專利名稱：一種檢測桑樹花葉萎縮病病原體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病原體的鑒定及桑樹及其幼苗轉(zhuǎn)運(yùn)中的檢疫等用途，尤其涉及桑樹
及其幼苗在轉(zhuǎn)運(yùn)中的檢疫等應(yīng)用，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
桑花葉型萎縮病又稱"癃桑"。早在1313年古農(nóng)書中就有記載(王禎農(nóng)書，元 代圣慶2年)?，F(xiàn)今在江、浙蠶農(nóng)所謂的"癃桑"，實(shí)際上具有多種癥狀。其中，葉部 呈現(xiàn)黃綠相間的花葉癥的一種，定名為桑花葉型萎縮病(蒯元璋，1965)。此病僅分布在 中國，在我國的浙江、四川、安徽、江蘇、江西、云南、上海、重慶等省、市蠶區(qū)均有 發(fā)生。因此，此病已成為國內(nèi)重要的桑樹病害。1990年在病桑組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)類似類病毒 (Viroid)的小分子RNA病原體(蒯元璋、田波等，1990)。 2007年，費(fèi)建明等獲得了該病 原體的部分序列(費(fèi)建明等，2007)，并于2008年在GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄了該病原體的 全長序列。但目前該病尚無有效的防治方法。因此，對該病的檢疫將有助于防止該病的 進(jìn)一步擴(kuò)散。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速檢測桑樹花葉萎縮病病原體的方法。 一種檢測桑 樹花葉萎縮病病原體的方法，包括以下步驟 ①從待檢測的桑樹的葉片或芽體剪取樣品，提取總RNA得到提取溶液；
②在所述提取溶液中加入DNA分解酶，待DNA分解后得到總RNA溶液；
③取總RNA溶液中的溶液，將RNA進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA ;
對合成的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； ⑤取擴(kuò)增的cDNA，在瓊脂糖下電泳，得到提純的cDNA; ⑥將經(jīng)過步驟⑤得到的cDNA在紫外燈下觀察是否有擴(kuò)增的DNA條帶。 作為優(yōu)選，所述的將RNA進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄是由腺苷酸、尿苷酸、胸腺嘧啶和尿
嘧啶隨機(jī)組合的長度為6個(gè)核苷酸的隨機(jī)引物的混合物為引物。 作為優(yōu)選，所述步驟④中PCR擴(kuò)增時(shí)使用的引物序列為引物l: 5' -GTC
CAG ACA CAC ATC T-3 ，，引物2 : 5' -TGA TGA GTT CGA AAG AAC-3'。 作為優(yōu)選，所述PCR擴(kuò)增條件是先于95t:變性5分鐘然后進(jìn)入30個(gè)PCR的循
環(huán)，循環(huán)結(jié)束后，再在72t:條件下保持10分鐘。 作為優(yōu)選，步驟⑥所述紫外燈觀察在356bp位置進(jìn)行。 作為優(yōu)選，步驟①中所述的提取總RNA是以Trizol試劑作為提取劑提取總 RNA。 在瓊脂糖電泳后，如果能在紫外燈下在356bp位置看見擴(kuò)增的DNA條帶，則表 明該桑樹或苗中攜帶該病原體。如果樣品中存在該分子，整枝植株應(yīng)予以銷毀，以防止 該病的擴(kuò)散。
本發(fā)明的有益效果在于可通過對該病原體特征序列的擴(kuò)增來檢測病原體的存 在， 一般可在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成，快速靈敏。
具體實(shí)施例方式
本具體實(shí)施例僅僅是對本發(fā)明的解釋，其并不是對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù) 人員在閱讀完本說明書后可以根據(jù)需要對本實(shí)施例做出沒有創(chuàng)造性貢獻(xiàn)的修改，但只要 在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)都受到專利法的保護(hù)。
實(shí)施例一 —種檢測桑樹花葉萎縮病病原體的方法，包括如下步驟 ①桑樹葉或芽體的總RNA提取從待檢測的桑樹或桑苗的葉片或芽體剪取0.5 克樣品，以Trizol試劑提取總RNA。在經(jīng)氯仿提取除去多余的蛋白質(zhì)后，在提取溶液中 加入DNA分解酶以除去溶液中的DNA獲得總RNA。 ②cDNA的合成取經(jīng)步驟①得到的總RNA 0.1 0.5mg，采用由腺苷酸、尿 苷酸、胸腺嘧啶、尿嘧啶隨機(jī)組合的長度為6個(gè)核苷酸的隨機(jī)引物的混合物為引物，用 RNA逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，42"C下保持50分鐘，合成cDNA。
③特征片段的PCR擴(kuò)增以合成的cDNA做模板，用引物1 : GTC CAG ACA CAC ATC T禾口引物2 : TGA TGA GTT CGA AAG AAC來擴(kuò)增cDNA片段。反應(yīng)液的組 成包括cDNAl微升，引物l和引物2(10納克/毫升)各l微升，Taq酶0.5微升，10 倍的反應(yīng)緩沖液2.5微升，dNTP(10納克/毫升)l微升，水18微升，總體積25微升。 PCR擴(kuò)增條件為先95t:變性5分鐘，進(jìn)入30個(gè)PCR的循環(huán)，即94。C停留30秒后調(diào)到 55t:30秒，再停留30秒后調(diào)到72t:，最后保持l分鐘。整個(gè)循環(huán)結(jié)束后，再在72t:停 留10分鐘，以達(dá)到充分延伸。 ④特異片段的鑒定取PCR反應(yīng)液5微升，在2%的瓊脂糖中電泳，在紫外燈下 在356bp位置觀察DNA條帶是否存在，如果出現(xiàn)條帶，表明樣品中含上述的病原體，應(yīng) 予以控制和銷毀。
實(shí)施例二 —種檢測桑樹花葉萎縮病病原體的方法，包括如下步驟 ①桑樹葉或芽體的總RNA提取從待檢測的桑樹或桑苗的葉片或芽體剪取0.8 克樣品，以Trizol試劑提取總RNA。在經(jīng)氯仿提取除去多余的蛋白質(zhì)后，在提取溶液中 加入DNA分解酶以除去溶液中的DNA獲得總RNA。 ②cDNA的合成取經(jīng)步驟①得到的總RNA 0.1 0.5mg，采用由腺苷酸、尿 苷酸、胸腺嘧啶、尿嘧啶隨機(jī)組合的長度為6個(gè)核苷酸的隨機(jī)引物的混合物為引物，用 RNA逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，4(TC下保持50分鐘，合成cDNA。
③特征片段的PCR擴(kuò)增以合成的cDNA做模板，用引物1 : GTC CAG ACA CAC ATC T禾口引物2 : TGA TGA GTT CGA AAG AAC來擴(kuò)增cDNA片段。反應(yīng)液的組 成包括cDNAl微升，引物1和引物2(10納克/毫升)各1微升，Taq酶0.6微升，10 倍的反應(yīng)緩沖液2.8微升，dNTP(10納克/毫升)l微升，水若干微升，總體積25微升。 PCR擴(kuò)增條件為先96t:變性5分鐘，進(jìn)入30個(gè)PCR的循環(huán)，即94。C停留30秒后調(diào)到 55t:30秒，再停留30秒后調(diào)到72t:，最后保持l分鐘。整個(gè)循環(huán)結(jié)束后，再在7(TC停留10分鐘，以達(dá)到充分延伸。 ④特異片段的鑒定取PCR反應(yīng)液6微升，在2%的瓊脂糖中電泳，在紫外燈下 在356bp位置觀察DNA條帶是否存在，如果出現(xiàn)條帶，表明樣品中含上述的病原體，應(yīng) 予以控制和銷毀。
實(shí)施例三 —種檢測桑樹花葉萎縮病病原體的方法，包括如下步驟 ①桑樹葉或芽體的總RNA提取從待檢測的桑樹或桑苗的葉片或芽體剪取1.0 克樣品，以Trizol試劑提取總RNA。在經(jīng)氯仿提取除去多余的蛋白質(zhì)后，在提取溶液中 加入DNA分解酶以除去溶液中的DNA獲得總RNA。 ②cDNA的合成取經(jīng)步驟①得到的總RNA 0.2 0.8mg，采用由腺苷酸、尿 苷酸、胸腺嘧啶、尿嘧啶隨機(jī)組合的長度為6個(gè)核苷酸的隨機(jī)引物的混合物為引物，用 RNA逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，45"C下保持50分鐘，合成cDNA ;
③特征片段的PCR擴(kuò)增以合成的cDNA做模板，用引物1 : GTC CAG ACA CAC ATC T禾口引物2 : TGA TGA GTT CGA AAG AAC來擴(kuò)增cDNA片段。反應(yīng)液的組 成包括cDNAl微升，引物l和引物2(10納克/毫升)各l微升，Taq酶1.0微升，10 倍的反應(yīng)緩沖液3.0微升，dNTP(10納克/毫升)l微升，水若干微升，總體積25微升。 PCR擴(kuò)增條件為先98t:變性5分鐘，進(jìn)入30個(gè)PCR的循環(huán)，即94"C停留30秒后調(diào)到 55t:30秒，再停留30秒后調(diào)到72t:，最后保持l分鐘。整個(gè)循環(huán)結(jié)束后，再在75t:停 留10分鐘，以達(dá)到充分延伸。 ④特異片段的鑒定取PCR反應(yīng)液10微升，在2%的瓊脂糖中電泳，在紫外燈 下在356bp位置觀察DNA條帶是否存在，如果出現(xiàn)條帶，表明樣品中含上述的病原體， 應(yīng)予以控制和銷毀。
權(quán)利要求
一種檢測桑樹花葉萎縮病病原體的方法，包括以下步驟①從待檢測的桑樹的葉片或芽體剪取樣品，提取總RNA得到提取溶液；②在所述提取溶液中加入DNA分解酶，待DNA分解后得到總RNA溶液；③取總RNA溶液中的溶液，將RNA進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA；④對合成的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；⑤取擴(kuò)增的cDNA，在瓊脂糖下電泳，得到提純的cDNA；⑥將經(jīng)過步驟⑤得到的cDNA在紫外燈下觀察是否有擴(kuò)增的DNA條帶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測桑樹花葉萎縮病病原體的方法，其特征在于所 述的將RNA進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄是由腺苷酸、尿苷酸、胸腺嘧啶、尿嘧啶隨機(jī)組合的長度為 6個(gè)核苷酸的隨機(jī)引物的混合物為引物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測桑樹花葉萎縮病病原體的方法，其特征在于所 述步驟 中PCR擴(kuò)增時(shí)使用的弓I物序列為引物1 : 5-GTC CAG ACA CAC ATC T-3'， 引物2 : 5' -TGA TGA GTT CGA AAG AAC-3'。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測桑樹花葉萎縮病病原體的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增條件是先于95t:變性5分鐘然后進(jìn)入30個(gè)PCR的循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后，再在 72t:條件下保持10分鐘。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種檢測桑樹花葉萎縮病病原體的方法，其特征在于所 述的循環(huán)具體為94t:停留30秒后，于55t:停留30秒后，于72t:保持l分鐘。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測桑樹花葉萎縮病病原體的方法，其特征在于步 驟⑥所述紫外燈觀察在356bp位置進(jìn)行。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測桑樹花葉萎縮病病原體的方法，其特征在于步 驟①中所述的提取總RNA是以Trizol試劑作為提取劑提取總RNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及涉及一種檢測桑樹花葉萎縮病病原體的方法，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。具體包括以下步驟①從待檢測的桑樹的葉片或芽體剪取樣品，提取總RNA得到提取溶液；②在所述提取溶液中加入DNA分解酶，待DNA分解后得到總RNA溶液；③取總RNA溶液中的溶液，將RNA進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA；④對合成的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；⑤取擴(kuò)增的cDNA，在瓊脂糖下電泳，得到提純的cDNA；⑥將經(jīng)過步驟⑤得到的cDNA在紫外燈下觀察是否有擴(kuò)增的DNA條帶。本發(fā)明可通過對該病原體特征序列的擴(kuò)增來檢測病原體的存在，可在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成，快速靈敏。
文檔編號C12Q1/70GK101691616SQ200910101859
公開日2010年4月7日 申請日期2009年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月3日
發(fā)明者施國方, 李玉峰, 王文兵, 白雪川, 費(fèi)建明 申請人:湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院