；2 8°C下12000rpm離心15min后，取最上層的上清液至另一干凈的1. 5ml離心 管；加入0. 5ml預冷的異丙醇，緩慢顛倒充分混勻后，_20°C靜置15min，2 8°C， 12000rpm離心lOmin，小心棄盡上清液；加入1ml預冷的70%的冰冷乙醇，手動顛倒數(shù)次洗滌沉淀，2 8°C，8000rpm離心 5min，小心棄盡上清液；空氣或真空干燥5 lOmin，加入50 ii 1 DEPC H20，55 60°C下孵育lOmin，手指 輕輕彈打管底，使其充分溶解，直接用于實驗或-70°C保存?zhèn)溆谩?2)PCR反應與結(jié)果分析分別取引物探針混合液2 u 1、RT_PCR反應液15 u 1、RT_PCR酶系3 yl配制成反應體系。取陰性質(zhì)控品、標本、陽性質(zhì)控品各5 iU，分別加入反應體系中使用市售的熒光 定量PCR儀(如ABI7500)進行PCR擴增。PCR循環(huán)條件是50°C逆轉(zhuǎn)錄15min，1個循環(huán)； 94°C 15min, 1個循環(huán)；最后95°C 15s，55 60°C 45s，45個循環(huán)(收集熒光信號)。反應結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。根據(jù)PCR擴增結(jié)果所得到的曲線，分析實驗結(jié)果。 如擴增曲線有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。實施例3 應用豬流感病毒檢測試劑盒檢測樣品以H3N2型豬流感病毒、Hmi型豬流感病毒、H1N2型豬流感病毒樣本以及實施例1 中的陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品、特異性參考品作為待檢樣本，按照實施例2的方法分別檢測 這些樣本，H3N2型豬流感病毒、H1N1型豬流感病毒、H1N2型豬流感病毒樣本以及陽性質(zhì)控 品檢測結(jié)果為陽性，陰性質(zhì)控品和特異性參考品檢測結(jié)果均為陰性(參見附圖1，2，3)。實施例4 豬流感病毒檢測試劑盒靈敏度實驗分別由濃度為1. 0X106copies/ml、l. 0X105copies/ml、l. 0X104copies/ml、 1. OX 103copies/ml、l. OX 102copies/ml、l. OX lOkopies/ml 的含有豬流感病毒 NP 基因的質(zhì)粒組成靈敏度參考品，按照實施例2的方法分別檢測這6份樣本，檢測結(jié)果表明，本試劑 盒的靈敏度為1.0X102copies/ml (見附圖4)。序列表<110>中山大學達安基因股份有限公司<120> 一種實時熒光RT-PCR檢測豬流感病毒的試劑盒<140><141><160>3<210>1
<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增的引物。<400>1ccgttattgggcgattcg<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增的引物。<400>2catcacggtcgcacgttca<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增的探針。<400>3cggcaacaccaaccagcagaaagc
10
權(quán)利要求
一種實時熒光RT-PCR檢測豬流感病毒的試劑盒，試劑盒包括(1)分別裝有RNA提取液、反應體系、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品并加蓋密封的多個試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其中反應體系包括引物探針混合液、RT-PCR反應液、RT-PCR酶系，其特征在于引物探針混合液中正向引物的序列為5’-CCGTTATTGGGCGATTCG-3’，反向引物的序列為5’-CATCACGGTCGCACGTTCA-3’，正、反向引物可向5’和3’端方向各延伸10個堿基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于引物探針混合液中寡核苷酸探針的序列 為5， -CGGCAACACCAACCAGCAGAAAGC-3，。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于正、反向引物的濃度均為5pmol/反應，寡核 苷酸探針的濃度為5pmol/反應。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，RT-PCR酶系由逆轉(zhuǎn)錄酶(RT酶)、熱啟動Taq酶、RNasin、 dNTPs、酶系稀釋液組成，其特征還在于其中RT酶用量為1. 5 3. 5U/反應、熱啟動Taq酶 用量為3 7U/反應、RNasin用量為15 25U/反應、dNTPs濃度為0. 20mmol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于PCR擴增的最佳反應溫度和時間為50°C 逆轉(zhuǎn)錄15min，1個循環(huán)；94°C 15min, 1個循環(huán)；最后95°C 15s，55 60°C 45s，45個循環(huán)(收 集熒光信號)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種實時熒光RT-PCR檢測豬流感病毒的試劑盒，特別是涉及以一步法實時熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術(shù)早期、快速診斷豬流感病毒感染的試劑盒。本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，通過本發(fā)明的試劑盒實現(xiàn)對呼吸道樣本、血清、肺組織等樣品中的豬流感病毒進行早期快速診斷。
文檔編號G01N21/64GK101886135SQ20091003940
公開日2010年11月17日 申請日期2009年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月12日
發(fā)明者何蘊韶, 李明, 陳華云, 高秀杰 申請人:中山大學達安基因股份有限公司