專利名稱：特異性擴(kuò)增hBex1基因的引物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一對(duì)特異性擴(kuò)增/^exl (Homo sapiens brain expressed, X-linked 1 )基因的引物及其在檢測(cè)生物樣品中/^exl基因的表達(dá)水平中 的應(yīng)用。
(二)
背景技術(shù)：
目前，化學(xué)藥物治療是臨床治療慢性髓系白血病細(xì)胞的主要方法，然 部分患者在獲得一定時(shí)間的緩解期后，由于對(duì)化療藥物產(chǎn)生了繼發(fā)性耐 藥，導(dǎo)致病情迅速展。判斷患者是否發(fā)生了繼發(fā)性耐藥，目前只能通過患 者用藥后的臨床表現(xiàn)來(lái)評(píng)價(jià)，缺乏經(jīng)濟(jì)、迅速有效的檢測(cè)手段。
Bex (Brain expressed, X-linked)是一類小分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中介體，目 前發(fā)現(xiàn)5個(gè)高度同源的成員，即Bexl (TCEAL8), Bex2, Bex3, Bex4 (TCEAL7 )， Bex5, —般認(rèn)為Bex位于P75NTR/TrkA/B通路下游的細(xì)胞 死亡前體(NADE)。 Bex基因?qū)賆染色體連鎖基因家族，其基因的功能 目前尚未完全明了 ，近期的研究顯示/z5exl基因在獲得性耐藥的慢性髓系 白血病細(xì)胞中表達(dá)水平明顯下降。
(三)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明正是基于此研究發(fā)現(xiàn)，設(shè)計(jì)了一對(duì)可以特異性擴(kuò)增/^exl基因 的引物，通過PCR技術(shù)檢測(cè)生物樣品中/^exl基因的表達(dá)水平，以協(xié)助 判斷慢性髓系白血病細(xì)胞是否存在獲得性耐藥。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
特異性擴(kuò)增/^exl基因的引物，序列如下上游序列5'畫GATCGTCTCGAGCAGGAGTAATGGAGTCCA-3'; 下游序列5'-TCTGCTGGATCCTCAGGGCATAAGGCAAAACTC畫3'。
本發(fā)明還涉及所述的引物在檢測(cè)生物樣品/28exl基因的表達(dá)水平中
的應(yīng)用，應(yīng)用所述的引物通過PCR技術(shù)特異性擴(kuò)增生物樣品中的/LBexl 基因，從而檢測(cè)其/z5exl基因的表達(dá)水平，判斷慢性髓系白血病細(xì)胞是 否存在獲得性耐藥。若Mexl基因的表達(dá)水平若表達(dá)水平明顯下降，則 說明樣本待檢測(cè)生物樣品的/^exl基因獲得性耐藥，反之沒有產(chǎn)生耐藥 性。應(yīng)用本發(fā)明的引物進(jìn)行PCR,擴(kuò)增效率高，特異性強(qiáng)，只擴(kuò)增出一 條DNA條帶。因此可用于檢測(cè)生物樣品中/z5e:d基因的表達(dá)水平，協(xié)助 判斷慢性髓系白血病細(xì)胞是否存在獲得性耐藥。/LBexl基因序列如SEQ IDNO.l所示。
具體的，所述的應(yīng)用為以待分析樣品RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為 模板，加入所述特異性擴(kuò)增/z&xl基因的引物、PCR緩沖液、脫氧三磷 酸核苷混合物、DNA聚合酶和Mg"配成PCR反應(yīng)液，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反 應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，獲得DNA片段即為/^exl基因。 所述應(yīng)用的關(guān)鍵在于特異性^ 1物的設(shè)計(jì)，PCR反應(yīng)液中的其他組分， 比如DNA聚合酶、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物等，均可參照本 領(lǐng)域常規(guī)組成。所述脫氧三磷酸核苦混合物通常為dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP物質(zhì)的量比l: 1: 1: 1的混合物。
具體的，所述PCR反應(yīng)液終濃度組成如下 PCR緩沖液 終濃度為lx dNTP(dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP )各100~400 ju mol/L 特異性擴(kuò)增/z&:cl基因的引物 各50 200 ja mol/L
模板 1(T3 10"g/LTaqDNA聚合酶 1 5U/反應(yīng) Mg2+: 0.5 5mmol/L 溶劑為ddH20。
所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下94。C變性2分鐘后，進(jìn)行如下35個(gè)循 環(huán)94。C變性15S， 58。C退火30S, 72。C延伸30S。
PCR緩沖液終濃度為lx,是指PCR緩沖液中各組分在反應(yīng)液中的 終濃度與1 x PCR buffer相同。10xPCR buffer組成為100mmol/l Tris-HCl pH8.3, 15mmol/LKCl， 0.01% (W/V)明膠，溶劑為DEPC水。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在應(yīng)用本發(fā)明的引物進(jìn)行PCR,擴(kuò)增 效率高，特異性強(qiáng)，只擴(kuò)增出一條條帶，可用于檢測(cè)生物樣品中/^exl 基因的表達(dá)水平，協(xié)助判斷慢性髓系白血病細(xì)胞是否存在獲得性耐藥。
(四)


圖1為ASexl基因在耐長(zhǎng)春新i成的K562細(xì)胞和K562細(xì)胞中的表達(dá)量比較。
(五)
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍 并不僅限于此
實(shí)施例1:
所用引物
上游序列Pl: 5'國(guó)GATCGTCTCGAGCAGGAGTAATGGAGTCCA國(guó)3';
下游序列P2: 5'-TCTGCTGGATCCTCAGGGCATAAGGCAAAACTC-3'。 所述引物P1、 P2,由上海生工按照引物核香酸序列合成。 模板為紅白血病細(xì)胞(K562細(xì)胞，購(gòu)于ATCC)和耐長(zhǎng)春新堿(VCR)的K562細(xì)胞(K562/VCR細(xì)胞，浙江大學(xué)腫瘤研究所提供)提取RNA 反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA。具體方法為德國(guó)Qigen公司的RNA提取試劑 盒提取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞總RNA后，用01igodT7-T24 (長(zhǎng)度為7、 8、 9、 10……、22、 23、 24的Oligo dT等比例的混合物)作為引物，美國(guó)Ambion 公司的IVT MEGAscript T7試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，苯酚/氯仿/異 戊醇抽4是純化，然后經(jīng)RNeasy mini columns (Qigen,德國(guó))純化。
所用PCR緩沖液為10xPCR buffer (購(gòu)于上海生工)，組成為 100mmol/lTris國(guó)HClpH8.3, 15mmol/LKCl， 0.01% ( W/V )明膠。
PCR反應(yīng)液組成
10xPCR buffer: 10uL
四種dNTP混合物 各200umol/L
引物P1、 P2: 各100pmo1
模板 lug
Mg2+: 1.5mmol/L TaqDNA聚合酶(上海生工) 2.5U
上述混合物再加入ddH20至反應(yīng)體系為lOOuL,彈指混勻，離心15S 將液體甩至底部，在PCR儀上94°C變性2分鐘后，進(jìn)行如下35個(gè)循環(huán) 94。C變性15S, 58。C退火30S, 72。C延伸30S。運(yùn)行完畢后各取20uL樣 品，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。
結(jié)果PCR產(chǎn)物由1%瓊脂糖凝膠電泳分離，只獲得了一條DNA片 段，割膠回收后送上海生工測(cè)序顯示其序列與SEQ ID NO.l所示的核苷 酸序列完全符合，表明引物P1、 P2能夠特異性擴(kuò)增/zSe;cl基因，結(jié)果同 時(shí)顯示/z5ejd基因表達(dá)量在耐長(zhǎng)春新堿的K562細(xì)胞中較K562細(xì)胞明顯 下降(見圖1, (3-actin為內(nèi)參，二者表達(dá)水平相當(dāng))。序列表一ST25.txt
SEQUENCE LISTING <110>浙江大學(xué)
<120>特異性擴(kuò)增hBexl基因的引物及其應(yīng)用
<130>
<160> 3
<170> Patentln version 3.4
<210> 1
<211> 862
<212〉 DNA
<213> Human astrovirus
<400〉 1
cttggcggtg acgcacggcc ctcacgtgac cgggagctgc agagctacgc agccttcggt 60 gcagtcgtca ctcgtgtctc gctaccagct ccccgctgcc ctgcgctcgg cgggctggca 120 tccggcccgg gggaaagcgg accagccctt ctgcaggtct gcggggccaa gtgtcccggc 180 ggcgcacctc gtggcgagaa tcgggagaag gaggagacta caaggategg cccaggagta 240 atggagtcca aagagaaacg agcagtaaac agtctcagca tggaaaatgc caaccaagaa 300 aatgaagaaa aggagcaagt tgctaataaa ggggagccct tggccctccc tttggatgct 360 ggtgaatact gtgtgcctag aggaaatcgt aggcggttcc gcgttaggca gcccatcctg 420 cagtatagat gggatatgat gcataggctt ggagaaccac aggcaaggat gagagaagag 480 aatatggaaa ggattgggga ggaggtgaga cagctgatgg aaaagctgag ggaaaagcag 540 ttgagtcata gtctgcgggc agtcagcact gacccccctc accatgacca tcatgatgag 600 ttttgcctta tgccctgaat cctgatggtt tccctaaagt tattacggaa acagacccct 660 gctttcgaat ttacatgttc atgatgtgcc cttgttgtaa acctttacct gtcacttgtt 720 tacgtgggtc tcctattacc agcttctaat tgaatattgt gtttttgaac cagtctgtaa 780 gatttttgtt agcagaagaa ttttacctat tgcatggaaa gatgctcatt atagtgaagt 840 taataaagca cctttaaaaa gc 862序列表—ST25.txt <210> 2 — <211> 30 <212> DNA <213> Unknown
<220>
<223>人工序列 <400> 2
gatcgtctcg agcaggagta atggagtcca 30
<210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Unknown
<220>
<223>人工序列 <400> 3
tctgctggat cctcagggca taaggcaaaa etc 3權(quán)利要求
1. 特異性擴(kuò)增hBex1基因的引物，序列如下上游序列5′-GATCGTCTCGAGCAGGAGTAATGGAGTCCA-3′；下游序列5′-TCTGCTGGATCCTCAGGGCATAAGGCAAAACTC-3′。
2. 如權(quán)利要求1所述的引物在檢測(cè)生物樣品/LBexl基因的表達(dá)水平中的 應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為以檢測(cè)生物樣 品RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，加入所述特異性擴(kuò)增Mejd基因 的引物、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物、DNA聚合酶和Mg2+ 配成PCR反應(yīng)液，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳 分離，獲得DNA片段即為/z&xl基因。
4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述PCR反應(yīng)液終濃度組成如 下PCR緩沖液 dNTP特異性擴(kuò)增/^exl基因的引物 模板TaqDNA聚合酶 Mg2+:終濃度為1x各100 400|amol/L 各50 200 n mol/Lio-3~ioVl1 5U/反應(yīng) 0.5 5mmol/L溶劑為ddH20。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下 94。C變性2分鐘后，進(jìn)行如下35個(gè)循環(huán)94。C變性15S, 58。C退火30S, 72。C延伸30S。
全文摘要
本發(fā)明提供了一對(duì)特異性擴(kuò)增hBex1(Homo sapiens brainexpressed，X-linked 1)基因的引物及其在特異性擴(kuò)增hBex1基因中的應(yīng)用。所述特異性擴(kuò)增hBex1基因的引物序列如下上游序列5′-GATCGTCTCGAGCAGGAGTAATGGAGTCCA-3′；下游序列5′-TCTGCTGGATCCTCAGGGCATAAGGCAAAACTC-3′。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在應(yīng)用本發(fā)明的引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增效率高，特異性強(qiáng)，只擴(kuò)增出一條條帶，可用于檢測(cè)生物樣品中hBex1基因的表達(dá)水平，協(xié)助判斷慢性髓系白血病細(xì)胞是否存在獲得性耐藥。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101532059SQ20091009754
公開日2009年9月16日 申請(qǐng)日期2009年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月9日
發(fā)明者丁克峰, 龐林榮, 朱永良, 乾 肖 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)