專利名稱:一種乙烯不敏感的植物表達(dá)載體pBinETR1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。構(gòu)建了ETR1基因797bp的cDNA片段的反義植物表達(dá)載體pBinETR1,包括ETR1第一、二疏水區(qū)。用含有該表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化矮牽牛,轉(zhuǎn)基因植株對乙烯不敏感。該項(xiàng)技術(shù)在改造觀賞植物品質(zhì)中具有非常重要的實(shí)用價值。
二是乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,既通過改變植物對乙烯的敏感性來延緩衰老。目前已經(jīng)從擬南芥中分離出5個乙烯受體基因,分為兩個基因家族,分別是ETR1家族的ETR1、ERS1及ETR2家族的ETR2、EIN4和ERS2。其中研究比較透徹的是ETR1,它是乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中首先響應(yīng)乙烯的基因,已經(jīng)從許多植物中得到克隆。
通過轉(zhuǎn)入ETR1基因改變乙烯敏感性已經(jīng)在番茄、香石竹、矮牽牛等植物中獲得成功。如Wilkinson等(1997)構(gòu)建了雙元載體質(zhì)粒pMON11063和pMON26601。前者包括擬南芥etr1-1(編碼一個顯性乙烯敏感性的突變受體)cDNA、CaMV 35S啟動子和一個豌豆rbcs-E9基因3’末端上游序列;后者包括etr1-1/NR基因嵌和體cDNA、FMV 35S啟動子和一個胭脂堿合成酶基因的3’末端。構(gòu)建好的雙元載體從大腸桿菌轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌ABI構(gòu)建Ti質(zhì)粒。轉(zhuǎn)基因番茄的果實(shí)成熟期大大滯后,矮牽牛花朵衰老和脫落也延遲。外源etr1-1基因在非同源植物中功能的表達(dá),顯示出乙烯識別和響應(yīng)途徑在植物體內(nèi)是高度保守的。
利用基因工程改變花卉的乙烯敏感性,可以延長花期和切花的瓶插壽命。Clark等(1999)將帶有CaMV 35S啟動子的擬南芥突變體等位基因etr1-1轉(zhuǎn)入矮牽牛中,轉(zhuǎn)基因植株花朵衰老都有不同程度的延遲,但自花授粉后轉(zhuǎn)基因植株的座果率與對照相比降低,果實(shí)成熟推后,不定根的發(fā)生率也大大減少。這表明想要獲得花朵壽命延長的轉(zhuǎn)基因矮牽牛,還需要乙烯不敏感性的組織特異性。Bovy等(1999)構(gòu)建了擬南芥etr1-1等位基因的雙元植物表達(dá)載體,所用的啟動子分別為etr1-1基因本身帶有的2.7kb的組成型啟動子、矮牽?;ㄌ禺悊幼覨BP1以及組成型強(qiáng)啟動子CaMV 35S,雙元載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌AGLO構(gòu)建Ti質(zhì)粒。根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化香石竹后,轉(zhuǎn)基因植株瓶插壽命都得到延長。
目前乙烯受體基因轉(zhuǎn)化植物的研究,主要是用擬南芥etr1-1突變體的全長基因轉(zhuǎn)化植物,未見對從其它植物中克隆出來的乙烯受體基因或基因片段的功能進(jìn)行研究,并成功轉(zhuǎn)化異源植物的報道。ETR1的疏水區(qū)是乙烯結(jié)合區(qū)域,主要影響植物對外源ETR1基因的響應(yīng)。月季ETR1 cDNA片段正好包括了該疏水區(qū)。因此該基因片段轉(zhuǎn)化植物后,會對轉(zhuǎn)基因植株的乙烯敏感性、衰老及瓶插壽命等產(chǎn)生重要影響。
結(jié)果表明,用月季ETR1基因的797bp的cDNA片段構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化矮牽牛產(chǎn)生的意想不到的效果,得到了乙烯敏感性降低的轉(zhuǎn)基因植株,這說明反義ETR1基因片段的轉(zhuǎn)化,可以抑制內(nèi)源ETR1的作用,降低植物的乙烯敏感性,從而延長花朵的壽命。所以,本發(fā)明乙烯不敏感的植物表達(dá)載體在改造植物品質(zhì),尤其延長花卉植物花期的植物基因工程中的應(yīng)用有十分重要的意義。
實(shí)施例2(轉(zhuǎn)化)雙元表達(dá)載體電激轉(zhuǎn)化利福平和卡那霉素抗性的根癌農(nóng)桿菌LBA4404,然后轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂抹在加入利福平和卡那霉素的YEP平板培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)3天后,會長出單菌落,然后挑取部分單菌落進(jìn)行菌落PCR,可以得到800bp左右的條帶。PCR陽性的單菌落重新劃到Y(jié)EP平板培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)至長出菌落。挑取長出的單菌落接種到加入利福平和卡那霉素的YEP液體培養(yǎng)基上,于250rpm搖床上28℃搖菌過夜。次日,將農(nóng)桿菌培養(yǎng)液用共培養(yǎng)培養(yǎng)基MS+BA1.0mg/L+NAA0.01mg/L稀釋30-50倍。以無菌培養(yǎng)的矮牽牛組培苗葉片為外植體。將幼嫩葉片切去邊緣,并用刀片在葉片表面劃一些傷口,放入共培養(yǎng)培養(yǎng)基中,侵染5分鐘。取出葉片,用無菌濾紙吸干剩余的菌液,放入不含抗生素的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA1.0mg/L+NAA0.01mg/L+Kan100mg/L+Cab 200mg/L+瓊脂7g/L的平板上,使葉片邊緣切口與培養(yǎng)基充分接觸,然后用Parafilm膜封口,25℃光培養(yǎng)3天。
當(dāng)葉片邊緣出現(xiàn)白色的菌落時,可將共培養(yǎng)的外植體取出,用無菌水沖洗3次,洗掉殘余的根癌農(nóng)桿菌,無菌濾紙吸干,轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基上,25℃光照培養(yǎng)。外植體在選擇培養(yǎng)基上1周-2周后可見愈傷組織發(fā)生,2周-4周后愈傷組織上可再生抗性小芽體。每3周在選擇培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)一次。將叢生芽分株后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+Kan100mg/L+Cab 200mg/L+瓊脂7g/L誘導(dǎo)生根。轉(zhuǎn)化再生苗如圖2所示。
實(shí)施例3(PCR檢測)當(dāng)再生芽長至3-4cm高時進(jìn)行DNA的PCR檢測,陽性株系進(jìn)行擴(kuò)繁。矮牽牛的提取采用CTAB法,取矮牽牛葉片約50mg,在200μL CTAB提取液中研磨,再加入300μL提取液,輕輕打勻后,65℃水浴30min,然后加入500μL 4℃預(yù)冷的氯仿,輕微打勻并振蕩。10000rpm離心5min,吸取上清至另一離心管中,加入等體積4℃預(yù)冷的異丙醇,輕微顛倒直至DNA沉淀。10000rpm離心5min,棄上清,加入4℃預(yù)冷的70%乙醇,用槍頭輕輕打散沉淀。10000rpm離心5min,棄上清。待管內(nèi)液體徹底干燥后,用20-50μL ddH2O溶解DNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>
提取的DNA用ddH2O稀釋10倍,取0.5μL(約25ng)作為PCR反應(yīng)的模板。以擴(kuò)增NPTII基因的一對引物和擴(kuò)增ETR1 cDNA片段的一對反向引物分別進(jìn)行PCR反應(yīng),PCR反應(yīng)體積均為10μL,同時設(shè)水對照、陽性對照和野生型對照各一個。NPTII基因PCR的反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4min;94℃變性50s,60℃退火50s,72℃延伸1min,共28個循環(huán);72℃延伸10min。ETR1 cDNA片段PCR的反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4min;94℃變性1min,53℃退火1min30s,72℃延伸1min,共30個循環(huán);72℃延伸10min。PCR反應(yīng)完成后,取8μL產(chǎn)物在1%瓊脂糖膠上電泳檢測。陽性轉(zhuǎn)基因植株以NPTII引物擴(kuò)增的產(chǎn)物有850bp的條帶,以ETR1引物擴(kuò)增的產(chǎn)物有800bp的條帶,野生型沒有條帶。
實(shí)施例4(RT-PCR檢測)對總DNA的PCR結(jié)果為陽性的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行總RNA的RT-PCR的檢測。首先提取植物組織的RNA。吸取15mL抽提緩沖液于50mL離心管中,65℃水浴加熱。研缽及杵用液氮預(yù)冷。稱取轉(zhuǎn)基因矮牽牛葉片1g,加液氮充分研磨后,轉(zhuǎn)入上述65℃預(yù)熱的離心管中,充分混勻。加入14.4mL氯仿和0.6mL異戊醇,混勻。室溫離心5min,分相。吸上清于另一50mL離心管,再加入12mL氯仿和0.5mL異戊醇,混勻。吸上清于另一50mL離心管中,加入1/4體積的10mmol/l LiCl,顛倒混勻,4℃沉淀過夜。
次日將沉淀過夜的混合液于10000rpm離心20min,棄上清,收集沉淀的RNA。將沉淀溶于300μL的SSTE中,轉(zhuǎn)入1.5mL離心管;再用200μLSSTE洗管壁,轉(zhuǎn)入同一離心管。分別加入480μL氯仿和20μL異戊醇,混勻,抽提。10000rpm離心5min,分相。吸取上清于另一1.5mL離心管中,加入2倍體積的無水乙醇,混勻,于-70℃沉淀RNA 30min以上或-20℃放置2h。10000離心20min,沉淀RNA,棄上清;70%乙醇洗2次,干燥后溶于40μL兩次滅菌的ddH2O中。取2μL總RNA,加入1000μL兩次滅菌的ddH2O中,混勻。測定230nm、260nm、280nm的光密度值。計算A260nm/A280nm,A260nm/A230nm的比值,并通過1%瓊脂糖凝膠電泳,檢測提取的RNA質(zhì)量。
檢測后的RNA進(jìn)行總RNA的DNAase處理。分別加入RNA 20μL、Rnasin 1μL、10×buffer 5μL、ddH2O 2μL、DNase 2μL,反應(yīng)總體積為30μL,混勻后于37℃保持30min。加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提,離心5min,取上清。加入1/10體積的3mol/L NaAc和2倍體積的無水乙醇,置于-70℃2h沉淀RNA。12000rpm離心10min,棄上清。用70%乙醇洗沉淀2次,溶于20μL兩次滅菌的ddH2O中。
處理后的RNA在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測后,即可進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取RNA5μL,分別加入Oligo dT(0.5mol/L)1μL和ddH2O 6μL,70℃放置10min,快速置于冰上冷卻2min,離心。再分別加入5×First Strand buffer 4μL、DTT(0.1mol/L)2μL和dNTP(10mmol/L)1μL,混勻后置于42℃放置2min。加入1μL Superscript II反轉(zhuǎn)錄酶,混勻后離心,42℃保持50min,70℃保持15min以終止反應(yīng)。
以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的第一鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),同時以反轉(zhuǎn)錄所用總RNA模板作對照。反應(yīng)體系50μL,其中包括10×PCR buffer 5μL、MgCl23μL、dNTP(2.5mmol/L)4μL、引物12.5μL、引物22.5μL、模板DNA 2μL、Taq酶(5Units/μL)0.5μL、去離子水30.5μL。反應(yīng)條件同實(shí)施例3。反應(yīng)結(jié)束后在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。轉(zhuǎn)基因植株可以得到800bp的條帶,野生型沒有條帶。這說明月季ETR1 cDNA可以在矮牽牛體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。
實(shí)施例5(乙烯敏感性檢測)對RT-PCR陽性的轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株進(jìn)行乙烯敏感性的試驗(yàn)。將純乙烯(106ppm)稀釋到濃度為103。矮牽牛組培所使用的容器容積為100mL,因此,本發(fā)明三個濃度處理10ppm、20ppm和30ppm分別取103濃度的乙烯1mL、2mL和3mL,并且注射到野生型及轉(zhuǎn)基因矮牽牛組培容器中。乙烯處理24h后將封口膜打開(注意勿造成組培苗污染),釋放瓶內(nèi)乙烯,6h后,用封口膜重新將瓶口封好,培養(yǎng)2天后觀察結(jié)果。結(jié)果表明,如圖3所示,乙烯處理后,野生型植株出現(xiàn)不同程度的萎蔫,轉(zhuǎn)基因植株與處理前沒有表型差異。這說明轉(zhuǎn)基因植株對外源乙烯不敏感,本發(fā)明轉(zhuǎn)入的月季ETR1 cDNA已經(jīng)在矮牽牛轉(zhuǎn)基因植株中具備了耐乙烯敏感性的生物學(xué)功能。
權(quán)利要求
1.一種耐乙烯敏感性的植物表達(dá)載體pBinETR1,其結(jié)構(gòu)如下所示
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體,在轉(zhuǎn)基因植物工程中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體,在抗衰老轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體,在花卉植物延長花期轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體地說,構(gòu)建了一種乙烯不敏感的植物表達(dá)載體pBinETR1,含有該表達(dá)載體pBinETR1的轉(zhuǎn)基因植物具有抗衰老的功能,在轉(zhuǎn)基因花卉植物中應(yīng)用,可以延長植株開花和插花的花期。
文檔編號C12N15/63GK1470636SQ0212683
公開日2004年1月28日 申請日期2002年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月22日
發(fā)明者劉青林, 白雙義, 馬祎 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院