專利名稱：提高植物同化和吸收甲醛能力的植物表達載體及其應用的制作方法
提髙植物同化和吸收甲醛能力的植物^&^體及其JOT
駄領域
本發(fā)明屬于植物基因工程領域，具體地，涉及一種提高植物同化和吸收甲醛能
力所需植物表達載體PK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi及其在提高植物吸收和耐受外源
甲醛能力中的應用。
背景絲
甲醛目前己被認為是一種主要的室內空氣污染氣體，它的污染源來自煙霧，家 具，工業(yè)粘膠劑及varnishes等(shah and singh 1988)。甲醛反應能力極強，能 與蛋白質，核酸和脂類產生非特異性的反應，是一種非?；顫姷幕衔?Feldman 等，Prog Nucleic Acid Res Mol Biol， 1973,13:1-49)，因j!W所有的生物來說都 有很高的毒性。目前清除污染甲醛通常使用的方法有三種 一是使用環(huán)保材料；二 是開窗通風；三是用植物或除污劑清除污染，使用除污劑有二次污染的可能。用室 內栽培植物清除甲醛污染，是最自然、最環(huán)保的方式，科學研究證明確魏些植物 售g夠吸收，甲醛，但吸收能力和速度非常有限(Giese等，1994， Plant Physiol. 104: 1301-1309)。
^^難內S31各種脫甲^itS^，也會產生^i^度的甲醛，所以幾乎所有的生 物對甲醛!1^各自的解 1制。1t^物m甲醛毒性有不同的方法，總體上可歸納為兩 Wl制氧化甲^^0a;禾l傭同4fcii^固定甲醛。甲基營養(yǎng)菌是一類能利用
ca的各種還原態(tài)形式如甲烷、甲醇、甲胺作為碳源和能源生長的微生物。甲基營養(yǎng)
型細菌同化甲醛的途徑有三種核酮糖單磷酸途徑(RuMP)，絲氨酸途徑，核酮糖 二磷酸途徑(Ribulose bisphosphate pathway, RuBP)。 RuMP途徑作為高效捕^^1 離甲醛的一個系統(tǒng)，在甲醛濃度極低的情況下還能，作用，在該途45中固定甲醛 的關鍵酶是6-磷酸己酮糖(Hexulose-6-P)合成酶(HPS)和6-磷自糖異構酶(PHI)， 目前已從多種甲基營養(yǎng)型細菌中克隆到hps和phi基因。由于RuMP途徑的所有反通過基因工程手段，可以將RuMP途徑的兩個關鍵基因hps和phi導入一些非 甲基營養(yǎng)菌中，增強其甲醛代謝能力。
1，5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)是植物中駄量最大的蛋白質，這種蛋白 質的含量占植物細胞中可溶性蛋白的40-50%。 Rubisco的小亞基(rbcS)由細胞核 基因編碼，控制rbcS基因表達的啟動子為光誘導型啟動子(PrbcS)， PrbcS的作用 有很強的組織特異性，需要光信號的誘導，在莖中有低水平的表達，在葉片中的表 達最強。用報告基因的研究結果表明在葉片中PrbcS的活性比CaMV35S的高3-4倍， 因此PrbcS是一種很強的光誘導型啟動子(Jefferson等，1987，EMB0， 6:3901-3907)， 常被用來實現目的基因在葉片中的高水平,。rbcS的轉移肽可以將其定位到葉綠 體中，因此也在植物基因工程中經常被用于把表達的目標蛋白定位到葉綠體中。
迄今為止，現有技術中未見有提高植物同化和吸收甲醛能力的植物表達載體 pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服天然植物代謝甲醛能力和速度非常有限的缺陷，禾擁基
因工程技術在觀賞植物葉片細胞的葉綠體中過量雜hps/phi基因，從而構建一條 有效代謝甲醛的同化途徑(圖l)，利用植物的光合作用同化甲醛，以提高植物吸收 和耐受甲醛的能力，創(chuàng)造有凈化室內甲醛污染的特殊觀賞植物，維護人體的健康。
本發(fā)明提供的提高植物代謝甲醛能力的植物表達載體是 pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi載體，它是含有甲基營養(yǎng)菌J^co/^c"W鵬卵striMB19 的6-磷酸己酮糖合成酶和6-磷酸果糖異構酶融合而成的雙功能酶HPS/PHI基因 hps/phi的植物表達載體。該載體中，hps/phi基因由番茄Rubisco 3C小亞基的光 誘導型啟動子和葉綠,移肽控制其在植物葉片葉綠體中過量表達。
為了實現本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術方案植物表達載體pK2-35S-PrbcS-W-hps/phi ，為含有番茄1， 5 二磷酸核酮糖羧化 酶(Rubisco)3C小亞基基因的光誘導型啟動子(PrbcS)及其轉移肽序列和甲基營養(yǎng) 菌卵s^i' MB19的6-磷酸己酮糖合成酶和6-磷酸果糖異構酶融合 而成的雙功能酶HPS/PHI基因的植物表達載體。
其中hps/phi基因的GenBank登錄號為AB292776。
其起始載體為P證7。
所述的hps/phi基因上游添加有從番茄基因組中分離出來的光誘導型啟動子 PrbcS和葉綠體基質定位序列。
所述的pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi載體中含有hps/phi基因，其hps/phi基 因的GenBank登錄號為AB292776，所述的hps/phi基因上游都有番茄Rubisco 3C 小亞基的啟動子PrbcS和葉綠體定位序列HcT，該植物^ii載體的起始載體為pK2GW7。
植物皿載體pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi由下述方法構建而成
(1) hps/phi基因的擴增
以hps/phi的原核表達載體pET-23a-hps/phi質粒為模板，用hps/phi基因的 特異性引物，上游引物5' r襲CACCGCATGCAGCTCCMGTCGCCATCG (城)，下游引 物3' 一 TCTAGATCACTCGAGGTTGGCGTGGCGCG 進行擴增，得PCR產物；
(2) hps/phi基因的TA克隆
回收并純化hps/phi基因片段，并將其連接到pMD18-T載體上，采用堿裂解法 提取質粒DNA， M: PCR檢測和酶切檢測獲得重纟M粒pMD-hps/phi;
(3) 入門載體pENT砂-PrbcS-*T-hps/phi的構建
用5 力I和feoRI切割pENTR*-PrbcS-*T~GFP和pMD-hps/phi ，回收載體 pENTR*-PrbcS-*T片斷和hps/phi基因片斷，用連接酶連接PENTR*-PrbcS-*T和 hps/phi基因片斷，獲得入門載體pENTRHc-PrbcS-W-hps/phi;
(4) hps/phi基因植物表達載體pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi的構建通過Gateway技術的LR反應把PrbcS_*T-hps/phi片段亞克隆到植物表達載體 pK2GW7中，獲得hps/phi基因的植物表達載體pK2-35S-PrbcS-H^T-hps/phi 。 植物表達載體pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi的構建方法，包括下述步驟
(1) hps/phi基因的擴增
以hps/phi的原核,載體pET-23a-hps/phi質粒為模板，用hps/phi基因的 特異性引物，上游引物5，孺M:CACCGCATGCAGCTCCMGTCGCCATCG (細)，下游引 物3， 2TZ2cB: TCTAGATCACTCGAGGTTGGCGTGGCGCG 進行擴增，得PCR產物；
(2) hps/phi基因的TA克隆
回收并純化hps/phi基因片段，并將其連接到pMD18-T載體上，采用堿裂解法 提取質粒DNA，通過PCR檢測和酶切檢測獲得重組質粒pMD-hps/phi;
(3) 入門載體pENTI^-PrbcS-*T-hps/phi的構建
用和￡coRI切割pENTR*-PrbcS-*T~GFP (見本發(fā)明人的另一申請專利，申 請?zhí)枮?00710066422. 9)和pMD-hps/phi ，回收載體pENTR*-PrbcS-*T片斷和 hps/phi基因片斷，用連接酶連接PENTI^-PrbcS-W和hps/phi基因片斷，獲得入 門載體pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi;
(4) hps/phi基因植物表達載體pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi的構建
通過Gateway技術的LR反應把PrbcS-*T-hps/phi片段亞克隆到植物^ii載體 pK2GW7 (Gateway的目的載體，比利時VIB/Gent公司)中，獲得hps/phi基因的植 物表達載體pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi 。
植物表達載體pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi在制皿高植物吸收和耐鈔卜源甲
醛的能力的轉基因植株中的應用。
因為HPS和PHI依次催化的反應的底物和產物都是植物開爾文循環(huán)的中間產 物，所以本發(fā)明技術方案的提出是基于甲基營養(yǎng)型細菌的甲醛同4^徑可以安裝成 高等植物開爾文羧化反應的一個支路，基于在植物的葉綠體中過量表達來自
7卵sWMB19的HPS和PHI可以增強轉基因植物對甲醛的抗性，并提高植物吸收和 同化外源甲醛的能力。
本發(fā)明載體中，hps/phi基因的上游添加有光誘導型啟動子PrbcS和葉綠體基 質定,列。本發(fā)明使用的光誘導型啟動子(PrbcS)和葉綠體定位序列是從番茄的 基因組中分離出來的rbcS-3C的啟動子和葉綠體基質定，列，是一個由 切割產生的1.7 kb的DNA片斷(Sugita et al. ， 1987， MGG， 209: 247-256)。
本發(fā)明利用光誘導型啟動子(PrbcS)和葉綠體基質定，列(*T)構建hps/phi 基因的植物表達載體，以便在轉基因植物葉片的葉綠體基質中過量表達6-磷酸己酮 糖合成酶/6-磷酸果糖異構酶的融合蛋白HPS/PHI，通過該融合蛋白在轉基因觀賞植 物的葉綠體中構建甲醛的光合作用同化途徑，增強植物同化甲醛的效率，進而提高 了植物吸收和耐受外源甲醛的能力。


圖1使用HPS/PHI構建甲醛同化途徑的原理示意在葉綠體中過量^ii^功能酶HPS/PHI，另卩么HPS/PHI就可利用開爾文循環(huán)的中 間產物Ru5P為固定甲醛的受體，催化以Ru5P和甲醛為^t/的縮合，產生6—磷酸己 酮糖(Hu6P)， HPS/PHI再催化Hu6P的異構化，生成6—磷酸果糖(Fructose 6-P，
F6P),其可作為開爾文循環(huán)的中間產物，重i iaA開爾文循環(huán)途徑。
圖2本發(fā)明中間載體pMD-hps/phi的構建策略圖； 圖3本發(fā)明中間載體pMIHips/phi的檢測A: hps/phi基因擴增產物的檢測。M:入DNA/歷72din， 1 3: hps/phi基因PCR 擴增產物；
B: pMEHips/phi質粒電泳檢測。1 4: pMD—hps/phi ， 5:正對照(pUC18) C: pMD~hps/Phi質粒的酶切檢測，M:入DNA/歷'/3din， 1 3: 5 力I+iZ7al酶切 pMD~hps/phi的產物；D: pMD~hps/phi的PCR檢測。M: ADNA/歷yxi111, 1 3: PCR擴增產物。 圖4本發(fā)明入門載體pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi的構建策略圖； 圖5本發(fā)明入門載體pENTI^-PrbcS-*T-hps/phi的檢測圖； A: pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi質粒電泳檢測。M:入DNA/歷7 d111， 1 2:
pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi ， 3:正對照(pUC-r-77zp^B);
B: pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi的酶切檢測。M:入DNA/歷/2din， 1 2: ^Z o1
酶切pENT砂-PrbcS-*T-hps/phi的產物,3:正對照(pUC-r-hps/phi)， 4:負對照
(pMEHips/phi);
C: pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi的PCR檢測，上游引物為5， PrbcS-2，下游引 物為3， ttz祖。M:D2000 DNA marker, 1 3: pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi的PCR擴增 產物，4:正對照(以pMHips/phi為模板的PCR擴增產物)。
圖6用Gateway的LR反應構建hps/phi基因的植物表達載體的策略圖7植物表達載體pK2-35S-PrbcS-求T-hps/phi的檢測A:重纟M粒pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi的電泳檢測。M:入DNA/歷/3dl11， 1 2: pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi質粒樣品，3:正對照(pK2GW7)， 4:負對照 (pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi);
B: PK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi的Wol酶切檢測。M: X DNA/歷'73din， l:pUC-r-^ra cAB (正對照)，2: pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi;
C: PK2-35S-PrbcS—*T—hps/phi的PCR檢測。M: XDNA/ffi/3din， 1 2:以 pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi重M粒為模板，上游弓嫩為5' PrbcS-2,下游引物 為3， r礎擴增得到的產物。3 4:以pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi重iSjf粒為模 板，上游弓嫩為5' 2tz M，下游引物為3' r/z cB擴增得到的產物。
圖8農桿菌轉化子菌落的PCR檢測上下游引物分別使用5， iTP/A和3， 2TZ祖。M'. Marker III， 1 2:菌落PCR樣品，3:正對照(模板為pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi質茅立)；
圖9基因組PCR檢測hps/phi在轉基因天竺葵中的插入瞎況示意圖； 擴增時上下游引物分別使用5， 2tz cA和3， 2tz沐。AB1、 AB2、 AB3、 AB4、 AB5、
AB6、 AB7、 AB8、 AB9、 AB10:轉基因天竺葵，WT:野生型天竺葵，+: pMEHhps/phi
作為模板。
圖10 western blot檢測HPS/PHI在轉基因天竺葵中的表達水平圖； A:用HPS蛋白抗體作的Western分析；
B:用PHI蛋白抗體作^J Western分析。WT:野生型天竺葵葉片總蛋白；AB5， AB7， AB8:轉基因株系天竺葵葉片總蛋白；control:表達重組HPS/PHI的大腸桿菌粗蛋 白。
圖ll轉基因天竺葵外液體甲醛抗性能力的檢測圖； WT:野生型天竺葵，AB5:轉hps/phi天竺葵株系。 圖12轉基因天竺葵對氣體甲醛抗性能力的檢測WT:野生型天竺葵，AB5:轉hps/phi天竺葵株系，AB8:轉hps/phi天竺葵株系。
圖13轉基因天竺葵吸收液體甲醛速率測定圖。
WT:野生型天竺葵，AB5:轉hps/phi天竺葵株系，AB7:轉hps/phi天竺葵株 系，AB8:轉hps/phi天竺葵株系。 ， 具體實駄式
下面結合附圖用本發(fā)明的實施例，一步說明本發(fā)明的實質性內容，但并不以 此限定本發(fā)明。
本發(fā)明下述實施例中所用到的試劑與儀器為試劑主要為^ 生物學實驗試 劑，其余試劑均為國產分析純。儀器均為分子生物學以及基因工程實驗室常用儀器。 本發(fā)明實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。載體pK2-35S-PrbcS-*T- hps/phi的構建(1) hps/phi基因的擴增及TA克隆 hps/phi基因的擴增及TA克隆的策略如圖2所示，以pET-23a-hps/phi質粒為 模板，設計hps/phi基因的特異性引物(上游引物 5， 2wA:CACCGCATGCAGCTCCAAGTCGCCATCG (&M)，下游引物3， rzz cB: TCTAGATCACTCGAGGTTGGCGTGGCGCG 進行擴增。用hps/phi基因上下游特異性引物5' 2tz A和3' 7t 沐作PCR，在PCR反應混合液中加入50ng的 pET-23a-hps/phi質粒作為模板，同時加入75ng的特異性弓嫩5， tt^和3' ttz cB、 4pl譜(2.5 mM) ，25^1的2XGC Bufferl和0. 25^il的LA taq(5U/nD聚合酶(Takara)，加雙蒸水使反應終體積為50|iil 。在PCR儀上于94°C加熱2射中，然后 按照94。C、 30秒，55°C、 30秒，72°C、 2 ^H中的禾Mj^進行30個循環(huán)的反應，最后 在72°C延長反應10辦中的，進行PCR反應擴增得到hps/phi基因。反應完成后， 通過瓊脂糖凝膠電泳分離hps/phi的PCR擴增產物(圖3A)。回收并純化hps/phi全 長基因(1. 2kb)，然后用寶生物(TaKaRa)的TA克隆試劑盒將其連接到pMD].8-T (大 連寶生物公司)載體上，實驗操作按試劑盒的說明書進行，反應過夜后用反應混合 液轉化大腸桿菌感受態(tài)DH5a (購自天根生化禾根公司)，采用堿裂解,取質粒 DNA，經1 %瓊1離凝膠電泳(圖3B)，選取大小和理論值相符的重組質粒pMHips/phi 4腿一步的PCR檢測，用hps/phi基因上下麟異性弓嫩5， 2tz^和3' T7z cB作PCR， 亞克隆成功的重M粒均能擴增出1. 2kb左右的hps/phi基因DNA片段(圖3D)。根 據陽性重M粒pMD~DAS載體兩端的多克隆位點，用^力I和X&I雙酶切重IW粒， 經1 %瓊3離凝膠電泳檢測酶切產物，連接成功的重纟艦粒pMHips/phi產生2條 帶， 一條為1.2kb左右的hps/phi基因DNA插入片段，另一條為2. 3kb的載體片斷 (圖3C)。再次確認題接成功的質粒后，重新轉化大腸桿菌DH5ct，挑單個菌落進 fr液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質粒pMD-hps/phi 。(2) 入門載體pENT砂-PrbcS-*T-hps/phi的構建pEOTR*-PrbcS-*T-hps/phi的構建策略如圖4所示，用^S / I (Takara)和化cRI (Takara)切開純化的質粒載體pENTR*-PrbcS-*T~GFP (見本發(fā)明人的另一發(fā)明專 利申請，申請?zhí)枮?00710066422. 9)和pMD-hps/phi，通過瓊脂糖凝膠電泳分離已 切開的載體和插入片段，從》 中回收PENTR*-PrbcS-*T~GFP被切割后產生的載體 片斷pENTR[PrbcS^T (4. 0kb)及pMD-hps/phi被切割產生的hps/phi基因的DNA 片斷(1.2 kb)，然后用寶生物(TaKaRa)的連接酶試劑盒連接pENTI^-PrbcS-*丁和 hps/phi基因的DNA片斷產生入門載體pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi 。用連接反應混 合物轉化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細胞(DH5a，天根生化科扮，把轉化好 的大腸桿菌涂于加有卡那霉素(Km， 50|ig/ml)的平板上，于37。C過夜培養(yǎng)，篩選Km 抗性重組子離，從Km抗性重組子離中提M粒(圖5A)，用屈ol (Takara) 進行酶切檢測，連接成功的質粒和對照質粒pUC-r-hps/phi及pMD-hps/phi在瓊月旨 糖凝膠電泳圖上產生一條l.lkb大小的條帶(圖5B)。選出連接成功的質粒載體 pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi作為模板，上游引物為5， PrbcS-2 (根據PrbcS光誘導 啟動子下游序列設計的上游引物，其序列為MGCCTTATCACTATATATACMG)，下游引 物為3' 2T^進行PCR檢測，獲得1. 4kb左右的產物，和IM照一致(圖5C)。再 次確認，接成功的質粒后，重新轉化大腸桿菌DH5a，挑單個菌落進行液體培養(yǎng)， 用試劑盒純化質粒pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi 。(3) hps/phi基因植物表達載體pK2-35S-PrbcS-*T- hps/phi的構建 hps/phi基因植物^ii載體的構建策略如圖6所示，通過Gateway技術的LR反應把PrbcS-*T-hps/phi亞克隆到植物表達載體pK2GW7 (Gateway的目的載體，購 自比利時VIB/Gent公司)中。具體的做法是用質粒抽提試劑盒純化Gateway的 目的載體pK2GW7，在Gateway的LR反應體系中加pENTR*-PrbcS_*T-hps/phi和pK2GW7各150ng， l|til LR Clonase II Enzyme Mix (Invitrogen)，混均于25 °C反12應過夜，通過齡酶的作用把PrbcS-*T-hps/phi整合到pK2GW7中獲得hps/phi的 植物表達載體質粒pK2-35S-PrbcS-W-hps/phi 。用反應混合物轉化高效率(108) 的大腸桿菌感受態(tài)細胞加5a，天根生化禾根)，把轉化好的大腸桿菌涂于加有壯 觀霉素(Spe， 50pg/ml)的平板上，于37。C過夜i咅養(yǎng)，篩選Spe抗性重組子菌落， 從Spe抗性重組子菌落中提取質粒(圖7A)?；痮1單酶切pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi 質粒和對照質粒pUC-r-hps/phi， 二者均出現一條1. lkb左右大小的條帶(圖7B)。 以pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi為模板，下游引物為3'頂」cB，上游引物分別為 5， 2T7^和5' PrbcS-2進行PCR擴增，hps/phi基因上下游引物擴增的片段大小為 1.2kb，上游用5， PrbcS-2引物擴增產物約為1. 4kb (圖7C)。確認是連接成功的 質粒后，重新轉化大腸桿菌DH5 a ,挑單個菌落進行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質粒。 實施例2:用含有hps/phi基因的植物^&載,tt^桿菌 制備農桿菌的感受態(tài)細胞，用電脈沖法將上述構建好的植物表達載體PK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi轉入農桿菌(C58C1 (pPMP90))中，在加有壯觀霉素的 平板上篩選轉化子。取少量質粒加入農桿菌感受態(tài)細胞中，輕輕混勻；將混合物加 入到預冷的電轉化杯中，輕輕敲擊杯身使混和液落至杯底；將電轉化杯置于電轉化 儀(BIO-RAD)滑槽中，用l咖的電擊杯和200歐姆，2. 5kV/0. 2cm的參lfcS行電擊， 電擊后立即取出電轉化杯,M加入O. 5mlS0C培養(yǎng)基，混勻，轉移到1. 5ml的離心 管中；28°C， 200rpm搖床培養(yǎng)3—5h;室溫下，7500rpm離心lmin，棄大部分上清， 保留lOOjil將細胞懸浮；把農桿菌涂布于有壯觀霉素(Spe， 50pg/ml)的LB固體培 養(yǎng)基上，28"培養(yǎng)2天獲得單 :;首先用牙鄉(xiāng)fe取農桿菌m^^入20pl ddaO 中，98。C處理15射中后取出10jxl農桿菌裂解液作為PCR反應的模板。用上下游引 物5' 和3' 一作PCR檢測，轉化成功的菌落均能擴增出1.2kb的hps/phi 基因條帶(圖8 )，經菌落PCR確認,化子菌落用于轉化植物。實施例3:用含有hps/phi基因植物表M體的農桿菌轉化植物挑取攜帶有質粒pK2-35S-PrbcS-氺T-hps/phi的農桿菌單菌落接種于50ml的LB培養(yǎng)基中(含Spe， 100pg/ml), 180rpm， 28。C培養(yǎng)24h，待菌液ODeoo至1.0左右，離心10min(3000rpm)，沉淀菌體。再用10ml左右的MS液體培養(yǎng)基懸浮，離心10min(3000rpm)，沉淀菌體。重復以上操作2 3次。最后加入一定體積的MS液體培養(yǎng)基重懸浮，使菌體的ODeoo值為0.5。制備天竺葵(尸e7az^ m'鵬sp.frensham)的無菌
苗，通過農桿菌介導，用葉盤法轉化天竺葵，然后m組織培養(yǎng)獲得小苗，進一步
篩選獲得所需的轉基因植物。具體步驟如下，把無菌天竺葵的葉柄切成小段，在制備好的農桿菌菌液中浸染15—20min，用無菌吸7條吸干后，平鋪于愈傷組織誘導培養(yǎng)基MS1 (MS+NM02. l|ag/ml+BAP 0.02|ig/ml)上黑暗共培養(yǎng)2天，將外植,移至含卡那霉素(50pg/ml)的芽誘導培養(yǎng)基MS4 (MS+NM0. 53pg/ml+BAP0. 5pg/ml)上進行芽的誘導，約15天繼代一次。待有芽生鵬，轉入含卡那霉素(50]ag/ml)的MS培養(yǎng)基上進行根的誘導，獲得轉入hps/phi基因的植株。實施例4: hps/phi基因在轉基因植物中的插入情況
為了確認通過卡那霉素篩選的轉基因天竺葵株系確實含有導入的目的基因的DNA片段，用PCR方法對篩選到的轉基因植物作進一步的鑒定。首先采用CTAM娥取植物基因組稱取植物葉片100rag左右置于1.5ml離心管中，加液氮用特審,棒研磨至粉末狀；加入900nl預熱到65。C的2XCTAB緩沖液(Tris-HC1 pH 7.5 100mM，EDTA 20慮,NaCl 1.4 M， CTAB 2%), 65。C度水浴加熱20 ，后取出冷卻；加入500nl氯仿一異戊醇混合液(24: 1)搖勻，4。C離心10min (7500rpm)后轉移上清至1. 5ml EP管；再次加入50(^1氯仿—異戊醇混合液(24: 1)搖勻，4t:離心10min(7500rpm);取出上清置于新的EP管中，加入1/10體積3M pH5. 2醋,和等體積異丙醇，搖勻后4。C離心20min (12000rpm);棄上清，用75%乙醇清洗兩次后，千燥，用含RNase的TE緩沖液溶解并,RNA。以植物基因組DNA為模板，用hps/phi基因上下游特異性引物作PCR檢測，成功轉入hps/phi基因的植株均能擴增出1. 2kb的hps/phi條帶(圖9)。經PCR確認的轉基因植株用于western-blot分析。實施例5: hps/phi在轉基因天竺葵中^K平檢測
采用western-blot方法檢測hps/phi在轉基因天竺葵中,水平。首先使用Plant Total Protein Extraction kit (Sigma, USA)從天竺葵葉片中抽提可溶性總蛋白，操作步驟參照說明書。再用Bradford方法測定樣品中的蛋白質濃度后，每個樣品取15 u g總蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳，電泳完畢后半干轉膜至PVDF-P膜(GE, USA)。 一抗分別為甲基營養(yǎng)菌必ro力scf er/譜卵sz^' MB19 HPS和PHI的兔抗體，二抗為辣根過氧化酶標記的猴抗兔IgG (GE，USA)。轉基因天竺葵樣品和正對照樣品中都有一條41kD左右目標蛋白帶，而在野生型樣品沒有出現(圖IO)，說明A^/ph'基因編碼的蛋白已在轉基因植物中成功地表達。
實施例6:轉hps/phi基因植物對甲醛的抗性檢測
為了檢測hps/phi在轉基因植物中是否發(fā)揮預期作用，將AB5株系轉基因植物小苗和未轉基因植物的野生型小苗移入加有甲醛(濃度為7mM)的MS固體培養(yǎng)基上，在25'C持續(xù)光照培養(yǎng)，15天后觀察植物表型變化(圖11)。結果說明同時轉入hps/phi的植物比野生型長勢好，，說明引入的甲醛同皿徑能夠在植物中發(fā)揮預期作用，增強植物對甲醛的同化能力，使轉基因植物對于培養(yǎng)基中液體甲醛的抗性增強。
為了g轉基因植物對氣體甲醛的抗性，將AB5和AB8株系轉基因植物幼苗移入有MS培養(yǎng)基的密封容器中培養(yǎng)，約15天生te在容器中自一個開口的500 ul離心管，并在離心管中加入一定量(30ul ) 37%的甲醛溶液。25"C光照培養(yǎng)15天后，觀察轉基因植物的生長狀況，轉基因天竺葵生長狀況明顯優(yōu)于野生型天竺葵(圖12)，說明轉hps/phi基因可提高天竺葵對氣體甲醛的抗性。
實施例7:轉基因^葵自體甲醛吸iltoi率的^i
甲醛可與Nash試劑(醋酸氨15%，冰醋酸0.3%,乙酰丙酮0.2%)發(fā)生化學反應產生有顏色的物質，該物質的最大吸收波長為410nm，因此可以制備甲醛的標準曲線，根據HCHO的標準曲線即可計算出反應液中甲醛的含量，利用該方法可以測定植物對甲醛的吸收速率。取2g左右植物葉片材料放入小三角瓶中，加入150ml甲醛(4mM)溶液處理一定時間后，取出40ul處理液，加水至500ul，再加入500"1 Nash試劑在3(TC保溫30辦中后，測定OD仙，根據標準曲線計算出處理液殘存甲醛濃度(圖13)。處理70小時后，轉基因天竺葵株系AB5、 AB8已經將處理液中所有甲醛吸收完畢，轉基因株系旭7處理液中殘留約7%甲醛，而野生型甲醛殘留高達33%。三個轉基因天竺葵株系在90小時后已經將處理液中所有甲醛吸收完畢，而野生型天竺葵處理液中仍然殘留約17%甲醛。因此轉hps/phi天竺葵吸收甲醛的速率明顯高于野生型植株，能在較短的時間內將處理液中的外源甲醛吸收完畢。
與現有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)越性在于本發(fā)明克服了天然植物代謝甲醛能力和速度非常有限的缺陷，禾,基因工程技術在觀賞植物葉片細胞的葉綠體中過量表達hps/phi基因，從而構建一條有效代謝甲醛的同，徑(圖l)，利用植物的光合作用同化甲醛，達到了提高植物吸收和耐受甲醛的能力，創(chuàng)造有凈化室內甲醛污染的特殊觀賞植物，維護人體的健康的目的。
本發(fā)明利用光誘導型啟動子(PrbcS)和葉綠體基質定位序列(*T)構建hps/phi基因的植物,載體，以便在轉基因植物葉片的葉綠體基質中過量表達6-磷酸己酮糖合成酶/6-磷,糖異構酶的融合蛋白HPS/PHI， M該融合蛋白在轉基因觀賞植物的葉綠體中構建甲醛的光合作用同化途徑，增強植物同化甲醛的效率，進而提高了植物吸收和耐鈔卜源甲醛的能力。
權利要求
1、植物表達載體pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi，為含有番茄1，5二磷酸核酮糖羧化酶Rubisco 3C小亞基基因的光誘導型啟動子PrbcS及其轉移肽序列和甲基營養(yǎng)菌Mycobacterium gastri MB19的6-磷酸己酮糖合成酶和6-磷酸果糖異構酶融合而成的雙功能酶HPS/PHI基因的植物表達載體。
2、 如權禾腰求1所述的植物魏載體，其hps/phi基因的GenBank登錄號為 AB292776。
3、 如權利要求1戶腿的植物魏載體，其起始載體為pK2GW7。
4、 如權利要求1所述的植物表達載體，所述的hps/phi基因上游添加有從番茄基因組中分離出來的光誘導型啟動子PrbcS和葉綠體基質定位序列。
5、 權利要求l的植物表達載體pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi，由下述方法構 建而成(1) hps/phi基因的擴增以hps/phi的原核，載體pET-23a-hps/phi質粒為模板，用hps/phi 基因的特異性引物，上游引物5' 2wA:CACCGCATGCAGCTCCMGTCGCCATCG(城)，下 游引物3， 7tz沐TCTAGATCACTCGAGGTTGGCGTGGCGCG 進行擴增，得PCR產物；(2) hps/phi基因的TA克隆回收并純化hps/phi基因片段，并將其連接到pMD18-T載體上，采用堿 自 取質粒DNA，通過PCR檢測和酶切檢測獲得重,粒pMD~hps/phi;(3) 入門載體pENT扭-PrbcS-*T-hps/phi的構建用S/ 力I和fcoRI切割pENTR*-PrbcS-*T~GFP和pMCHips/phi ，回收載體 pENTR*-PrbcS-*T片斷和hps/phi基因片斷，用連接酶連接PENTR*_PrbcS-*T和 hps/phi基因片斷，獲得入門載體pENT腫-PrbcS-*T-hps/phi;(4) hps/phi基因植物表達載體pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi的構建通過Gateway技術的LR反應把PrbcS-*T-hps/phi片段亞克隆至訴直物表 達載體pK2GW7中，獲得hps/phi基因的植物表達載體pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi。
6、 植物表達載體pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi的構建方法，包括下述步驟(1) hps/phi基因的擴增以hps/phi的原核表達載體pET-23a-hps/phi質粒為模板，用hps/phi基因的 特異性引物，上游引物5' 7TgM:CACCGCATGCAGCTCCMGTCGCCATCG (柳)，下游引 物3， T7z cB: TCTAGATCACTCGAGGTTGGCGTGGCGCG (iZ近I))進行擴增，得PCR產物；(2) hps/phi基因的TA克隆回收并純化hps/phi基因片段，并將其連接到pMD18-T載體上，采用堿裂解法 提取質粒DNA，通過PCR檢測和酶切檢測獲得重鄉(xiāng)艦粒pMD~hps/phi;(3) 入門載體pENTI^-PrbcS-W-hps/phi的構建用5 M和fcoRI切割pENTR*-PrbcS-*T~GFP和pMD~hps/phi ，回收載體 pENTR*-PrbcS-*T片斷和hps/phi基因片斷，用連接酶連接PENTR*-PrbcS-*T和 hps/phi基因片斷，獲得入門載體pENTR*-PrbcS-*T-hps/phi;(4) hps/phi基因植物表達載體pK2-35S-PrbcS-氺T-hps/phi的構建通過Gateway技術的LR反應把PrbcS-*T-hps/phi片段亞克隆到植物表達載體 pK2GW7中，獲得hps/phi基因的植物表達載體pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi。
7、 權利要求1^5植物表達載體pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi在制皿高植物 吸收和耐受外源甲醛能力的轉基因植株中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高植物同化和吸收甲醛代謝能力的植物表達載體pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi，為含有番茄1，5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)3C小亞基基因的光誘導型啟動子(PrbcS)及其轉移肽序列和甲基營養(yǎng)菌Mycobacteriumgastri MB19的6-磷酸己酮糖合成酶和6-磷酸果糖異構酶融合而成的雙功能酶HPS/PHI基因的植物表達載體。以HPS/PHI的原核表達載體pET-23a-hps/phi質粒為模板擴增得到hps/phi基因，用光誘導型啟動子和葉綠體轉移肽控制其在植物葉片葉綠體中的表達，提高植物同化和吸收甲醛能力。實驗表明在外源高濃度的氣體和液體甲醛環(huán)境中生長時，轉基因植物的生長狀態(tài)好于野生型，葉片萎黃現象較輕。在4mM甲醛處理液中，轉基因植物葉片能夠在90小時內完清除處理液中的甲醛，但野生型葉片吸收效率較慢，仍有17％甲醛殘留。
文檔編號C12N15/82GK101629185SQ20091009483
公開日2010年1月20日 申請日期2009年8月13日 優(yōu)先權日2009年8月13日
發(fā)明者宋中邦, 李昆志, 飛 殷, 胡清泉, 陳麗梅, 陳紅梅, 莉 馬 申請人:昆明理工大學